一种用于检测样品中流感病毒的试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测样品中流感病毒的试剂盒，其中，该试剂盒包括缓冲液供应单元和检测试纸条；该检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区，样品供应区，检测区；该底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，该底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触；该样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有吸附有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体标记单克隆抗体1，该酶底物能与该标记单克隆抗体1上标记的酶产生显色反应；以及在该检测区固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体固定单克隆抗体2。本发明还提供了使用该试剂盒检测样品中流感病毒的方法。本发明的试剂盒及其检测方法具有快速、准确，特异性强、灵敏、稳定性好的优点。
【专利说明】-种用于检测样品中流感病毒的试剂盒及其检测方法和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] A型流感病毒包括禽流感病毒（Avian Influenza Vitus，AIV)、猪流感病毒（Swine Influenza Vitus，SIV)、马流感病毒（Equine Influenza Vitus，EIV)和犬流感病毒（Canine Influenza Vitus，CIV)等，世界动物卫生组织（Office of International Education，0ΙΕ) 将A型流感病毒所引起的疾病列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
[0003] 其中，禽流感病毒可引发禽流感，禽流感是一种高度传染性疾病，根据其致病性将 其分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，特别地高致病性禽流感给养禽业带来了毁灭性 打击；猪流感病毒会引起猪流感，甚至导致猪死亡，猪流感不仅危害猪体健康，影响育肥猪 的上市时间，还增加了饲养成本，给养猪业造成了不容忽视的损失；马流感病毒会引发马流 感，使马呼吸、脉搏频数增加，食欲降低，精神委顿，眼结膜充血水肿，大量流泪，在发热期间 经常出现肌肉震颤，还增加了驯养成本；犬流感病毒引发犬流感，表现为持续咳嗽，伴有黄 色的鼻分泌物，严重时会出现高烧、呼吸频率加快等类似肺炎的症状，还对公共卫生造成了 巨大的影响。
[0004] 在A型流感病毒的防治工作中，诊断、监测是至关重要的环节。目前，A型流感病 毒检测方法主要包括核酸检测方法和胶体金快速检测方法。核酸检测方法虽特异性好、灵 敏度高，但其检测需昂贵的PCR仪和专业的技术人员，并且只能在具备核酸检测能力的实 验室开展，而大部分的基层临床条件不具备核酸检测的能力，采集的标本需要送到具备检 测能力的实验室进行检测，缺乏时效性，不利于疫情的控制，也限制了其在大规模筛查方面 的应用。胶体金快速检测试剂以其快速、准确、简便、肉眼判读、实验结果易保存等优点被广 泛应用于A型流感病毒的快速检测和现场诊断上，但其灵敏度较低。因此，快速、准确、灵敏 度高、简便的A型流感检测方法是当前研究的重点。
【发明内容】
[0005] 为了实现A型流感病毒快速、简便、准确地检测及检测中灵敏度较低的问题，本发 明提供了两种抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备的酶层析法检测试剂盒，该试剂 盒不仅比常规的胶体金快速检测试纸条具有更高的灵敏度，而且检测快速、操作简便，适用 于A型流感病毒的快速检测。
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种用于检测样品中A型流感病毒的试剂盒，其中， 所述试剂盒包括缓冲液供应单元和检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所 述检测试纸条；所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜（1)，所述检测试纸条在纵向上依次包 括底物供应区，样品供应区，检测区；所述底物供应区包括底物垫（3)，其上吸附有干燥的 酶底物，所述底物垫（3)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维 素膜（1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫（2)，其上吸 附有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体标记单克隆抗体1，所述酶底物能与所述标记单克隆抗 体1上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫（2)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述标记单克隆 抗体1溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜（1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及 所述检测区固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体固定单克隆抗体2。
[0007] 优选地，所述缓冲液供应单元包括展开液垫（5)、底物缓冲液槽（8)、底物缓冲液 (9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液（9)置于底物缓冲液槽⑶中，所述缓冲液按钮位于底 物缓冲液槽（8)的上方，按下可将所述展开液垫（5)浸入缓冲液（9)中；所述检测区包括检 测线（6)、质控线（7)，其中，所述质控线（7)较检测线（6)更远离所述样品供应区，在所述 检测线（6)固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体固定单克隆抗体2,在所述质控线（7)固 定化有羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫（2)上的标记单克隆抗体1对于固定在检测线（6)的 固定单克隆抗体2而言是过量的；所述硝酸纤维素膜（1)全段粘附在所述支撑物（10)上， 支撑物（10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫（4)， 所述吸水垫（4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品（11)加入的位置为所述 酶标垫⑵的位置。
