本发明涉及一种影响蚕丝蛋白氨基酸序列，更具体的说是涉及一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法。
背景技术：
蚕丝是古代汉族文明产物之一，是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，也称“天然丝”，它与羊毛一样是人类最早利用的动物纤维之一，蚕丝具有轻，细，柔等优点，但也存在强度低，抗外力破坏性弱等缺点，为了改变蚕丝的这种缺点，许多科研工作者均做了不少研究来加固蚕丝，通过拉曼光谱和电子显微镜成像可以知道加固之后的蚕丝晶体结构排列更为有序，各种性能显著提高，但是是否涉及到蚕丝蛋白氨基酸序列的变化很难做出判断。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种快速，直观，简便的基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，该方法采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液0.5～2.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为0.5～1.5％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在50～60℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到93～97℃蒸煮10～20min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml醇于40～50℃下保持15～20min,待冷却至室温加入质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml，黑暗环境下保持15～20min后加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液1.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为1％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在55℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到95℃蒸煮15min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5ml醇于45℃下保持17min,待冷却至室温加入质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5ml，黑暗环境下保持17min后加入65ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
本发明的有益效果是：其向桑叶喷淋含有碳纳米管的溶液以供给蚕幼虫得到加固蚕丝与普通蚕丝利用蛋白质组学方法作对比实验，实验过程中采用减法脱胶并加入SDS阴离子表面活性剂提高脱胶效果，使用胰凝乳蛋白酶进行溶液内酶切以完成酶切分离，采用HPLC-MS/MS进行质谱分析，根据所得到的两组氨基酸序列判断碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列的影响，本发明采用蛋白质组学方法分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列的影响，一方面，灵敏度高，操作简单,另一方面，准确度高，样品使用量少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细介绍：
一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，该方法采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液0.5～2.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为0.5～1.5％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在50～60℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到93～97℃蒸煮10～20min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml醇于40～50℃下保持15～20min,待冷却至室温加入质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml，黑暗环境下保持15～20min后加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库(见附件1)进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
实施例1：一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，该方法采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液0.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为0.5％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在50℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到93℃蒸煮10min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.5％的二硫苏糖醇溶液2ml醇于40℃下保持15min,待冷却至室温加入质量分数为2.2％的碘乙酰胺溶液4ml，黑暗环境下保持15min后加入50ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列
对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
实施例2:一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，该方法采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液1.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为1％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在55℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到95℃蒸煮15min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5ml醇于45℃下保持17min,待冷却至室温加入质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5ml，黑暗环境下保持17min后加入65ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
实施例3:一种基于蛋白质组学分析碳纳米管加固蚕丝对蚕丝蛋白氨基酸序列影响的方法，该方法采用如下步骤：
a)选取一份来自同一母体的蚕卵在相同条件下孵育，待蚕破壳长大之后，将其等量随机分为A，B两组；
b)在A组蚕幼虫所食桑叶上喷淋含有碳纳米管的水溶液2.5ml，B组蚕幼虫所食桑叶不做处理，其他生长条件保持相同；
c)待幼虫吐丝结茧之后收集两组蚕丝分别以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液和质量分数为1.5％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在60℃的烘箱中烘干；
d)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl2:H2O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到97℃蒸煮20min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为14000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，72h后得到丝素蛋白溶液,浓缩处理；
e)取浓缩之后的溶液加入质量分数为2％的二硫苏糖醇溶液3ml醇于50℃下保持20min,待冷却至室温加入质量分数为2.8％的碘乙酰胺溶液5ml，黑暗环境下保持20min后加入80ul的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀释；
f)采用HPLC～MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，比较A，B两组实验结果中的蚕丝蛋白氨基酸序列，B组与氨基酸序列数据库对比差别不大，分析A组，如果A组中氨基酸序列与B组存在明显的序列差异说明蚕丝加固对蚕丝蛋白的序列结构有影响，如果A组氨基酸序列与B组无明显差异说明蚕丝加固与氨基酸序列结构无关。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
附件一
桑蚕：Bombyx mori (5263aa)
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