用于分子电子传感器的经修饰的核苷酸三磷酸的制作方法

发明人：b·l·梅里曼，t·格伊瑟，p·w·莫拉，d·赖德奥特

相关申请的交叉引用

本申请主张2016年8月1日提交的美国临时专利申请系列号第62/369,696的名为“用于分子传感器的经修饰的核苷酸”和2017年1月31日提交的美国临时专利申请系列号第62/452,466的名为“用于分子电子传感器的经修饰的核苷酸三磷酸”的优先权，其公开内容通过引用整体纳入本文。

本公开一般涉及分子电子生物传感器领域，并且具体涉及经修饰的脱氧核苷酸三磷酸(dntps)的设计和使用，以增强分子电子传感器产生的信号。

背景技术：

分子电子学通常是指单个分子或分子组件作为电子电路的部件的使用。尤其，这样的电路可包括传感电路，其中单个分子构成与测试溶液相互作用、以产生与测试溶液的组成相关的电信号的换能器。值得关注的是传感器复合物包括聚合酶以提供能够检测测试溶液中dna和/或rna分子的特性的应用。在这一类型的生物传感器中，聚合酶与作为模板的dna或rna分子相互作用用于聚合互补链，聚合酶通过纳入测试溶液中提供的dntp来产生互补链，并由此进行分子电路的参数的调节以产生电信号。对于这类基于聚合酶的生物传感器，性能的一个重要因素是溶液的dntp含量。

尽管分子传感器的进展和包含聚合酶的分子传感器的复杂程度，核苷酸纳入事件相关的总信号和/或信噪比(snr)可能不足以区分dntp或检测特定的分子事件。因此，持续保证对这些传感器的进一步改进，包括对dntp的可能的修饰，其可改善包含聚合酶的分子传感器中的总信号和/或信噪比。

发明概述

在本公开的各种实施方式中，公开了经修饰的dntp、经修饰的dntp的合成、和分子传感器中经修饰的dntp的使用。显示根据本公开的经修饰的dntp改善分子传感器的信号传导性能，包括增强总信号、提供独特的信号形状、和/或在包含聚合酶的分子传感器中改善与核苷酸纳入事件相关的信噪比。

在各种实施方式中，公开了经修饰的核苷酸(经修饰的dntp)。经修饰的核苷酸包括化合物[16]所表示的结构，

其中：nuc是a、t、c、或g；y选自o、s、b或i；n是2至5的整数；且r¹选自：

其中n＝1至100，且其中经修饰的核苷酸在dna测序期间dna模板的复制中通过dna聚合酶被纳入。在各种实施方式中，经修饰的dntp可包括代替天然三磷酸部分的四磷酸或六磷酸部分。

在各种方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在其它方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在某些方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在其它实施方式中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在各种实例中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在其它方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在各种实施方式中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在一些实例中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在各种方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在一些实例中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在各种实施方式中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是5，且r¹是取代基：

在其它方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是腺苷，n是3，且r¹是取代基：

在某些实施方式中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是胞嘧啶，n是3，且r¹是取代基：

在各种实施方式中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是腺苷，n是3，且r¹是取代基：

其中n＝1至100。

在某些方面中，经修饰的核苷酸是化合物[16]，其中y是o，nuc是腺苷，n是3，且r¹是取代基：

在本公开的各种实施方式中，描述了经修饰的核苷酸(经修饰的dntp)。经修饰的核苷酸的结构用化合物[18]表示，

其中：

nuc是选自a、t、c和g的dna碱基；

y选自oh、sh、或bh3；

n是2至5的整数；

r³选自h或卤素；

r¹选自h、线性或分支的c1-c5烷基、c3-c8环烷基、或芳基，任选地被卤素、me或ome、或-(ch2ch2o)xme取代，其中x是1至20的整数；

l²选自-(ch2)q-(其中q是1至10的整数)、-ch2ch2(och2ch2)y-(其中y是1至约8的整数)、-(ch2)q-o-(ch2ch2o)y-ch2-(其中q是1至约10的整数且y是1至约8的整数)、-co(ch2)r-(其中r是1至约10的整数)、-coch2ch2(och2ch2)z-(其中z是1至6的整数)、-coch2ch2conh(ch2)m-(其中m是1至6的整数)、-coch2ch2conh(ch2ch2o)pch2ch2-(其中p是1至6的整数)、1,4-苯二基、1,3-苯二基、或1,2-苯二基，其碳原子任选地且独立地被卤素、me、et、oh、ome、或cf3取代，或是

r⁴和r⁵独立地选自h、苯基，

其中n＝1至100。

在各种方面中，经修饰的核苷酸是化合物[18]，其中：nuc是a、t、g、或c；y是oh；n＝3或5；r¹是h；r³是h；l²是二价接头-(ch2)4-o-(ch2ch2o)8-ch2-，且r⁴选自苯基，

在本公开的各种实施方式中，描述了增强产生自生物传感器的电信号的方法。所述方法包括：(a)提供生物传感器，其包括源电极和漏电极和与电极桥接的桥分子结合的聚合酶，以完成电子电路；(b)将待测序的核苷酸模板置于与聚合酶连通的位置；(c)将经修饰的dntp置于与聚合酶连通的位置；并且(d)用聚合酶转录核苷酸模板，其中转录包括用聚合酶纳入经修饰的dntp，且其中纳入经修饰的dntp导致与纳入未经修饰的dntp相比增强的电信号。在一些示例中，增强的信号传导包括较大的电流尖峰、可区分的电流相比于时间的峰形状、或改善的信噪比中至少一种。

在某些实例中，经修饰的dntp可包括本文公开的经修饰的核苷酸中的任一种。此外，经修饰的dntp使得增强的电信号可以区分核苷酸模板中的a、g、c、和t，使得核苷酸模板的测序更可靠。在其它实例中，增强的电信号对于每个经修饰的datp、经修饰的dgtp、经修饰的dttp、和经修饰的dctp的纳入而言是独特的。

在本公开的各种实施方式中，描述了转录核苷酸模板的方法。所述方法包括：(a)提供有能力转录核苷酸模板的聚合酶；(b)将核苷酸模板置于与聚合酶连通的位置；(c)将经修饰的dntp置于与聚合酶连通的位置；并且(d)通过纳入经修饰的dntp，用聚合酶转录核苷酸模板，其中经修饰的dntp包括本文公开的经修饰的核苷酸中的任一种。

附图说明

图1是用于dna测序的分子电子生物传感器的实施方式的示意图；

图2显示了包含聚合酶的分子传感器结构200的实施方式；

图3显示了分子传感器上的用于电测量的测试装置的实施方式的示意；

图4描绘了还包括对结合桥分子有用的金金属接触点的金属电极对的电子显微镜图像。

图5a和5b显示了经修饰的dntp用于增强来自基于聚合酶的传感器的信号传导的用途。图5a显示用标准dntp(左边)和用经修饰的dntp(右边)操作的传感器。图5b显示了由用标准dntp(左边)操作的和用经修饰的dntp(右边)操作的传感器记录的示例性的电流对时间图；

图6a和6b显示了用包含标准dntp的序列g4a8-g4a8-g4a8-g4a8(seqidno：1)处理模板时从聚合酶传感器获得的测序信号；

图7显示了用经修饰的dntp的测序信号。信号获自包含经修饰的dgtp(即，脱氮dgtp)的dna模板{gtca}10-gaaccgaggcgccgc(seqidno：2)；

图8a和8b显示了用经修饰的dntp的测序信号的另一个实施方式。测序信号数据获自包含经修饰的dgtp(即，脱氮dgtp)的dna模板{gtca}10-gaaccgaggcgccgc(seqidno：2)；