[0008] 作为本发明的一种实施方式，所述酶层析法检测试纸条包括固相的硝酸纤维素膜 1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲 液槽8、底物缓冲液9、支撑物10,其中2属于样品供应区，3属于底物供应区，5、8属于缓冲 液供应单元，6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。酶层析法检测 试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫 4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段；吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端，且与硝 酸纤维素膜1有重叠；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段，上面干燥有酶标记的鼠抗A型 流感病毒核蛋白抗体1 ;底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开 液垫5的上端覆盖了底物垫3,且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的 上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，其上有缓冲液按钮，按下缓冲液按钮可 刺破铝箔纸，并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜 1的中上端，其上固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体2。质控线7位于硝酸纤维素膜1 的中上端、检测线6的上游，其上固定化有羊抗鼠多抗。
[0009] 优选地，所述标记单克隆抗体1其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 2、轻链 可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 3 ;以及所述固定单克隆抗体2其重链可变区的氨基酸序 列为SEQ ID No. 4、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 5。
[0010] 本发明所用术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群 体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该 抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双 链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体 片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
[0011] 本发明所述"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性 结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功 能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生 的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以 是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗（diabodies)。融合至另 一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆 与表达在 EP. A. 0120694 和 EP. A. 0125023 中描述。
[0012] 本发明所述"抗体"可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来 抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区 或互补性决定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见， EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进 行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
[0013] 用于本发明的"单克隆抗体"也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体 的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合 成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连 入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞， 然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
[0014] 本发明所用术语抗体重链或轻链的"可变区"是该链的N端成熟区域。所有区域、 CDRs和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDRs残基的 鉴定和编号按 Chothia 和他人所述（Chothia，Structural determinants in the sequences of immunoglob μ lin variable domain. J. Mol. Biol. , 1998 :278,457) 〇
[0015] 本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链 可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基 酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体或其片段，而仍能够保持与A型流感病毒 特异性结合。
[0016] 本发明所用术语"核蛋白"（Nuclear Protein,NP)是一种单体磷酸化的多肽，分子 量约60kD，是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分；该蛋白具有特异性，根据其抗原性的不同 将流感病毒分为A、B、C三种类型（刘红旗等，A型流感病毒蛋白研究进展，动物医学进展， 2002,23(2) :6-9)。所述核蛋白还为其保守性变异体或活性片段，所述"其保守性变异体或 活性片段"与本发明所述A型流感病毒0RF5编码核蛋白氨基酸序列SEQ ID NO. 1相比，可存 在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除但仍能保持与A型流感病毒特异性结合。
[0017] 优选地，所述标记的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任 一种。
[0018] 优选地，所述固相中抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体为重链可变区的氨基酸序 列为SEQ ID No. 4、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 5的单克隆抗体，所述标记试剂中 抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体为重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 2、轻链可变区 的氨基酸序列为SEQ ID No. 3的单克隆抗体。所述标记试剂可通过酶标记获得；优选地，所 述酶包括辣根过氧化酶（HRP)、碱性磷酸酶（ALP)和β-D-半乳糖苷酶中的任一种。
