专利名称：牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有ZBED6基因的质粒型腺病毒载体，该质粒型腺病毒载体腺病毒载体的构建以及在改造种子细胞和牛ZBED6功能鉴定的应用。
背景技术：
AdEasyTM系统是由T. C. He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是1)腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2)基因组过大(36kb),难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大 肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-Ι进行同源重组。pAdEasy-Ι缺失了 El和E3区，其El区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(ITR，IavertedTermined Repeats),转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此该同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无reCA、endA活性的细菌株如DH5a等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5 a不能用于腺病毒的同源重组。与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需I 3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5 α中扩增后转入哺乳动物细胞293Α，最后将293Α细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供El区功能的293Α细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需I小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要分为C2H:型、C。型和C6型。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达。
锌指蛋白ZBED基因家族共发现有5个成员；其功能如下ZBED1基因参与调节一些能够促进细胞的增殖的基因；ZBED2基因参与胚胎发育；ZBED3基因参与正调控Wnt/β-catenin信号通路。ZBED4基因作用于视网膜的形成。ZBED5基因与乳腺癌有关。ZBED6基因主要影响着发育、细胞增殖和肌肉生长。ZBED6基因是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。实时定量PCR分析显示，小鼠ZBED6的mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。ZBED6蛋白含有2个BED结构域和I个hATC 二聚结构域；第61 80位和第231 248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号(富Lys-Arg区段)。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中(包括家猪)显示出100%相似性。Markljung等(2009)用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的ZBED6基因沉默后的实验结果表明，ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于胰岛素样生长因子2(insULin-likegrowth factor 2, IGF2)基因第 3 内含子中的 QTN(Quantitative traitnucleotide)位点结合来抑制IGF2基因的表达。当ZBED6基因沉默后，IGF2基因的表达量升高、细胞增殖(肌管形成)加快、创伤愈合加快。Markljung等(2009)采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析，研究ZBED6蛋白作用靶点(IGF2基因及其下游基因)，在IGF2基因内含子中的QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点。家猪IGF2基因第三内含子单碱基G — A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达(表达量是正常情况的3倍)，这一突变主要影响肌肉生长(提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了39Γ4%)、心脏增大和脂肪沉积。GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH(basic helix -loop-helix)家族，10个属于FOX家族,8个细胞核受体,7个属于SOX家族。综上所述，在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和肌肉生长。通过秦川牛ZBED6基因腺病毒载体的构建能够为秦川牛肉质性能、生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种提供重要的研究资料，最终为转基因动物的研究及秦川牛生长发育和牛肉品质的改善提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6。本发明的第二个目的在于公开了质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6的制备方法。本发明的第三个目的在于公开了质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6是由AdEasyTM系统构建完成。
上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子前含有Kozak序列；其中Kozak序列为GCCCACC。上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子后含有6个His标签序列。构建上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6的方法，所述方法包括如下步骤(I)、将PCR扩增的ZBED6基因片段连接到pGM_T载体，重组质粒pGM_T_ZBED6 ;将重组质粒PGM-T-ZBED6和穿梭质粒pAdTrack_CMV经KpnI和XbaI双酶切，将ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E. coli DH5 α感受态细菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重组质粒；(2)、限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV_ZBED6重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒E. coliBJ5183感受态细菌,利用E. coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV_ZBED6和pAdEasy-Ι的同源重组，获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒pAd_ZBED6。上述技术方案所述的方法，其中，所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd_ZBED6用脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定的应用。上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，作为细胞改造的应用。上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_ZBED6，作为肌肉生长发育调控的应用。具体的本发明是通过以下技术方案来实现PCR扩增ZBED6后和pAdTrack-CMV穿梭质粒经KpnI和XbaI双酶切，凝胶回收试剂盒回收ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段，回收的载体片段和目的基因片段T4DNA Ligase进行酶连反应。酶连产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，纯化试剂盒抽提pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，KpnI和XbaI双酶切鉴定证明获得正确的pAdTrackCMV-ZBED6 重组质粒。 限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV_ZBED6重组穿梭质粒，凝胶回收试剂盒回收线性化pAdTrack-CMV_ZBED6重组穿梭质粒，转化含有pAdEasy-Ι质粒E. coliBJ5183感受态细胞，利用E. coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-Ι同源重组获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒，将同源重组成功的重组腺病毒质粒命名为pAd-ZBED6。试剂盒抽提同源重组质粒，O. 7%琼脂糖凝胶电泳，选择比pAdEasy-Ι大的重组腺病毒质粒，Pac I酶切。酶切产物通过O. 7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果与理论上同源重组质粒多克隆位点图谱吻合。pAd-ZBED6重组腺病毒质粒转化E. coli DH5 α感受态细胞，大量抽提质粒备用。pAd_ZBED6重组腺病毒质粒用PacI线性化暴露反向的末端重复序列，采用脂质体转染包装细胞(293Acells)进行病毒包装。转染24h后荧光显微镜直接观察，可见穿梭质粒带有的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达。重组病毒上清液感染293A细胞扩增重组腺病毒，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达。将重组腺病毒质粒pAd_ZBED6感染牛原代肌肉细胞，利用实时定量PCR和Westernbloting技术检测过表达ZBED6基因对牛肌肉细胞增殖分化和肌肉发育相关基因的表达模式的影响，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定方面的应用。本发明的重组腺病毒质粒pAd_ZBED6，可用于感染牛肌肉细胞，牛脂肪细胞，293细胞，C2C12细胞，3T3L细胞等细胞系，检测其对相应细胞结构和功能的影响，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为细胞改造的应用。