图9描绘了用经修饰的dntp的测序信号的另一个实施方式。测序信号数据获自包含经修饰的dgtp(即，脱氮dgtp)的dna模板a20-c3-a30-g(seqidno:3)；

图10描绘了用经修饰的dntp的测序信号的另一个实施方式。测序信号数据获自包含γ-磷酸修饰的dctp(dc4p-乳糖和dc4p-cy7等量混合)的dna模板(gt10-t3-gt10-a3-gt10-c3-gt10)(seqidno：4)；

图11列出了经修饰的dntp能够增强来自分子电子传感器中聚合酶活性的信号的机制；

图12列出标准dntp并表示(通过“星形”位置)化学结构，其中可以进行聚合酶良好耐受的修饰；

图13a、13b、13c和13d显示了经修饰的dntp的实施方式，“星形”表示天然dntp的修饰位点；

图14a和14b显示了包含脱氮嘌呤结构的经修饰的dntp的实施方式，7位的“星形”表示c原子取代n原子的位置；

图15a、15b和15c显示了包含三磷酸的γ-磷酸的各种衍生化的经修饰的实施方式，显示了将库仑电荷增量添加到天然dntp的能力；

图16显示了一般类别的经修饰的dntp化合物的一个实施方式；

图17显示了一般类别的经修饰的dntp化合物的另一个实施方式；

图18显示了一般类别的经修饰的dntp结构的另一个实施方式；

图19显示了图17中的属结构[17]上发现的二价接头部分l¹的选择项；

图20a-20f显示了γ-修饰的dctp的具体的实施方式；

图21是用作经修饰的dntp的功能性测试的聚合酶延伸测定的凝胶图像；

图22显示了dbco-peg(化合物[iv])的合成；

图23显示了dbco-peg-单磷酸(化合物[v])的合成；

图24a-24b显示了dc4p-dbco(化合物[viii])的合成；

图25a-25b显示了dctp-pipdma(化合物[x])的合成；

图26a-26b显示了dctp-cy7(化合物[xii])的合成；

图27a-27b显示了dctp-tpmd(化合物[xiv])的合成；

图28a-28b显示了dctp-乳糖(化合物[xvi])的合成；

图29a-29b显示了dctp-peg9(化合物[xviii])的合成；

图30a-30b显示了r¹取代基的两个实施方式，其提供r¹上的正电荷与分子传感器的导电部分的直接相互作用；

图30c-30d显示了r¹取代基的两个实施方式，其提供r¹上的负电荷与分子传感器的导电部分的直接相互作用；

图31a-31d显示了r¹取代基的四个实施方式，其提供r¹上的芳环与分子传感器的导电部分的直接的π-π和疏水性相互作用；

图32a-32b显示了r¹取代基的两个实施方式，其在带有所显示的r¹取代基的经修饰的dntp和分子传感器的导电部分之间提供两种电荷和π-相互作用；

图33a-33b显示了r¹取代基的两个实施方式，其在带有所显示的r¹取代基的经修饰的dntp和分子传感器的导电部分之间提供阴离子电荷或阳离子电荷相互作用；

图34显示了r¹取代基的一个实施方式，其通过创建和断开两个导体之间的导电连接，提供了产生独特的电信号的机制。

图35a显示了经修饰的datp的一个实施方式；

图35b显示了能在分子传感器中共价结合聚合酶和桥分子的特殊拴系物的一个实施方式，其中其能够在纳入期间与各种经修饰的dntp相互作用；

图36描绘了能够在纳入聚合酶期间改变聚合酶的构象变化的经修饰的datp；以及

图37显示了各种经修饰的dntp的化学结构以及用于测试这些修饰的dntp的聚合酶延伸测定的凝胶图像。

具体实施方式

在本公开的各种实施方式中，通过用传感器分析测试溶液中携带的经修饰的dntp的使用来增强基于聚合酶的分子电子传感器的信号传导性能。传感器中的聚合酶耐受许多这样的dntp修饰。在某些方面中，如本文所讨论的，信号增强由通过各种机制产生的经修饰的dntp提供，并且这些机制能用作合理设计这种修饰的模板。

在各种实施方式中，可用于dna测序的分子传感器包含聚合酶，以功能化传感器。传感器还包含导电的桥分子(也被称为“分子导线”)。导电的桥分子的长度可为约10nm。导电的桥分子将偶联的聚合酶“导连”到包括源电极和漏电极和桥接电极对的分子导线(一个分子)的电路。这样的分子导线可包含dna寡核苷酸(“寡”)、蛋白质α螺旋桥、或连接源电极和漏电极的其它生物分子。在某些方面中，与分子导线元件电路偶联的聚合酶完成了传感器中的电流测量电路。聚合酶纳入核苷酸时的电流对比时间的测量产生信号痕迹，其将纳入事件表示为离散的信号尖峰，(例如，电流对比时间的痕迹中的电流尖峰)，通过这些尖峰的详细形状和/或尺寸来区分和识别纳入的不同碱基。处理得到的信号以确定模板的序列。

由这样的分子传感器监测的关键的酶活性是各种脱氧核苷酸三磷酸(或“dntp”)的纳入。本公开的主题一般是该过程的改变，以增强得到的信号，其因此改善基于聚合酶的分子传感器确定dna序列的能力。

dntp

四个具体形式dntp对应于dna的四个碱基/字母，其是datp(腺苷)、dctp(胞苷)、dgtp(鸟苷)和dttp(胸苷)，其仅在碱基组成上不同。此处，分子上的碱基可通过字母来表示(a、c、g、t)，或总体上用“nu”或“nuc”来表示。所有的天然dntp具有三磷酸部分，且三个磷酸基团表示为α、β、和γ，始于与脱氧核糖的5’oh连接的磷酸。在聚合酶催化的dna链延伸中，脱氧核糖和5’α-磷酸位点上的3’oh基团参与纳入和链延伸。四种具体的dntp是dna聚合酶结合到生长链中的化学底物，由模板链引导。该过程的最关键的特征是当延长链的3’oh基团偶联到进入的核苷酸的5’碳-α-磷酸基团时，β-和γ-磷酸基团通过聚合酶的作用一起作为焦磷酸酯基团释放。

天然dntp可被化学修饰但在聚合酶链反应(pcr)期间仍然被聚合酶识别和纳入的程度很大程度上未知。通常，对5'碳/α-磷酸或3'oh基团的修饰是非常有限的，因为这些位点在形成链时参与关键的偶联反应。dntp上的所有其他位点通常允许某种程度的化学修饰。这可能或可能不会导致产生天然形式的dna，这取决于修饰是否位于在纳入期间由聚合酶从dntp释放的β-和/或γ-磷酸基团上，或者碱基、脱氧核糖基团或生长链中保留的α-磷酸上的其他位置。具体实例包括耐受的dntp，其具有附连于碱基的大的染料标记基团(参见waggoner等，nucl.acidsres.(1994)22(16)：3418-3422)。该修饰保留在得到的dna产物中。对γ-磷酸的修饰的具体实例(其中可以连接接头和染料分子而不抑制聚合酶)在fuller等在nucleosides,nucleotides,andnucleicacids，24(5–7)：401–408，(2005)中被发现。该修饰没有保留在得到的dna产物中。通常，染料标记的dntp的纳入已经成为使用光学报道分子策略分析dna的许多方法的基础。

