Psa单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了两种前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，使用三种抗原免疫得到，一种为直接外购的PSA抗原，第二种和第三种分别为PSA蛋白序列的N端多肽及C端多肽。得到的两株单抗的最低检测浓度不大于0.5ng/ml，优于现有技术。
【专利说明】PSA单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
【背景技术】
[0002]前列腺特异性抗原PSA (Prostate)是一种含有237个氨基酸的单肽链糖蛋白，分子量约300kDa。属于具有组织特异性的具有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶族。PSA主要由前列腺的腺上皮细胞产生，在精液中的浓度很高。PSA的主要生理作用是分解精液中的胶状蛋白，有稀释精液，增加精子运动能力的作用。最初分泌到前列腺腺管的PSA是一种无活性的酶原(proPSA)，酶原在氨基端裂解掉7个氨基酸后具有丝氨酸蛋白酶活性。少量PSA可进入血循环，进入血循环的大部分PSA迅速与蛋白酶抑制素结合而失活，主要与α-1抗糜蛋白酶(ACT)和α-2巨球蛋白结合(MG)，也有少部分被蛋白水解酶灭活后以游离状态存在。游离的PSA以及和ACT结合的PSA(PSA-ACT)通过现有免疫学方法可以检测到。同时检测游离PSA和PSA-ACT复合物即为目前所说的总PSA检测。与α -2巨球蛋白结合(MG)的PSA由于蛋白的包裹、遮蔽作用使PSA特异性表位消失，因此用现有免疫学方法无法检测。血清总PSA含量和前列腺疾病密切相关，良性前列腺增生和恶性的前列腺癌都会引起总PSA升高，游离PSA则较少受前列腺癌生长的影响。PSA具有组织特异性，但并无肿瘤特异性，前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌均可导致PSA升高。
[0003]前列腺癌已超过皮肤癌成为北美男性最常见的癌症，因癌致死病例数排第二位。PSA在大多数有临床症状的前列腺癌中都会升高，因此监测PSA含量对于评估肿瘤治疗效果有重要意义。
[0004]目前PSA的检测方法目前全部采用免疫学方法，由于检测到总PSA值后还要配合其他的试剂盒计算游离PSA及PSA-ACT的比值来综合判断是癌变还是增生，因此在低浓度范围内检测的精度对于临床非常重要，但是现有技术能够检测的范围和精度比较差，严重制约了临床应用。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提出两株分泌前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其产生的单抗利用化学发光法检测病人血样，得以达到最低检测限不大于
0.5ng/ml，灵敏度和准确度都大大高于目前的水平。
[0006]本实验使用外购天然PSA抗原作为免疫，以获得针对PSA不同构象表位的抗体；同时由于蛋白氨基酸序列的N端、C端比较容易暴露出线性表位，所以分别合成N端多肽、C端多肽，以获得针对线性表位的抗体。
[0007]分别用三种抗原免疫小鼠,免疫后进行小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合。采用公知的检测方法对单克隆抗体进行检测，将得到的阳性细胞进行亚克隆。最后用双抗夹心ELISA法对抗体进行配对，得到两株配对的细胞株PSAl (保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2013年11月08日，保藏编号CGMCC N0.8451，分类命名:前列腺单克隆抗体杂交瘤细胞株)和PSMl (保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2013年11月08日，保藏编号CGMCC N0.8452，分类命名:前列腺单克隆抗体杂交瘤细胞株)。
[0008]基于上述目的本发明提供的分泌前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC N0.8451和CGMCC N0.8452。
[0009]一种前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体，由编号为CGMCC N0.8451的杂交瘤细胞株分泌。
[0010]一种前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体，由编号为CGMCC N0.8452的杂交瘤细胞株分泌。 [0011 ] 上述两种抗体可以应用于试剂盒的制备。
[0012]人体血清的总PSA正常值为0-4ng/ml,—旦超过了 4ng/ml,就必须进行进一步的检测以确定是否患有前列腺癌症或者炎症。一般免疫分析检测报告的血清总PSA (t-PSA)为f-PSA与PSA-ACT的总和。t-PSA或PSA-ACT在前列腺癌患者血清中明显升高，在部分良性前列腺疾病患者血清中也有轻微升高，特别是在低水平升高的重叠范围内(4-10ng/ml)。本实验筛选到的两株单抗，用双抗夹心ELISA方法可以检测的线性范围为0-100ng/ml，可以为判断病情提供有力的数据证明。同时其抗体可以达到最低检测限不大于0.5ng/ml，较现有试剂盒的最低检测浓度lng/ml，本抗体在低值检测范围内也有很大的优势。
[0013]本发明提供的分泌前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够稳定的分泌抗前列腺特异性抗原PSA的单克隆抗体，两株单抗的最低检测浓度不大于0.5ng/ml，优于现有技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明得到的两株单抗双抗夹心ELISA得到的STD曲线图。
【具体实施方式】
[0015]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
[0016]I 材料
[0017]I)试剂 PSA Antigen 购自 Biospacific 公司；
[0018]2)合成N端多肽及合成C端多肽，来源于上海楚肽生物科技有限公司(Ap印tideC0., Ltd.)
