专利名称：Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,涉及一种Shp2蛋白的应用，具体地说,涉及Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
背景技术：
肝癌是一种严重危害人类的疾病。我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率都呈上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的支出大大增加，肝癌已严重危害我国人民生命财产安全，影响社会经济发展。统计资料表明，肝癌术后高转移复发率(5年复发率达70%，小肝癌也达50%)已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的重要关键。复发转移的机理不明是临床缺少肝癌预后判断指标和有效治疗手段的主要原因。肝癌转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，涉及癌细胞本身、癌细胞与癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用；这些方面的多种因素异常参与了肝癌的转移过程。目前至少有20余种基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中异常表达率并不高，这些指标的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要求。肝癌发生、发展的具体机制仍未阐明。因此，加大对肝癌基础研究势在必行，本领域迫切需要寻找能预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，目前肝癌相关转化医学研究的重要课题，对临床治疗具有重要意义和价值。Shp2蛋白由基因PTPNll所编码(GeneID:5781)，是起去磷酸化作用的一种非跨膜型蛋白酪氨酸憐酸酶(英文全称protein tyrosine phosphatase, non-receptortypell)，其N末端含有2个相同的SH2结构域，Shp2通过SH2结构域结合磷酸酪氨酸，使其自身结构中的酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP酶)激活，对细胞内其他信号分子发挥去磷酸化的作用(参见文献A. Alonso, J. Sasin, N. Bottini,1. Friedberg, A. Osterman, A. Godzik, T.Hunter, J. Dixon and T. Mustelinj Protein tyrosine phosphatases in the human genome, Cellll7(2004),pp. 699-711.)。一般来说蛋白激酶促进信号传递，而蛋白磷酸酶抑制信号传递，而Shp2的特殊之处正在于它的去磷酸化效应非但不抑制而且还促进信号传递，进而在调节细胞生物的多种信号转导过程及控制细胞活性中发挥着重要的作用。近年来一些实验研究发现Shp2分子及其突变体与多种恶性疾病的发生有密切关系，文献报道[2_6]Shp2在造血系统恶性肿瘤中呈异常分布和过度表达，此过程被认为是Shp2参与转导细胞外生长因子产生的信号如IL-3 (白介素3)、TOGF(血小板衍生的生长因子)、GM-CSF(集落刺激因子)等，并正向调节与细胞增殖有关的Ras/Erk、PI3K/Akt和Jak/STAT等信号转导通路(参见文献A. Ostman, C.Hellbergt and F. D. Bohmerj Protein-tyrosine phosphatases and cancer，Nat RevCancer6 (2006)，pp. 307 - 320. ；]M. L. Lohj S. Vattikuti，S. Schubbert，M. G. Reynolds, E.Carlson, Κ. H. Lieuw, J. W. Cheng, C. M. Lee, D. Stokoe and J. M. Bonifas et al.，Mutationsin PTPNllimplicate the SHP_2phosphatase in leukemogenesis，Bloodl03 (2004)，pp.2325 - 2331. ；M. Scherrj A. Chaturvedij K. Battmerj1. Dallmannj B. Schultheisj A. Ganserand M. Ederj Enhanced sensitivity to inhibition of SHP2，STAT5and Gab2expressionin chronic myelogenous leukemia (CML),Bloodl07 (2006), pp. 3279 - 3287.；J. Chen, W. -M. Yuj H. Dainoj H. E. Broxmeyer, B. J. Druker and C. -K. Quj SHP-2phosphataseis required for hematopoietic cell transformation by Bcr-Abl，Bloodl09 (2007)，pp. 778-785. ；W. M. Yuj H. Dainoj J. Chen, K. D. Bunting and C. _K. Quj Effects ofa leukemia-associated gain—of—function mutation of SHP_2phosphatase oninterleukin-3signaling, J Biol Chem281 (2006)，pp. 5426 - 5434.)。在胃上皮细胞向癌细胞转化的过程中Shp2与其结合蛋白Gab2也被认为发挥了重要作用(参见文献M Golam Mohi, Benjamin G Neel, The role of Shp2 (PTPNll) incancer, Current Opinion in Genetics&Developmentl7(2007)，pp. 23-30. X研究还显示Shp2和Gab2参与异常激活乳腺上皮细胞HER2/Neu通路，导致乳腺上皮细胞转化与癌变(参见文献:M. Bentntires-Alj, S. G. Gii, R. Chan, Z. C. Wang, N.1manakaj L. Harris, A. Richardson, B. G. Neel and H. Guj Casual role of the scaffoldingadapter Gab2in breast cancer, Nat Medl2(2006)，pp. 114-121.)。在肝脏疾病的研究中，Shp2被报道通过调节Eri1、Akt和IL-6/STAT3等通路促进肝损伤后肝细胞的再生。而利用该分子做为靶点可调节IF-1产生，为有效治疗病毒性肝炎等免疫相关疾病开辟了新途径(参见文献Emilie A. Bard-Chapeau, Jing Yuan, NathalieDroin, Shinong Long, Eric E.Zhang, and Gen-Sheng Feng, Concerted Functions ofGabland Shp2in Liver Regeneration and Hepatoprotection, Molecular and CellularBiology26(2006)，pp. 4664-4674.)。肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而Shp2做为十分重要的肿瘤癌基因目前尚无文献报道Shp2蛋白与判断肝癌预后或肝癌转移相关。