本文公开了广泛类别的dntp修饰。这些修饰通常是β-和/或γ-磷酸，因此修饰不会保留在由经修饰的dntp的聚合酶合成的dna中，尽管本文中的一些修饰也属于α-磷酸基团，并被保留在合成的dna中。在各种实施方式中，这些形式可包含接头，例如从γ-磷酸到信号传导基团。信号组可以包括用于传感器操作的缓冲条件下的带电基团(例如，+1、+2、或-1、-2等)，使得其电荷影响传感器电路中的电流。例如，信号传导基团可以包括磺酸基团(具有-1个电荷的-so3^-)、或季铵取代基(具有+1电荷的-r3n⁺)。与dntp连接的其它信号传导基团可包含染料、糖、多环芳香取代基或其它基团。在某些方面中，接头使得信号传导基团在携带接头和信号传导基团的经修饰的dntp的纳入期间紧密接近传感器的分子桥，从而增强信号影响。对于不同的碱基可以存在不同的信号传导基团，例如以增强信号的碱基区分。经修饰的dntp的化学结构、它们通过合成有机化学方法的合成、以及它们在基于聚合酶的分子传感器中的用途在本文中详述。

已经确定经修饰的dntp在分子传感器大小为10nm时特别有效，如图2所示，以便降低噪声并允许各种dntp提供的电荷改变来影响分子电路的更大部分。出于此目的，分子传感器的尺寸可以在约3nm至约30nm的范围内，在约5nm至约15nm的范围内，或在约6nm至约12nm的范围内。

用于dna测序的示例性的分子电子生物传感器

如本文所用，各种化学化合物可通过阿拉伯数字被标记和识别，(例如，化合物[1]、[2]、[3]等)，其它化合物可通过罗马数字被标记和识别(例如，化合物[vi]、[vii]、[viii]等)。用阿拉伯数字标记的化合物不同于用相等的罗马数字标记的化合物。作为一个实例，化合物[16]和化合物[xvi]是不同的化合物。

如本文所用，为方便起见，可以用简写符号写出具有重复碱基的序列，其中下标整数表示紧接在下标整数之前的特定碱基的总数。例如，简写符号a20-c3-a30-g(seqidno：3)表示序列a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-c-c-c-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-g(seqidno：3)。

图1显示了用于dna测序的分子电子生物传感器的一个实施方式。这里，分子复合物包含诸如聚合酶的酶，其与dna链接合以与敏感电流计形成分子电子电路。传感器的聚合酶与dna模板接合以进行转录，随时间推移个体dntp被纳入，引起电流信号。示例性的信号传导在图1中的电流对比时间图中直接在传感器的示意图下示出。测量的电流信号理想地包含对应于不同dna碱基的独特尖峰，从而确定碱基序列。图1中描绘的实例示出了在电流对比时间的图中由电流尖峰推导出碱基序列gattaca(seqidno：5)。

图2显示了包含聚合酶的分子传感器结构200的实施方式，可用于测试各种经修饰的dntp。分子传感器结构200包含两个电极201和202。电极201和202可在电路中包含源电极和漏电极。电极201和202通过约10nm的纳米间隙分开。可能需要其他间隙距离来容纳其他长度的生物分子桥。在该实例中，桥分子203包括长约20nm的双链dna分子(例如，60个碱基)，在3'和5'端具有巯基204和205，用于将桥分子203偶联到设置在每个金属电极201和202上的金触件206和207。该情况下的探针分子包含聚合酶210，例如，大肠杆菌poli，在共价连接211处与链霉亲和素蛋白212化学交联，其又通过合成dna寡核苷酸203中的生物素化核苷酸与结合位点214偶联。在操作中，传感器200还包括由聚合酶210处理的dna链220。该图近似于分子和原子的相对大小。

图3显示了分子传感器中的各种电子组件和连接的实施方式。在图的上部，显示了电极-基材结构300的横截面，其附接到分析器301，用于施加电压和测量通过传感器的桥分子的电流。在图的下部，显示了可用于桥接电路的电极阵列302的透视图。每对电极包括第一金属(例如，“金属-1”)，以及靠近分离电极的间隙的每个电极端处的第二金属(例如，“金属-2”)的接触点或岛。在其它实例中，金属-1和金属-2可以包含相同的金属。在其它方面中，接触点是金属电极顶部的金(au)岛，包括不同的金属。在各种实验中，接触点包括金(au)珠或金(au)涂覆的电极尖，其支持单个桥分子在电极对之间的每个间隙上的自组装，例如通过巯基-金结合。

图4描述具有可用于桥接的与金接触点的金属电极的电子显微镜图像(a)、(b)和(c)。电极位于硅基材上，例如通过电子束光刻产生。(a)处的图像显示了具有金接触点的钛电极阵列。如图所示，一对电极中的每个电极的宽度约为20nm。(b)处的图像是约7nm的电极间隙的特写，金接触点间隔约15nm。(c)处的图像是单个电极对的进一步特写和纳米间隙的特征。该图清楚地显示电极之间的纳米间隙为约7nm并且金点间距为约10nm。如在em图像中所见，金点位于纳米间隙附近。

用于dna测序应用的经修饰的dntp的使用

图5a显示了在传感器的聚合酶周围的溶液中使用各种标准dntp操作的传感器的示意图。图5a右侧的图示显示了相同的传感器，但在聚合酶周围的溶液中具有经修饰的dntp。在图5a的左侧，分子电子dna序列传感器的实施方式包括安装在桥分子上以完成电子电路的聚合酶，其中通过在溶液中纳入dntp来处理模板产生指示纳入事件和纳入碱基的身份的尖峰。

图5b显示通过使用经修饰的dntp代替标准dntp来改善信号传导。图5b的左侧是在仅涉及天然dntp的分子纳入事件期间记录的电流对比时间的曲线图。如图所示的这种电流尖峰可能难以从噪声中辨别出来并且彼此难以辨别。图5b的右侧是在包括经修饰的dntp的分子纳入事件期间记录的电流对比时间的曲线图。图5b右侧的图显示了经修饰的核苷酸可以增强信号传导，为不同的纳入事件提供更清晰的信号，并提供区分被纳入的不同碱基的信号，从而感应序列。在各种方面中，增强的信号传导可以包括更大的电流尖峰和/或不同的电流尖峰形状。

在一些实例中，对dntp的修饰包括向分子的γ-磷酸添加各种基团。修饰可包括提供形式电荷(例如，+1、-1等)、极性(例如，-c＝o、-oh官能团)、非极性特征(例如，通过使用非极性官能团如-ch2-的疏水性)、空间效应(例如，大型稠环系统)的化学部分。这些和其他化学部分可以与聚合酶上的天然特征，与聚合酶上的工程化特征，与桥分子，或者与聚合酶和桥分子之间键合的分子相互作用。在各种方面中，对dntp的修饰可以将多磷酸电荷从-3(在天然dntp中)扩展到-4、-5、-6、-7、-8或-9，例如，取决于磷酸基团的总数。在某些实施方式中，对dntp的初始修饰可包括在多磷酸链的末端添加点击(click)化学基团，其提供可用于有效合成目标经修饰的dntp的反应性部分(例如，炔基)。

在各种实施方式中，经修饰的dntp可能需要适当的缓冲溶液，其中相对于通常用于聚合酶反应的标准缓冲条件(例如pcr、引物延伸或逆转录反应、或其中这些酶起作用的各种生物有机体中的体内条件)而言对信号增强是有效的。对于某些实施方式，缓冲液改动可以包括改变缓冲液中使用的盐浓度，以改变高盐或低盐条件。在某些实施方式中，盐浓度降低2倍、10倍、100倍、1000倍、1百万倍、直至10亿倍可能是有利的。优点可能是由于减少了溶液中基于盐的电场筛选，或者溶液中德拜(debye)长度的增加，或者由于来自这种较低离子浓度的离子传导的电测量噪声的减少。在其它实施方式中，盐浓度提高降低2倍、10倍、100倍、1000倍、1百万倍、直至10亿倍可能是有利的。