[0019]3)动物6周龄，雌性，BALB/c小鼠，购自协和医科大学实验动物中心。
[0020]4) SP2/0骨髓瘤细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。
[0021]5) HisTrap HP、HiTrap Protein G 柱购自 GE;
[0022]6)弗氏佐剂、50%聚乙二醇(PEG) 1450溶液、HAT、HT以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG、四甲基联苯胺(TMB)、孕酮(Progesterone)纯度>90%均为Sigma产品；
[0023]7 ) DMEM培养基为Gibco产品；[0024]8)新生牛血清购于杭州四季清生物工程有限公司。
[0025]2 方法
[0026]2.1PSA免疫抗原的准备
[0027]PSA免疫抗原采用三种:一种为直接外购自Biospacific公司的PSA Antigen ;第二种和第三种分别为PSA蛋白序列的N端多肽及C端多肽。
[0028]2.2多肽合成
[0029]N 端多妝序列:mwvpvvfltl svtwigaapl ilsrivggwe
[0030]C 端多妝序列:wviliteltm palpmvlhgs lvpwrggv
[0031]按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司(Ap印tideC0.，LtcOHPLC检测纯度为95%。多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
[0032]2.3合成多肽与载体的偶联
[0033]载体蛋白选择BSA(Roche公司)，用SPDP(PIERCE公司)连接法将合成的多肽与BSA进行偶联:4.6mgSPDP 溶解于 740ulDMS0，终浓度为 20mM。0.1008gBSA 溶解于 2mlPBS_EDTA溶液中，室温静置lh。HiTrap?Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜。
[0034]2.4动物免疫
[0035]三种抗原分别作为免疫抗原免疫小鼠,选用6周龄、雌性BALB/c小鼠。首次免疫，50 μ g/只的抗原加等体积完全福氏佐剂，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 μ g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，`皮下注射，二免后效价为1:50000 ；2周后，第三次免疫，用25yg/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射，7-10天后，ELISA检测免疫鼠血清效价，效价达到1:10W，准备做细胞融合。如果效价比较低，则2周后继续进行第四次免疫，免疫剂量及方式同第三次免疫一致，直至尾血效价检测达到1:10W左右。细胞融合前3天，再用25 μ g抗原腹腔注射以加强免疫。
[0036]2.5细胞融合
[0037]细胞融合可采用公知的方法进行。取免疫小鼠脾脏细胞(I X IO8个细胞)与骨髓瘤细胞株Sp2/0 (IXlO7个细胞％)，在50%PEG1450作用下进行常规融合。融合细胞用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基，14d后改用DMEM培养基培养(20%小牛血清)。融合板铺板10板，融合率为90%。
[0038]2.6阳性检测
[0039]单克隆抗体的检测采用公知的方法进行，间接ELISA法。用抗原PSA(包被浓度为100ng/ml)包被酶标板，37°C孵育lh，洗板；96孔细胞培养板的每个待检孔取IOOul加入包被好的酶标板，37°C孵育45min，洗板；加入HRP酶标二抗，37°C，30min,洗板；加入TMB显色液，37°C避光反应15min后，加人终止液；读取波长为450nm时的OD值。OD值读大于0.5以上定义为阳性克隆。三种不同抗原分别做细胞融合，一共得到阳性单株28株。检测到的阳性细胞再进行亚克隆，经过3~5次亚克隆直到达到100%的阳性率。
[0040]2.7抗体纯化
[0041]获得单抗后是否能应用于试剂盒研发生产的要求，需要将28株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体。在预先I周注射石蜡油(0.5ml/只)致敏的BALB/C小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞，细胞数为106，7~10天后采集腹水并离心得上清。腹水上清按1:10稀释于PBS中，并以0.5ml/min上样于经PBS平衡的HiTrap Protein G亲和层析柱中。用PBS洗杂，再用甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱，用SDS-PAGE电泳鉴定纯度。包被PSA抗原，间接ELISA法测定抗体效价，28株抗体的效价在1: 6W~1:20W之间。
[0042]2.8抗体的标酶及效价检测
[0043]得到纯化抗体后，利用改良过碘酸钠氧化法进行抗体标酶。首先称取适量HRP酶，溶于三蒸水中，加人新近配制的过碘酸钠溶液，混匀后置4°C，30min ;加入乙二醇溶液，室温，30min ;加入适量纯化抗体，混匀，调pH值至9.0，放4°C，过夜；加入硼氢化钠，混匀，置40C，2h ;将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4°C，30min ;离心后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜。包被PSA抗原,直接ELISA法测定酶标抗体效价,酶标抗体的效价在1:500~1:5K之间，酶标抗体的工作浓度为1:200~2Κ之间。2.9双抗夹心ELISA进行抗体配对及优化
[0044]PSA试剂盒大多数使用的为双抗夹心法原理，这就需要将获得的抗体进行酶标和抗体配对试验。双抗夹心ELISA检测方案:用0.01mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释至5μ g/ml包被酶标板，4°C过夜；用PBS/T20洗板3次，每次3min ;用含5%小牛血清的PBS/T20封闭，37°C孵育Ih，洗板；加入倍比稀释的PSA溶液，37°C孵育45min，洗板；加入HRP-单克隆抗体，370C，30min,洗板；加入TMB显色液，37°C避光反应15min后，加人终止液；读取波长为450nm时的OD值,选取配对情况最好的两株单抗。
[0045]通过双抗夹心ELISA法对28株单抗进行抗体配对实验,得到最佳配对的抗体，分别为PSA1、PSM1，其中PSAl为外购自Biospacific公司的PSA Antigen免疫小鼠后获得的抗体，PSMl为合成的N端多肽免疫小鼠后获得的抗体。
[0046]表1为PSA1、PSMl双抗夹心ELISA配对结果，STD曲线图见附图1:
[0047]表1
【权利要求】
1.分泌前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为 CGMCC N0.8451 和 CGMCC N0.8452。
2.一种前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的编号为CGMCC N0.8451的杂交瘤细胞株分泌。
3.一种前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的编号为CGMCC N0.8452的杂交瘤细胞株分泌。
4.根据权利要求2或3所述的单克`隆抗体在试剂盒制备中的应用。
【文档编号】G01N33/573GK103589689SQ201310560689
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司