[0019] 优选地，所述底物缓冲液为水性溶剂，包括磷酸缓冲液、表面活性剂、防腐剂和糖 类的一种或几种。
[0020] 优选地，所述试剂盒还包括样品处理管，所述样品处理管含有样品处理液，所述样 品处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、月旨 肪酸甘油酯和CHAPS的任一种。
[0021] 本发明所用术语"表面活性剂"能使目标溶液表面张力显著下降的物质，可降低两 种液体或液体-固体间的表面张力。
[0022] 优选地，所述试剂盒还包括样品保存瓶，所述样品保存瓶含有样品保存液，所述样 品保存液为磷酸盐缓冲液，优选为PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
[0023] 本发明所用术语"磷酸盐缓冲液"是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶 液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸 盐（包括但不限于钠和钾盐）制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷 酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形 式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pHIO的范 围，优选约PH5至pH9的范围，更有选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7. 4。进一步优选 地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
[0024] 本发明的另一目的在于提供一种使用所述试剂盒检测样品中流感病毒的方法，所 述方法包括：（1)使用所述样品处理管预处理样品；（2)将所述步骤（1)中预处理样品加入 所述酶标垫2的位置；（3)按下缓冲液按钮，观察结果；以及（4)若质控线处并无条带，无论 检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带， 则为阳性，否则为阴性。
[0025] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述A型流感病毒酶层析法的检测方法，为： (1)将采集完的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生 物拭子头折断留与瓶中；（2)将含有样品的样品处理管盖子头部折断，挤出一滴样品加入 加样孔，同时迅速按下缓冲液按钮；（3)30分钟后在所述检测试纸条的检测区观察记录结 果。
[0026] 本发明的再一目的在于提供所述试剂盒在检测样品中流感病毒中的应用。
[0027] 本发明还提供了一种抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体1，所述单克隆抗体1其重 链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 2、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 3。
[0028] 本发明还提供了 一种抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体2，所述单克隆抗体2其重 链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 4、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 5。
[0029] 基于此，本发明的突出优点在于：
[0030] (1)酶层析法检测试纸条在硝酸纤维素膜上完成了 ELISA检测过程，实现了酶联 免疫级联放大效应，因此其灵敏度可以达到ELISA水平，比胶体金试纸条高10倍以上，在有 些病原的检测中与PCR检测敏感性相当；
[0031] (2)具有结果简单、使用方便、检测效率高的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为酶层析法检测试纸条的侧向示意图，图中：1_硝酸纤维素膜，2-酶标垫， 3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-质控线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液， 10-支撑物，11-检测样品。
[0033] 图2为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定2株抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的纯度，其 中泳道1为单克隆抗体2,包括上端的重链和下端的轻链，泳道2为单克隆抗体1,包括上端 的重链和下端的轻链，泳道3为蛋白Maker。
[0034] 序列表中：
[0035] 序列1为A型流感病毒核蛋白的氨基酸序列；
[0036] 序列2为标记的抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体1的重链可变区氨基酸序列；
[0037] 序列3为标记的抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体1的轻链可变区氨基酸序列；
[0038] 序列4为固定的抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体2的重链可变区氨基酸序列；
[0039] 序列5为固定的抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体2的轻链可变区氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0041] 本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为9. 6,其1L体积配方为： Na2C03l. 59g、NaHC032. 93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0042] 本发明实例中所用的样品保存液为磷酸盐缓冲液，pH值为7.4,其1L体积配方 为：NaC18. 0g、KC10. 2g、Na2HP04 · 12Η202· 9g、KH2P040. 24g，终浓度为 10000IU/mL 的青霉素、 8000IU/mL的链霉素和5000IU/mL的卡那霉素，但该实施方式无论在任何情况下均不构成 对本发明的限定。
[0043] 本发明实施例中的酶标抗体以辣根过氧化物酶（HRP)为例进行标记，但该实施方 式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0044] 本发明实施例中A型禽流感病毒株A/Ck/HK/Yu22/02株已经在专利申请 CN1814623A 中公开。
[0045] 本发明实施例中A型禽流感病毒株A/California/04/2009株已经在专利申请 CN101974489A 中公开。
[0046] 本发明实施例中B型流感病毒株VR788株已经在专利申请CN102337351A中公开。