在某些方面中，对传感器系统的改动一般可以增强经修饰的dntp的效果。这些改变可包括但不限于dntp浓度的优化、所用缓冲溶液的性质、所施加的电极和门控电压、以及传感器中使用的聚合酶或突变聚合酶的特定类型。这些改变的任何组合可用于增强经修饰的dntp可能产生的效果。例如，降低缓冲液的离子浓度以扩展经修件的dntp上的带电基团的德拜半径可以通过在纳入事件期间允许dntp对分子桥导体的更大电影响而具有增强效果。

在其他方面，缓冲液可具有酶活性所需的金属多价阳离子的浓度或组成的改变。例如，已知二价阳离子在介导dntp和聚合酶之间的相互作用中起着关键作用。与此相关的缓冲液改变可包括改变mg浓度，或者可包括使用其他金属多价阳离子的浓度，例如二价阳离子如mn、fe、ni、zn、co、ca、cd、ba、sr、cu或cr。在缓冲液中洗涤剂或分散剂的添加对于某些实施方式可能是重要的，以减少或防止经修饰的dntp的聚集，或减少或防止它们与系统中的其他分子聚集。

图6a和6b显示了从包含聚合酶的生物传感器中的天然dntp纳入事件获得的实验测序信号的实施方式。来自聚合酶传感器的这些信号是通过用序列g4a8-g4a8-g4a8-g4a8(seqidno:1)处理模板获得的。信号在实验运行期间显示电流对比时间。图6a还示出了虚线圆圈，其表示图6b中的放大插图。图6b中所示的插图是从大约t＝34秒到大约t＝39秒的曲线图的一部分，其示出了反映所述序列的电信号。增强此类信号将提供更准确的测序。

图7显示了使用经修饰的dntp的结果。在该实施例中，7-脱氮-dgtp(参见图14b)用作经修饰的dgtp。信号获自包含经修饰的7-脱氮dgtp的dna模板{gtca}10-gaaccgaggcgccgc(seqidno：2)。该经修饰的dgtp对模板的c碱基的纳入可能导致增强的信号。

图8描绘了当使用修饰的dntp时测序感应的另一个实施方案。在该实施方式中，信号数据获自使用经修饰的dgtp(图14b的7-脱氮dgtp)时的dna模板{gtca}10-gaaccgaggcgccgc(seqidno：2)。如图8b的插图所示，这对于模板的c碱基的纳入可以导致增强的信号，其中从大约t＝33秒到大约t＝37.5秒的图的部分被放大。图8b显示了可能由于使用经修饰的dgtp而导致gg纳入信号增强的数据解释。

图9描绘了用经修饰的dntp的测序感应的另一个实施方式。该图显示了测序信号数据获自使用经修饰的dgtp(图14b的7-脱氮dgtp)时的dna模板a20-c3-a30-g(seqidno：3)。这种对模板的c碱基的纳入可能导致增强的信号传导。图9示出了数据的解释，其中来自t纳入的信号与经修饰的dgtp纳入的信号相区别，其中t信号是增加的电流，而经修饰的dgtp信号表现为电流的减少。如果这些信号变得卷积，它可以产生所看到的净信号，在更宽的增强电流中间有一个电流下降，作为经修饰的dgtp的效果(参见这些细节的方形插图中的放大图)。

图10描绘了用经修饰的dntp的测序感应的另一个实施方式。该图显示了当使用γ-磷酸修饰的dctp(即dc4p-乳糖(图20f和图28b中的化合物[xvi])和dc4p-cy7(图20b和图26b中的化合物[xii])的等量混合物)时dna模板(gt10-t3-gt10-a3-gt10-c3-gt10)(seqidno：4)的测序信号数据。将这些经修饰的dctp纳入模板的g碱基可以导致增强的信号。图10中的图示出了多个纳入事件上的电流对比时间数据，在t＝20秒附近的数据中被视为电流尖峰。通过使用经修饰的dctp形式，这些信号尖峰高度可能是增强的。

现在参考图11，示出了经修饰的dntp能够增强分子电子传感器中聚合酶活性期间获得的信号的可能机制。可能的机制包括但不限于：(a)增加局部电荷(+或-)以门控电流；(b)在模板结合时减慢聚合酶作用的速度；(c)改变聚合酶的构象，例如，如图所示增加酶的一部分中的手指运动(fingermotion)；和(d)与桥分子直接相互作用以调节电流。在机制(d)中，dntp和桥分子的直接相互作用可以通过从dntp拴系一个适当长度的附件来制作经修饰的dntp来实现，所述经修饰的dntp可以在与聚合酶相互作用的同时牵引拴系的附件与桥分子的直接接触。

在各种实施方式中，公开了在dna测序中使用经修饰的dntp的生物传感器的使用。在dna或基因组测序应用中，例如，桥分子(例如dna寡核苷酸)与聚合酶偶联，聚合酶与引发的单链模板dna结合，并向电子生物传感器提供用于纳入的含有dntp(脱氧核苷酸三磷酸)的缓冲液。当聚合酶掺入各种dntp以合成模板dna的互补链时监测通过桥分子的电流。在各种实施方式中，使用天然或“标准”dntp，包括datp、dctp、dgtp和dttp。然而，在其它方面中，任何或所有这些标准dntp可以由相应的经修饰的dntp代替。

图12显示了标准(“天然”)dntp以及可以对dntp进行各种分子修饰、可以增加dntp的纳入信号，或者说可产生信号与增强的不同碱基(a、c、g、t)纳入事件之间的差异的位置。用于可能的dntp化学修饰的非限制性位点由“星形”表示。星形表示可以制造对dntp的修饰、而不影响dntp被聚合酶纳入和扩展的能力的位点。在各种实施方式中，经修饰的dntp在这些位置包含一个或多个修饰。在图中的左侧，描绘了多磷酸链(例如，α，β，γ)或糖(例如，可用于衍生化的带圆圈的3'oh基团)上的允许位点。dntp左侧的三颗星表示修饰可以在三种磷酸基团中的任何一种上以任何组合形成。在图12的右侧，用星形绘制了两个碱基嘌呤和嘧啶，表明修饰通常允许的位点的位置。例如，在每个dntp的其他位置，嘌呤上的6-和/或7-位可以衍生化，或者嘧啶的2-和/或5-位可以衍生化。在一些实例中，使用7-脱氮修饰。在各种示例中，提供了确定模板序列的更高精确性(例如，如图5a和5b所示)。

根据本公开的dntp修饰的非限制性实例显示在图13至20中。dntp修饰包括但不限于：碱基的修饰例如产生7-脱氮形式或8-溴形式，α-或β-磷酸基团的修饰例如产生这些磷酸的硫醇化形式或溴化衍生物，或γ-磷酸修饰(包括添加额外的磷酸基团)例如形成来自原始三磷酸基团的四-、五-或六-磷酸、或甚至更长的磷酸链。聚合酶对添加到γ-磷酸中的许多不同基团具有高度耐受性。通过在三磷酸链的末端添加另一个基团来修饰dntp提供了一大类经修饰的dntp，例如图13至20和本公开中所述的那些。

