专利名称：一种定性检测hla-b*1502基因亚型的荧光pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中区分HLA-B基因中的1502基因亚型的荧光聚合酶链式反应(PCR)试剂盒。
背景技术：
HLA(human leukocyte ant igen,人类白细胞抗原)系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的ー个重要新兴研究領域。HLA是具有高度多态性的同种异体抗原，其化学本质为ー类糖蛋白。HLA按其分布和功能分为I类抗原和II类抗原。HLA I类抗原，由HLA-A、B、C位点编码；HLAII类抗原受控于HLA-D区(包含5个亚区)。以上各基因(名称为WHO命名委员会1975年修订)均系多态性位点(复等位)，且共显性。如果把MHC作为ー个整体来看待，其多态性则更为突出。保守地估计，至少存在1300个不同的单体型，相应地约有17X107个基因型。这就是除同卵双生子以外几乎无HLA相同者的遗传基础，从而HLA可视作个体的“身份证”。近年的研究表明，HLA-B的基因多态可能与癫痫患者服用芳香族抗癫痫药物后发生的严重不良反应相关。在众多HLA-B等位基因与SJS/TEN关联性的研究中，HLA_B*1502基因型是关注的热点之一。Locharernkul C等在泰国人群中对10例服用芳香族抗癫痫药物发生严重不良反应和50例健康对照组进行HLA2B等位基因分型发现，HLA-B等位基因HLA-B^l502与芳香族抗癫痫药物所致的严重不良反应相关，此结果与Chung WH、Hung SI、Man CB等在香港、台湾的人群的研究结果一致,而Lonjou C等对高加索人群的研究未能得出上述结论。因此，HLA-B*1502多态与芳香族药物所致严重不良反应是否相关，以及能否作为芳香族抗癫痫药物不良反应易感性标志，成为抗癫痫药物安全用药领域的热点问题。现在社会对于药物不良反应的重视程度越来越高，所以检测1502基因亚型成了卡马西平用药指导也有了一定的趋势。针对HLA主要是借助血清学、细胞学或分子生物学方法检测个体的HLA抗原特异性或HLA基因型。目前常规采用血清学方法进行HLA-B的分型，但由于高质量的抗血清难于获得及抗血清之间存在较多的交叉反应，导致血清学分型结果错误和空白较多。PCR序列特异寡核苷酸探针(sequence specific oligonucleotide probe, SS0P)是近年发展起来的一种较有希望的HLA-DNA分型方法，但该方法操作较烦琐，而且耗时长，这些缺陷在大批量样品的检测上尤其突出。由于我们主要针对的是单独的1502基因亚型的分型，所以需要找到ー个相对准确、快速、简单的方法。荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一 3’酶切活性所降解，探针的5’端有ー荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探測器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯_6_羧基突光素)，JOE (2, 7- ニ甲基-4, 5- ニ氯-6-羧基突光素)，HEX (六氯-6-甲基突光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL (4-(4恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。目前市场上还没有利用荧光PCR技术进行HLA-B基因分型的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、成本低并且能够作分型检测的定性检测 HLA-B^l502基因亚型的荧光PCR试剂盒。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案ー种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ ID NO :3_4和/ 或 SEQ ID NO :6-7 所示。进ー步地，所述荧光探针序列如SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 8所示。进ー步地，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。进ー步地，所述阳性对照品为插入有如SEQ ID NO :1和/或SEQ IDNO :2，所述的核苷酸序列的重组质粒。进ー步地，所述质粒为HLA_B*1502质粒。进ー步地，所述的阳性对照品的浓度为1.0父106-9.0父106拷贝/微升。进ー步地，所述的阳性对照品的浓度为5. OX IOltl拷贝/微升。进ー步地，所述阴性对照品为人的基因组DNA。进ー步地,所述突光探针为Taqman探针,标记探针5’端的突光报告基团为FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、CY5中的ー种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ 中的ー种。本发明的优点及有益效果I)本发明提供的定性检测HLA_B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒定性准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险；2)本发明提供的定性检测HLA_B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；3)本发明提供的定性检测HLA_B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒检测速度快；4)本发明提供的定性检测HLA_B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒步骤简单；5)本发明提供的定性检测HLA_B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒可同时进行高通量的样本检測。荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间短，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检測。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I为临床样本的检测结果分布图；图2为临床纯合子的扩增曲线；图3为临床杂合子的扩增曲线； 图4为阴性对照的扩增曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进ー步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :试剂盒的制备I.引物和探针的设计与合成使用Primer Express 2· 0，针对HLA_B*1502的2号外显子和3号外显子以及中间的内含子区域，研究表明目前针对HLA-B基因分型主要集中在这个区域(Hughes AL7NeiM.Pattern of nucleotide suostitution at MHC class I loci reveals overdominantselection. Nature，1988，335(6186) :167-170 ;Hughes AL, Yeager M. Natural selectionat major histo-compatibility complex loci of vertebrates. Annu Rev Genet，1998，32 :415-435 ；Gao X，Nelson GW, Karacki P，Martin MP, Phair J，Kaslow R，Goedert JJ,Buchbinder S，Hoots K，Vlahov D，Or Brien SJ, Carrington M. Effect of a singleamino acid change in MHC class I molecules on the rate of progres—sion to AIDS. NEngl J Med，2001，344(22) :1668-1675 ;徐筠娉，邓志辉，邹红岩等，中国汉族个体HLA_A、_B基因全长序列的测定及调控区多态性。遗传HEREDITAS(Beijing)，2010年7月，32(7)685-693)，筛选特异的突变位点，在选择好的突变位点上进行荧光探针的筛选，在设计好荧光探针基础上设计相应的上下游引物。引物与荧光探针均委托专业公司合成，其中引物为PAGE纯化，荧光探针为HPLC纯化，标记探针5’端的荧光报告基团为FAM、TET、J0E、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的ー种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ中的ー种。优选地，荧光探针分别在5’端标记FAM荧光基团和VIC荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。扩增序列如表I :表I.特异性荧光探针与引物序列
权利要求
1.一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ IDNO :3-4 和 / 或 SEQ ID NO :6_7 所示。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列如SEQID N0:5和/或 SEQ ID NO 8 所示。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为插入有如SEQIDNO :1和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为HLA-B*1502质粒。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的浓度为1·0Χ106-9·0Χ106 拷贝 / 微升。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的浓度为5.OX 101°拷贝/微升。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为人的基因组DNA。
9.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的一种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。
全文摘要
本发明提供一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ IDNO3-4和/或SEQ ID NO6-7所示。本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间短，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测。
文档编号G01N21/64GK102660635SQ201210010718
公开日2012年9月12日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者张璇 申请人:长沙三济生物科技有限公司