发明内容
本发明的目的在于提供Shp2蛋白的新应用，特别是在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测Shp2蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术后状况。基于Shp2蛋白的相对表达量与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。本发明提供了 Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，该应用是指将Shp2蛋白作为分子标记，利用Shp2单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测Shp2蛋白在肝癌组织中的相对表达量。特异性抗Shp2蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。所述的Shp2多克隆抗体为本发明人等利用Shp2重组蛋白免疫兔子后制备得到的(参见文献 Yokoyama, ff. M. , Christensen, M. , Santos, G. D. and Miller, D. 2006. Productionof Monoclonal Antibodies. Current Protocols in Immunology. 74:2. 5.1 - 2. 5. 25. X本发明还提供了使用上述试剂盒用于体外检测Shp2蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤(a)利用本试剂盒中的免疫组化实验试剂(二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分；(d)根据评分计算肿瘤组织中Shp2蛋白分子表达量。所述的该方法具体步骤如下(I)制备肝癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；(2)切片脱腊至水；二甲苯 IOmin — 二甲苯 IOmin — 二甲苯 IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85%乙醇5min — 75%乙醇5min —双蒸水5min( (3) 3%H202甲醇液，室温放置20min ；(4)双蒸水洗三次,每次5min ；(5)抗原修复切片放入0. OIM柠檬酸盐缓冲液(ρΗ6· 0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；(6)自然冷却至室温`,双蒸水洗三次,每次5min ;(7) 1%BSA 封闭 30min，37 °C ；(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗，所述的一抗为兔Shp2多克隆抗体(可识别人、鼠等哺乳动物中Shp2蛋白)，购自美国CST公司，稀释比例1:75 ;置入湿盒中30min，37°C，然后4°C冰箱过夜16小时；(9)4°〇取出，室温复温151^11，然后0.0謹PBS洗四次，每次5min ;(10)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释，45min，37°C ；(11)0. OlM PBS 洗四次，每次 5min，DAB 显色 2-10min，镜下观察；(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；(14)脱水透明，盖玻片覆盖；(15)显微镜下观察阳性染色，分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；(16)采用Image Scope (Aperio公司)软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms (Positive Pixel Count)程序对每个样本进行“阳性Pixel”计算,获得计算数据如下表
区域(Regicm)
+l只(Area ( u m2))
.
权利要求
1.Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是指将Shp2蛋白作为分子标记，利用Shp2单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测Shp2蛋白在肝癌组织中的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，其中的Shp2多克隆抗体是利用Shp2重组蛋白免疫兔子后制备得到的。
3.根据权利要求1所述的Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，其中的免疫组化实验试剂是指二甲苯、乙醇、3%H202甲醇液、1%BSA封闭液、DAB显色试齐U、苏木素和辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是使用所述的试剂盒在体外检测Shp2蛋白在肝癌组织中的表达量，其检测方法包括以下步骤 Ca)利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色； (b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片； (c)利用生物图像处理软件分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分； Cd)根据评分计算肿瘤组织中Shp2蛋白分子表达量。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种Shp2蛋白的应用，具体地说，涉及Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组织相对瘤旁组织中Shp2蛋白相对表达量，并结合术后随访信息，确定Shp2蛋白相对表达量与手术后肝细胞癌患者预后存在相关性，Shp2蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
文档编号G01N33/68GK103063850SQ201310005628
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者王红阳, 丁劲, 韩涛, 李恒宇, 向代民, 孙焕林 申请人:中国人民解放军第二军医大学