例如，图13a，13b，13c和13d是经修饰的dntp的实施方式，其用于在基于聚合酶的分子传感器中增强纳入事件的信号。图13a是嘌呤的6位氯取代的实例。图13b是三磷酸的α-磷酸基团的亚砜衍生化的实例。图13c是嘧啶的2-位亚砜衍生化的实例。最后，图13d是在嘧啶的5-位上的溴取代的实例。

可用于从包含聚合酶的生物传感器增强信号的经修饰的dntp的其它实例在图14a和14b中列出。所示的经修饰的dntp是“脱氮”嘌呤，意味着嘌呤中的氮原子7-氮被碳原子取代(在这些实例中，在“星形”的位置)。图14a显示了7-脱氮-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸的化学结构。图14b显示了7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的化学结构。这些分子被描述为四锂盐，尽管其他盐(包括混合盐)可以通过聚合酶在纳入事件中用作经修饰的dntp。

图15a、15b和15c描绘了经修饰的dntp的其它实例，其在标准dctp的三磷酸的γ-磷酸处包含各种衍生化。这些修饰的化合物各自具有添加到γ-磷酸的特征基团，每个都延伸到具有各种醚连接键(例如peg)的六磷酸，作为从六磷酸链中的末端磷酸基团延伸的栓系物。图15a的化合物还包含dbco部分，其可用于使用“点击化学”进一步衍生化。dbco(或adibo)是取代基氮杂二苯并环辛炔(azadibenzocyclooctyne)的首字母缩写，其可以在图15a的分子的最左侧看到。图15a中的化合物通过合适的dbco-peg接头与六磷酸修饰的dctp反应获得。点击化学的试剂可从加利福尼亚州圣地亚哥市broadpharm和其他供应商处获得。然后，氮杂环辛烷环中的炔基三键可用于进一步衍生图15a的化合物(例如以产生图15b和15c的化合物)。

由于peg部分和脱氧核糖部分之间存在六磷酸基团，图15a中描绘的修饰的dctp携带-6的电荷。分子顶部的“+”符号和箭头表示分子中加入天然dctp分子的部分。

图15b中描绘的经修饰的dctp衍生自图15a中的化合物，其通过氮杂环辛炔上的三键与适当取代的叠氮化物的反应形成如图所示的三唑-氮杂环辛烷稠环系统。

此外，图15c中描绘的经修饰的dctp衍生自图15b中的化合物，其通过与适当取代的酰胺反应，将季铵化的部分置换为中性离去基团。

使用经修饰的dntp(例如图13a-13d，图14a和14b以及图15a-15c等中所示的那些)从基于聚合酶的传感器增强信号的一个好处是模板dna、合成的dna或dntp的标记不是必需的，使用任何其他可检测的标记也不是必需的。另一方面，本文中经修饰的dntp的使用改变了聚合酶-桥复合物的导电性质，从而直接增强了在酶活性期间由复合物产生的得到的信号。这是相对于其他标记方法的益处，其中检测标记的方法主导、约束、复杂化或限制了这些方法。

使用代表性的经修饰的dntp与图1-4的分子电子测序传感器的具体实验显示在图7、8和9中(举例说明使用脱氮-经修饰的dgtp)，并在图10(举例说明使用γ-磷酸经修饰的dctp-cy7和dctp-乳糖)中示出。

在本公开的各种实施方式中，化学性修饰的dntp的使用增强可包含聚合酶的分子电子传感器的电信号参数。

在其他实施方式中，经修饰的dntp可能仅在还包括使用特定的天然或突变或化学修饰的聚合酶、或使用适当的缓冲液、或使用适当的桥分子的系统中实现有益或更高水平的信号增强。

在各种实施方式中，包含经修饰的dntp并提供给传感器的测试溶液中的缓冲液的ph和/或化学组成可影响经修饰的dntp上的各种基团上的电荷，如磷酸基团，其他可电离基团如磺酸基团，或可被质子化的胺基团。例如，经修饰的dntp上的磷酸基团可以全部带负电，或者可以部分或完全质子化为-oh基团。根据本公开，三-、四-、五-、六-等磷酸链中的各种磷酸基团可以显示为盐、部分盐、或每种磷酸基团在各种附图中质子化为-oh基团。理解是在附图中描绘的多磷酸链上的电荷没有限制，并且各种磷酸基团可以全部带负电/部分质子化或完全质子化(产生所有-oh基团)。此外，任何带负电荷的磷酸基团氧原子上的抗衡离子也不受限制，并且可以是任何m⁺种类(例如，li⁺)、m²⁺种类(例如，mg²⁺)或任何铵盐(例如，r3nh⁺)。类似地，磺酸基团可以以其酸形式(-so3h)或作为去质子化的磺酸根阴离子(-so3^-)显示。

在各种实施方式中，dntp修饰、聚合酶修饰、缓冲液改动和桥分子的适当组合可以产生理想的信号增强。类似地，用于信号增强的经修饰的dntp能够通过使用这种经修饰的聚合酶、改动的缓冲液或经修饰的桥来潜在地提供额外的增强。本公开的另一个好处是，相对于经修饰的dntp的各种实施方式，可以通过优化这些其他主要系统参数实现额外的信号增强。

图16、17和18显示了经修饰的dntp的一般类别，该dntp可用于包含聚合酶的生物传感器中的增强的信号传导。在这些一般化合物[16]、[17]和[18]中分别发现的各种取代基基团被独立地选择，并且这些取代基的选择对于特定的核苷酸碱基(“nuc”)可以是不同的，以便在dna测序应用中产生的电信号中提供碱基区分。在各种方面中，取代基(r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、l¹、l²、和y，如化合物[16]，[17]和[18]中所述)可被独立地选择，以产生能够根据以下机制的任何一个或组合提供增强的信号传导的dntp：

(1)通过取代基上的负电荷或正电荷与分子传感器的导电部分的直接相互作用。具体实施方式在图30a-30d中非限制性地示出；

(2)通过由一个或多个取代基提供的芳环与分子传感器的导电部分的直接的π-π和疏水性相互作用。具体实施方式在图31a-31d中非限制性地示出；

(3)通过例如与n-烷基-吡啶鎓(正)取代基或芘磺酸根(负)取代基的电荷和π-π相互作用。具体实施方式在图32a和32b中非限制性地示出；

(4)通过r¹的电化学还原和氧化(例如，用于可逆氧化的基团，例如二茂铁或氢醌)。具体实施方式在图33a和33b中非限制性地示出；

(5)当r¹含有导电分子组件如石墨烯纳米带、聚噻吩聚合物或聚芳烃环带结构，且传感器包含两个不连续的导体(每个连接到不同的金属电极)时，通过创建和断开两个导体之间的导电连接。具体实施方式在图34中非限制性地示出；

(6)当r¹是在磷酸末端附近较窄而在另一端较宽的长的、刚性的分子时，通过较宽末端与导体的立体相互作用，其从聚合酶向导体伸出接头，以取决于r¹的长度的方式改变接头和导体之间的相互作用。在各种方面中，接头将包含多个基团，例如可以与导体结合并在结合或解离时改变电导率的芳环。对于接头上的多个基团，可能观察到对于短接头没有基团从导体解离、对于中间长度的接头有一些基团的部分解离、而对于足够长的接头的基团的完全解离——每个具有不同的电信号。r¹的刚性和较宽末端确保当分子结合时导体与聚合酶接触并被推开，从而在足够长的r¹处发生基团的部分或完全解离。导体和聚合酶之间的r¹和接头具体的实施方式在图35a和35b中非限制性地示出；