[0047] 本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0048] 本实例中所用的A型流感病毒酶层析法的判定标准为：质控线的有无决定了检测 过程是否有效，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效；在质控 线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性。
[0049] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说 明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0050] 实施例1抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
[0051] 1. 1抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备和纯化
[0052] 抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备和纯化，包括如下步骤：
[0053] 1. 1. 1动物免疫：将A型流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株的灭活病毒 lmL加等量的完全弗氏佐剂并经充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的6-8周龄BALB/c 健康小鼠，每只多点注射乳化后的A型流感病毒A/California/04/2009 (H1N1)株500 μ L， 间隔2周加强一次；用间接ELISA测定其抗血清：
[0054] 进行完毕后采用间接ELISA测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成：
[0055] a、包被：
[0056] 以20mmol/L、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将A型流感病毒核蛋白1 :2000稀释，包被96 孔聚乙烯板，真空抽干，密封4°C保存备用。
[0057] b、封闭：
[0058] 每孔加入pH7. 4的磷酸盐缓冲液200 μ L洗涤、内含10% (V/V)小牛血清；
[0059] c、加样：
[0060] 每孔加入第三次免疫后3天的1 :5000 (V/V)稀释的小鼠外周血清50 μ L，每板设 一正常对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白对照，洗涤；
[0061] d、加入酶标羊抗鼠二抗每孔100 μ L，洗涤；
[0062] e、显色：
[0063] 每孔加入底物100 μ L ;
[0064] f、比色：
[0065] 以空白调零，450nm波长测定光密度（0D);
[0066] g、结果判断：P/N =测定标本0D均值/阴性血清0D均值，P/N彡2. 1为阳性。
[0067] 步骤a中的聚乙烯板规格为200 μ L/孔、真空抽干温度为4°C，洗涤采用0. 05 %的 Tween-20磷酸盐缓冲液洗漆3次。
[0068] 步骤b中的工艺参数为每孔加入pH7. 4、含10%小牛血清磷酸盐缓冲液200 μ L，温 度为37°C、时间2小时，洗涤1次。
[0069] 步骤c中的工艺条件为每孔加入1 :5000(V/V)稀释后的第三次免疫后3天的小鼠 外周血清50 μ L，每板设一正常对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白对照，温度为37°C、时 间为1小时，洗涤3次。
[0070] 步骤d中的工艺条件加入酶标羊抗鼠二抗每孔100 μ L，温度为37°C、时间为1小 时，洗涤3次。
[0071] 步骤e中的工艺条件为室温、时间为15分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪 在波长450nm处读取光密度值。
[0072] 1. 1. 2分离脾细胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺96孔培养板， 将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9 X 105/mL细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成 细胞悬液；
[0073] 1.1. 3细胞融合：将处于对数期的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1 : 10 (V/ V)比例混合，加入PEG-1500使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加 4. 5mL培养液；间隔2分钟滴加5mL培养液，然后加培养液50mL，以HAT选择培养基按36% 的孔为1个细胞/孔进行细胞培养；
[0074] 1. 1. 4筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第七天时，即细胞培养至覆盖10% 孔底时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA检测抗体含量， 经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株，扩 大培养并冻存。
[0075] 1. 1. 5单克隆抗体纯化保存：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用液体石錯行小 鼠腹腔注射，一周后将5 X 105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，在接种一周后收集小鼠的腹 水，每只小鼠可收集10mL的腹水，使用ΑΚΤΑ蛋白纯化仪及DE-52离子交换柱将小鼠 IgG单 克隆抗体腹水溶液在A28(lnm时收集。
[0076] 最终得到两株杂交瘤细胞系，分别分泌单克隆抗体1和单克隆抗体2。
[0077] 按照李慧瑾等（李慧瑾等，甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变 区基因的巢式PCR扩增及序列分析，生物技术通讯，2013,24(1) :61-64)文献的操作方法确 定单克隆抗体1和单克隆抗体2的重链可变区和轻链可变区。
[0078] 结果：单克隆抗体1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 2、轻链可变区的氨 基酸序列为SEQ ID No. 3 ;单克隆抗体2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 4、轻链可 变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 5。
[0079] 1. 2抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的鉴定
[0080] 1. 2. 1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
[0081] 1. 2. 1. 1按照房师松等（房师松等，甲型流感病毒核蛋白基因的克隆表达及纯化， 中华实验和临床病毒学杂志，2005,19 (2) :165-168)文献的操作方法制备A型流感病毒核 蛋白。