将重组腺病毒质粒pAd_ZBED6感染鼠C2C12细胞系，利用实时定量PCR和Western bloting技术检测过表达ZBED6基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因(MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC )在肌肉细胞中的差异表达情况，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为肌肉生长发育调控的应用。本发明具有以下有益效果本发明构建了能够表达秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒载体，本发明所构建的载体，转染原代培养的秦川牛肌肉细胞后，可获得ZBED6mRNA的高效表达，为ZBED6基因功能鉴定和改造细胞，调控代谢和生长发育奠定了基础。
1、图1为PCR扩增的秦川牛ZBED6基因；2、图2为pAdTrack-CMV_ZBED6重组质粒双酶切鉴定；3、图3为pAd_ZBED6重组腺病毒质粒PacI酶切鉴定；4、图 4 为 pAd_ZBED6 质粒转染 293A 细胞 5d ；5、图 5 为 pAd-ZBED6 质粒转染 293A 细胞 IOd ；6、图6为pAd_ZBED6质粒转染秦川牛原代肌肉细胞4d。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对鬼子红在制备治疗胃溃疡药物中的应用作进一步的说明。本发明利用质粒的体外酶切及连接技术，应用pAdEasy-Ι系统，将线性化的穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,所得重组腺病毒质粒可以通过卡那霉素筛选出，并通过质粒大小和限制性内切酶分析鉴定。最后，PacI酶切后的重组腺病毒质粒转染293A细胞包装产生重组腺病毒。实施例1 :DAd-ZBED6重组腺病毒质粒的构建1、材料和方法1.1、仪器超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、CO2培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)、Eppendorf移液器、DYY-1II型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-1II 31A和DYY-1II 28D电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppendorf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。1. 2、主要生化试剂和试剂盒Long Taq 聚合酶、PrimeSTAR DNA 聚合酶、DNA 限制性内切酶(Xba1、Pac1、Pme1、KpnI和XbaI等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker>DNA连接酶、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pAdTrack-CMV、pAdEasy-Ι)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、胎牛血清、细
胞培养基等。1. 3、培养基和抗性LB培养基胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂粉；抗性氨苄青霉素，卡纳霉素等。1. 4、普通试剂肝素钠，Tris, EDTA, NaCl, NaOH，无水乙醇，醋酸钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，抗生素，溴化乙锭(EB)，溴酚蓝，二甲基苯菁FF，乙酸，蔗糖，去离子甲酰胺，硝酸，盐酸，硝酸银，无水碳酸钠，硫代硫酸钠，甲醒，硼酸，琼脂糖，KCl,Na2HPO4,KH2PO4,Tris饱和酚(pH = 8. O)，氯仿，异戊醇，甘油，石蜡油。1. 5、秦川牛ZBED6基因PCR引物的设计(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)参照GenBank 公布的 ZBED6mRNA 序列(NC 007314. 4)设计引物上游引物5，>CGGggtaccGCCCACCATGcaccaccaccaccaccacAGTGTATGTACCTTAAGTGTACC〈3，；下游引物5’>CCCaagcttTTAAGGTAATATTTCTTT TTCATTGC〈3’，其中Kpnl，XbaI分别为上下游的酶切位点。1. 6、PCR扩增秦川牛的ZBED6基因片段(I)、PCR总反应体系为50 μ L，见表1:表I本发明的PCR反应体系
权利要求
1.一种质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。
2.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6是由AdEasyTM系统构建完成。
3.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。
4.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子前含有Kozak序列。
5.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子后含有6个His标签序列。
6.—种构建权利要求1至6中任一权利要求所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的方法，所述方法包括如下步骤(1)、将PCR扩增的ZBED6基因片段连接到pGM_T载体，重组质粒pGM_T_ZBED6;将重组质粒pGM-T-ZBED6和穿梭质粒pAdTrack_CMV经KpnI和XbaI双酶切，将ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E. coli DH5 α感受态细菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重组质粒；(2)、限制性内切酶PmeI线性化pAdTrack-CMV_ZBED6重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒E. coliBJ5183感受态细菌,利用E. coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV_ZBED6和pAdEasy-Ι的同源重组，获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒pAd_ZBED6。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6用脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。
8.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定的应用。
9.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为细胞改造的应用。
10.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为肌肉生长发育调控的应用。
全文摘要
本发明牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6及其构建方法和用途，属于基因工程技术领域。牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的构建方法包括(1)将秦川牛ZBED6基因插入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒的CMV启动子之下，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ZBED6；(2)Pme I线性化后转化含有pAdEasy-l质粒的E.coli BJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1的同源重组，将正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-ZBED6；(3)pAd-ZBED6经Pac I酶切线性化后，脂质体转染293A细胞和秦川牛原代肌肉细胞，产生并获得重组病毒颗粒。本发明可应用于秦川牛ZBED6基因功能研究、鉴定和对种子细胞进行改造，调控肌肉生长发育相关基因的代谢。
文档编号G01N33/68GK103031336SQ201210524888
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者陈宏 , 黄永震, 王璟, 李明勋, 赖新生, 蓝贤勇, 雷初朝 申请人:西北农林科技大学