(7)间接地，通过改变经修饰的dntp纳入期间的聚合酶的构象变化。在各种实施方式中，r¹可以与dntp或dna结合位点附近的聚合酶上的特定位点结合，或者可以改变接头与聚合酶的相互作用。取代基n和y的变化也可以影响聚合酶中构象变化的时间依赖性或动力学，当电极之间的电导率对构象变化敏感时，这可以放大信号。dntp衍生物结构的具体实例在图36a和36b中非限制性地示出。

当呈现和讨论经修饰的dntp的特定种类时，将进一步理解各种取代基选择。

参考图16中的一般化学结构[16]，nuc代表dna碱基，如未修饰的a、t、c或g，且n是≥2的整数，以产生包含三-、四-、五-、六-以及之后的磷酸链长的许多种化合物。y可以是dntp的天然氧或耐受的替代物，如硫、硼或碘。冠状物中最后一个磷酸基团的末端基团r¹可以包含任何能够实现上文数值和本文讨论的数量上列举的至少一种功能类别的取代基。n、y和r¹的选择是独立的，并且对于每个核苷酸碱基可以是不同的，以便在dna测序应用中产生的电信号中提供碱基区分。在化合物[16]中，r¹是选自h、烷基(例如，线性或分支的c1-c5)、环烷基(例如，c3-c8)、-(ch2ch2o)xme(其中x是1至约20的整数)、或芳基，其中任何烷基被支化至任何程度，并且任何烷基、环烷基或芳基取代基任选地被卤素、me或ome取代；y＝oh、sh或bh3，条件是如果y＝o且n＝2，则r¹不是h，(换句话说，化合物[16]的范围不包括天然dntp)。

经修饰的dntp的类

图17显示了另一个一般类别的用于包含聚合酶的分子传感器中的信号增强的经修饰的dntp。这些化合物[17]允许y对dna骨架的修饰，n≥1的多磷酸链，和具有连接/结合二价基团l¹和l²的一般基团r¹，以及通过取代基r³的另外的允许的修饰。在化合物[17]中，r¹选自h、烷基(例如，线性或分支的c1-c5)、环烷基(例如，c3-c8)、-(ch2ch2o)xme(其中x是1至约20的整数)或芳基，其中任何烷基支化至任何程度，并且任何烷基、环烷基或芳基取代基任选被卤素、me或ome取代。同样在化合物[17]中，y＝oh、sh、或bh3，且nuc是dna碱基如未经修饰的a、t、c、或g。此外，对于化合物[17]，二价部分-l¹-和-l²-任选且独立地为共价键，接头/间隔物如-(ch2)q-(其中q是1至约10的整数)、-ch2ch2(och2ch2)y-(其中y是1至约8的整数)、-(ch2)q-o-(ch2ch2o)y-ch2-(其中q是1至约10的整数且y是1至约8的整数)、-co(ch2)r-(其中r是1至约10的整数)、-coch2ch2(och2ch2)z-(其中z是1至约6的整数)、-coch2ch2conh(ch2)m-(其中m是1至约6的整数)、-coch2ch2conh(ch2ch2o)pch2ch2-(其中p是1至约6的整数)、1,4-苯二基、1,3-苯二基、或1,2-苯二基，碳原子任选地且独立地被卤素、me、et、oh、ome或cf3取代，且任意碳原子任选地且独立地被氮原子置换。

继续参考图17中的化学化合物[17]，l¹和/或l²可以包含可以通过“点击化学”形成的基团，例如1,2,3-三唑环(例如，由炔烃+叠氮化物形成)。1,2,3三唑可任选地与一个或多个另外的环稠合，优选包括8元环/三唑稠合。在化合物[17]中，末端冠状物基团r²选自烷基(例如，线性或分支的c1-c20)、环烷基(例如，c3-c12)、芳基(包括多至10个环的多环取代基)、杂芳基(包括多至10个环的多环取代基)、二茂铁、低聚噻吩、杂芳基-烷基、芳烷基、任选地且独立地被卤素、烷基(线性或分支的c1-c10)、o-烷基(线性或分支的c1-c10)、cf3、chf2o、rso2、胺、或酰胺取代。r²还包括寡糖，如各种环糊精，任选地被o-烷基(线性或分支的c1-c10)、o-苄基、o-硫酸根、甲基-(peg)n(其中n为约1至约20)或-o2c-烷基(线性或分支的c1-c8)取代。r³选自h或卤素如f。

图18描绘了表示另一类可用于在基于聚合酶的生物传感器中增强的信号传导的经修饰的dntp的一般化合物[18]。在这些化合物[18]中，酮(或者醛)和烷氧基胺化学用于形成各种分子。化合物[18]允许y取代作为dna骨架的修饰，n>1的磷酸链，以及具有连接/结合基团l²的一般基团r¹，以及允许额外的修饰的r³，和一对基团r⁵和r⁴。尤其是，这些形式可在酮(或醛)和烷氧基胺化学用于形成分子时获得。

现在参考一般结构[18]，r¹选自h、烷基(例如，线性或分支的c1-c5)、环烷基(例如，c3-c8)、-(ch2ch2o)xme(其中x是1至约20的整数)或芳基，其中任何烷基支化至任何程度，并且任何烷基、环烷基或芳基取代基任选被卤素、me或ome取代。r³选自h或卤素。而且在化合物[18]中，y＝oh、sh、或bh3，且nuc是dna碱基如未经修饰的a、t、c、或g。化合物[18]的r⁴和r⁵独立地选自h、烷基(例如，线性或分支的c1-c20)、环烷基(例如，c3-c12)、芳基(包括多至10个环的多环取代基)、杂芳基(包括多至10个环的多环)、二茂铁、低聚噻吩、杂芳基-烷基、芳烷基、任选地且独立地被卤素、烷基(线性或分支的c1-c10)、o-烷基(线性或分支的c1-c10)、cf3、chf2o、rso2、胺、或酰胺取代。r⁴和r⁵还独立地包括寡糖，如各种环糊精，任选地被o-烷基(线性或分支的c1-c10)、o-苄基、o-硫酸根、甲基-(peg)n(其中n为约1至约20)或-o2c-烷基(线性或分支的c1-c8)取代。

继续参考图18和属化合物[18]，根据化合物[17]中的l¹和/或l²选择l²。在各种实施方式中，-l²-选自共价键，接头/间隔物如-(ch2)q-(其中q是1至约10的整数)、-ch2ch2(och2ch2)y-(其中y是1至约8的整数)、-(ch2)q-o-(ch2ch2o)y-ch2-(其中q是1至约10的整数且y是1至约8的整数)、-co(ch2)r-(其中r是1至约10的整数)、-coch2ch2(och2ch2)z-(其中z是1至约6的整数)、-coch2ch2conh(ch2)m-(其中m是1至约6的整数)、-coch2ch2conh(ch2ch2o)pch2ch2-(其中p是1至约6的整数)、1,4-苯二基、1,3-苯二基、或1,2-苯二基，碳原子任选地且独立地被卤素、me、et、oh、ome或cf3取代，且任意碳原子任选地且独立地被氮原子置换。而且，l²可以包含可以通过“点击化学”形成的基团，如1,2,3-三唑环(例如，由炔烃+叠氮化物形成)，且可包含图19中针对l¹描述的选择项。

图19说明了可用于图17中的化合物[17]的二价接头取代基l¹的非限制性实施方式。这些选择项也是图18化合物[18]中l²的可能。如图所示，各种实例包括两种不同的三唑/二苯并氮杂环辛烷稠合环系统[19a]和[19b]，以及三唑/环辛烷/环丙烷稠合环系统[19c]。如所讨论的，这些和其他结构中的三唑可以通过叠氮化物环中的叠氮化物和炔基部分之间的反应形成，例如点击化学中所例示的。