[0082] 1.2. 1.2用碳酸缓冲液稀释基因工程重组后的A型流感病毒核蛋白，按100 μ g/ 孔包被，对单克隆抗体的细胞培养上清进行检测，按照Koenig R. (Koenig R. Indirect ELISA methods for the broad specificity detection of plant viruses. Journal of General Virology，1981,55(1) :53-62)文献中的间接ELISA法进行，加入的酶分别为 稀释的HRP-山羊抗鼠 IgM(HRP-IgM)、HRP-山羊抗鼠 IgGl (HRP-IgGl)、HRP-山羊抗鼠 IgG2a(HRP-IgG2a)、HRP-山羊抗鼠 IgG2b(HRP-IgG2b)和 HRP-山羊抗鼠 IgG3(HRP-Ig G3) 抗体酶标二抗，结果见表1。
[0083] 表1各单克隆抗体类型的鉴定
[0084]
【权利要求】
1. 一种用于检测样品中流感病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和 检测试纸条； 所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述检测试纸条； 所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜（1)，所述检测试纸条在纵向上依次包括底物供应 区，样品供应区，检测区； 所述底物供应区包括底物垫（3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫（3)与硝酸纤 维素膜（1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜（1)上向距所述缓冲液供应 单元的远端迁移； 所述样品供应区包括酶标垫（2)，其上吸附有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体标记单克 隆抗体1，所述酶底物能与所述标记单克隆抗体1上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫 (2)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述标记单克隆抗体1溶于缓冲液中，并在硝酸纤维素膜 (1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及 所述检测区固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体固定单克隆抗体2。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫（5)、底物 缓冲液槽（8)、底物缓冲液（9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液（9)置于底物缓冲液槽（8) 中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽（8)的上方，按下可将所述展开液垫（5)浸入缓冲液 (9)中； 所述检测区包括检测线（6)、质控线（7)，其中，所述质控线（7)较检测线（6)更远离所 述样品供应区，在所述检测线￠)固定化有鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体固定单克隆抗体 2,在所述质控线（7)固定化有羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫（2)上的标记单克隆抗体1对 于固定在检测线（6)的固定单克隆抗体2而言是过量的； 所述硝酸纤维素膜（1)全段粘附在所述支撑物（10)上，支撑物（10)连接所述缓冲液 供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫（4)，所述吸水垫（4)在距所述缓冲 液供应单元的最远端；以及 检测样品（11)加入的位置为所述酶标垫（2)的位置。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述标记单克隆抗体1其重链可变区的氨基酸 序列为SEQ ID No. 2、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 3 ;以及 所述固定单克隆抗体2其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 4、轻链可变区的氨基 酸序列为SEQ ID No. 5。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述标记的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶 和β-D-半乳糖苷酶中的任一种。
5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述底物缓冲液为水性溶剂，包括磷酸缓冲 液、表面活性剂、防腐剂和糖类中的一种或几种。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品处理管，所述样品处理 管含有样品处理液，所述样品处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂包括硬脂酸、十二 烷基苯磺酸钠、卵磷脂、脂肪酸甘油酯和CHAPS中的任一种。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品保存瓶，所述样品保存 瓶含有样品保存液，样品保存液为磷酸盐缓冲液，优选为PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
8. -种使用权利要求1?7任一项所述试剂盒检测样品中流感病毒的方法，所述方法 包括： (1) 使用所述样品处理管预处理样品； (2) 将所述步骤（1)中预处理样品加入所述酶标垫（2)的位置； (3) 按下缓冲液按钮；以及 (4) 若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有 条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性。
9. 根据权利要求1?7任一项所述试剂盒在检测样品中流感病毒中的应用。
10. -种抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体1，所述单克隆抗体1其重链可变区的氨基 酸序列为SEQ ID No. 2、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 3。
11. 一种抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体2,所述单克隆抗体2其重链可变区的氨基 酸序列为SEQ ID No. 4、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No. 5。
【文档编号】G01N33/577GK104062430SQ201410308507
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】张许科, 孙进忠, 李凡, 田克恭 申请人:洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司