基于dctp的经修饰的dntp的各种实施方式如图20a-20f所列出的。图20b-20f所示的实施方式还包括1,2,3-三唑部分。这些示例性的经修饰的dctp仅出于说明的目的而示出，并不意味着限制本文公开的经修饰的dntp的范围。例如，这些dntp可以基于除dctp之外的其他dntp，和/或可以包含不同的附属物，如任何重复单元(-(ch2)x-、peg、聚磷酸酯/盐等)的其他链长。图20a-20f中的化合物包含特定的c-四磷酸酯，通过dbco点击化学接头将不同的基团添加到末端磷酸酯中。图20b和图20f分别进一步举例说明用于产生图10的电流对时间图的传感器实验中的化合物dctp-cy7和dctp-乳糖中的γ-磷酸修饰。在这些经修饰的dntp中添加的各种基团提供不同的电荷(dbco、cy7、pipdma)、不同的大小(例如分子长度)(peg9)和不同的极性形式(tpmd、乳糖)。

聚合酶延伸功能测定显示聚合酶可以纳入这些和其他经修饰的dntp。图21显示了来自这种聚合酶延伸测定的凝胶图像。为了得到该结果，将引发的单链模板与聚合酶和不同的dntp混合物一起孵育。如果酶可以纳入并扩展dntp，则产生双链dna产物，并在相应的凝胶泳道中产生条带。该引物延伸测定的实验条件如下：

模板：1μm单链模板dna，引物退火；

模板序列：(70个碱基，聚actg)：5'-cgccgcggagccaagactgactgactgactgactgactgactgactgactgactgttgcatgtcctgtga-3'(seqidno：6)；

引物序列：(15个碱基)：5'-tcacaggacatgcaa-3'(seqidno：7)

缓冲液：10mmtris，10mmmgcl2，50mmnacl；

dntp浓度：每种核苷酸2.5mm，总dntp浓度10μm；

酶：5个单位的klenow外切-；

条件：37℃孵育30分钟；

成像：tae中3.5％琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色。

泳道如下面的数字键所描绘。泳道4显示来自天然dntp的产物。泳道6使用4种经修饰的dntp。泳道7、8和9显示了三种γ-磷酸修饰物。因此，所有经修饰的dntp测试产生dna产物。泳道5使用不能扩展的终止子核苷酸(ddntp)，结果是没有产物/没有带作为阴性对照。泳道2和3也是阴性对照，没有延伸所需的所有反应物。泳道10和11是进一步的阴性对照。

聚合酶活性测定中泳道的关键如下：

1–100个碱基dna尺寸梯标

2–仅限dna(无聚合酶或dntp)

3-仅dna+klenow聚合酶(无dntp)

4-4个dntp(天然形式)

5-4个ddntp(双脱氧终止剂)

6-4个经修饰的dntp

5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸

7-脱氮-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸

7-脱氮-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸

2-硫代胸苷-5'-三磷酸(2硫代dttp)

7–dc4p-dma，其它dntp天然

8–dc4p-dbcp，其它dntp天然

9–dc4p-cy7，其它dntp天然

10–dc4p-dma+仅klenow聚合酶，无模板dna

11–仅dc4p-dma，无聚合酶

12–低分子量dna尺寸梯标

图21中的聚合酶活性测定显示这些形式中的三种与聚合酶作用。图21中所示的测定还证明来自图13a-13d和图14a-14b的经修饰的dntp中的4个也是有功能的。如果所讨论的聚合酶是逆转录酶聚合酶，则非常类似的考虑适用于rna的测序。

各种实施方式的合成概述于下面的合成有机化学部分：

合成有机化学

本文公开了用于生产各种经修饰的dntp的化学合成，包括合成图20a-20f中所示的经修饰的dntp。这些分子中的三种的功能性在图21中所示的延伸测定结果中说明，其显示聚合酶可以纳入并延伸这些分子。进一步注意到，尽管下面的这些分子是通过dbco介导点击化学的过程得到的，以将基团添加到主要分子产物，但是其它点击化学可以类似地用作这种分子家族的基础。

dbco-peg-oh的合成(化合物[iv])

关于dbco-peg-oh(化合物[iv])的合成，参见图22。

在室温下，向2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇(化合物[i]，0.267g，1.789mmol)在2ml无水dcm中的溶液中缓慢加入dbco-nhs(化合物[ii]，0.24g，0.596mmol)在2ml无水dcm中的溶液。添加完成后，将反应溶液在室温下搅拌2小时。hplc表明琥珀酰亚胺完全消失。将反应在-20℃的冰箱中保持在黑暗中。第二天早上，将反应溶液升温至室温并用3mldcm稀释。加入硅胶(5g)，并将浆料在旋转蒸发器中蒸发至干。将残留的粉末加载到isco装载柱上，并通过柱色谱(12g硅胶柱，5-20％甲醇/dcm)纯化，得到0.2gdbco-peg-oh(化合物[iv])。产率：77％

¹hnmr(499mhz,氯仿-d)δ7.65(dd,j＝7.6,1.3hz,1h),7.53–7.42(m,1h),7.42–7.17(m,6h),6.41(t,j＝5.7hz,1h),5.12(d,j＝13.9hz,1h),3.75–3.49(m,10h),3.44(dddd,j＝28.0,10.0,6.3,4.0hz,2h),3.36–3.21(m,2h),2.78(ddd,j＝16.8,8.5,6.2hz,1h),2.41(ddd,j＝14.8,8.5,6.1hz,1h),2.16(dt,j＝15.1,6.2hz,1h),2.01–1.86(m,1h).

质量：计算c25h28n2o5，[m]：436.20，观察到：[m+23]459.5，正质量

hplc：10分钟ht-lc-ms方法，产物保留时间：6.5分钟。

dbco-peg-单磷酸的合成(化合物[v])

关于dbco-peg-单磷酸(化合物[v])的合成，参见图23。

将dbco-peg-oh(化合物[iv]，35.8mg，0.082mmol)与无水乙腈(2×1ml)共蒸发，然后溶解在磷酸三甲酯(0.42ml)中。将磷酰氯(pocl3，16μl，0.64mmol)加入到该冷却的搅拌溶液中，并将反应混合物搅拌2小时。将该反应混合物在5分钟内逐滴加入到三丁基焦磷酸铵(1当量，0.082mmol，0.5m溶液，在无水dmf中)中，并加入三丁胺(76mg，0.41mmol)并搅拌60分钟。加入5mlteab(0.1m)缓冲液以淬灭反应。在真空下除去溶剂，将得到的残余物在冰箱中保持过夜。第二天早上，通过c18isco柱(15.5gc18柱，0-100％乙腈/0.1mteaa的水溶液)纯化残余物，得到约45mg化合物[v]。残留的三甲基磷酸酯阻止了任何有意义的nmr光谱。化合物[v]直接用于合成化合物[viii]的下一步骤。

hplc：10分钟ht-lc-ms方法，起始原料dbco-peg-乙醇的保留时间：6.5分钟：产物保留时间：一组三个峰：5.0分钟，5.2分钟和5.5分钟。

质量：计算c25h31n2o14p3，[m]：676.4，观察到：[m-1]675.3，负质量。

dc-p4-点击的合成(化合物viii)

关于dc-p4-点击(化合物[viii])的合成，参见图24a-24b。

将dbco-peg-单磷酸(化合物[v]，45mg，0.06mmol)与无水乙腈(2×1ml)共蒸发，然后溶解在无水dmf(1.0ml)中。加入羰基二咪唑(化合物[vi]，4当量，38.7mg，0.24mmol)，将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后加入甲醇(6当量，14.7μl)并继续搅拌30分钟。向反应混合物中加入dctp(双)三丁基铵盐(70.2mg，0.084mmol)在0.5mldmf和mgcl2(57mg，0.6mmol)中的溶液。将所得混合物搅拌过夜。第二天早上，hplc表明从极性较小的原料dbco-peg-三磷酸转变为极性更大的反应产物。通过isco上的反相c18柱(15.5gc18柱，0-100％acn/0.1mteaa，在hplc级水中)纯化粗产物。在hplc级水中有约30-40％acn/0.1mteaa洗脱的一组峰。收集前两个级分p1(f26+f27)，除去溶剂，并将残余物在真空下干燥，得到9.2mg化合物[viii]。收集中间级分p2(f28+f29)，除去溶剂，并将残余物在真空下干燥，得到额外的10.7mg化合物[viii]。收集后两个级分p3(f30+f31)，除去溶剂，并将残余物在高真空下干燥，进一步得到6.5mg化合物[viii]。按质量计，第一个峰主要是d-c-p4-点击，第二个峰是d-c-p4-点击和d-c-p5-点击的痕迹，d-c-p6-点击和d-c-p7-点击的混合物。

hplc：10分钟ht-lc-ms方法，起始物质的保留时间：一组三个峰：5.0分钟，5.2分钟和5.5分钟。产物cp4-点击的保留时间：4.8分和4.9分钟，两个峰。

¹hnmr(500mhz,氧化氘)δ7.96(t,j＝8.5hz,1h),7.66(d,j＝7.4hz,1h),7.60–7.30(m,7h),6.33(t,j＝6.7hz,1h),6.15(q,j＝7.8hz,1h),5.09(d,j＝14.4hz,1h),4.78(s,100h),4.67–4.53(m,1h),4.21(d,j＝5.0hz,4h),4.13(d,j＝7.1hz,2h),3.83(d,j＝14.4hz,1h),3.75(q,j＝7.1,6.0hz,2h),3.69(q,j＝6.5,5.2hz,2h),3.63–3.54(m,2h),3.47(dt,j＝10.6,5.3hz,1h),3.38(dq,j＝11.3,5.9hz,1h),3.24–3.05(m,54h),2.53(dt,j＝15.5,5.8hz,1h),2.44–2.32(m,1h),2.24(tdq,j＝20.8,14.3,7.0hz,4h),1.91(d,j＝1.2hz,9h),1.26(td,j＝7.4,1.0hz,82h).

磷nmr：-11.0(m，积分100)，-22.4(m，积分100)。

质谱。m＝965负离子：计算m-h：964.6观察到：964.3。

dc-p4-pip-dma的合成(化合物[x])

关于dc-p4-pip-dma(化合物[x])的合成，参见图25a-25b。

将mir96-in-1-叠氮化物(化合物[ix]，3.7mg，6.28μmol)和dc-p4-点击(化合物[viii]，7.5mg，5.9μmol)在0.3ml的1:1水/乙腈中混合，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。hplc表明原料dcp4-点击消失，并形成一些新的极性较小的产物。粗物质表明形成了所需的化合物[x]。除去溶剂，将残余物真空干燥，得到8.6mg粗化合物[x]。

hplc：10分钟ht-lc-ms方法，起始物质dcp4-点击的保留时间：4.8和4.9分钟，两个峰，mir96-叠氮化物的保留时间：9.6分钟，点击加合物的保留时间：5.49分钟。

¹hnmr(500mhz,甲醇-d4)δ8.12(d,j＝7.3hz,1h),8.01(dot,j＝8.7,3.2hz,3h),7.60(d,j＝7.5hz,1h),7.51(dd,j＝20.4,11.8hz,4h),7.43–7.20(m,2h),7.16(d,j＝8.1hz,1h),7.02(d,j＝9.3hz,1h),6.38–6.19(m,1h),6.02(t,j＝16.7hz,0h),5.85(d,j＝16.2hz,0h),4.67–4.51(m,1h),4.51–4.21(m,3h),4.07(s,2h),3.78(t,j＝7.4hz,1h),3.73–3.32(m,9h),3.27–3.07(m,25h),3.09–2.70(m,6h),2.66(s,1h),2.33(q,j＝9.4,8.5hz,1h),2.27–1.95(m,3h),1.82–1.53(m,2h),1.54–1.35(m,18h).

磷nmr：-10.63(m，积分100)，-22.06(m，积分108)。

质量：m＝1554.4负离子：计算m-1：1553.4是m-1，观察到：1552.8计算m+na-2h：1575.4观察到：1574.8。

dcp4-cy7的合成(化合物[xii])

关于dcp4-cy7(化合物[xii])的合成，参见图26a-26b。

将cy7-叠氮化物(化合物[xi]，5.0mg，4.37μmol)和dcp4-点击(化合物[viii]，7.5mg，5.9μmol)在0.3ml的1:1水/乙腈溶液中混合，并在室温下搅拌过夜。hplc表明原料dcp4-点击消失，并形成一些新产物。在反应混合物中仍存在一些过量的cy7-叠氮化物[xi]。粗物质表明形成了所需产物。除去溶剂，将残余物真空干燥，得到7.3mg化合物[xii]。

hplc：10分钟ht-lc-ms方法，起始物质dcp4-点击的保留时间：4.8和4.9分钟，两个峰，cy7-叠氮化物的保留时间：4.59分钟，点击加合物的保留时间：4.48分钟。

¹hnmr(500mhz,甲醇-d4)δ7.96–7.76(m,1h),7.74(d,j＝1.7hz,1h),7.67–7.42(m,1h),7.41–7.21(m,2h),7.17–7.01(m,1h),6.42(d,j＝14.0hz,1h),4.53(d,j＝37.3hz,1h),4.38–3.99(m,3h),3.80–3.40(m,3h),3.28–3.11(m,17h),3.08–2.97(m,1h),2.94(t,j＝6.8hz,2h),2.78(t,j＝6.4hz,2h),2.60–2.43(m,1h),2.21(p,j＝7.1hz,3h),2.11–1.97(m,1h),1.74(p,j＝6.8hz,1h),1.22(t,j＝4.3hz,6h).

磷nmr：可获得的材料太少以至于不能获得合理的磷nmr。信号很弱。然而，从质谱数据可以看出所需产物。

质量：m＝2021.9负离子计算m-6h+5na：2130.9观察到：2134负质量。正离子计算m-3h+5na：2132.9.观察到：2136正质量。(注意：13c和2h增加观察到的质量)。

所有hplc均在10分钟内进行：ht-lcms法以乙酸铵为添加剂。溶剂：乙腈和含25mm乙酸铵的水。方法：0-0.5分钟：5％乙腈/水，0.5-6.5分钟：5-95％乙腈/水，6.5-9分钟：95％乙腈/水，9-9.5分钟：95％-5％乙腈/水，9.5-10分钟：5％乙腈/水。

dcp4-tpmd的合成(化合物[xiv])

关于dcp4-tpmd(化合物[xiv])的合成，参见图27a-27b。

将tmpd-叠氮化物-2hcl(化合物[xiii]，2.28mg，8.85μmol)和dcp4-点击(化合物[viii]，7.5mg，5.9μmol)在0.38ml的1:1水/乙腈中混合，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。除去乙腈，将浓缩的物质直接加到4gc18柱上，用0-100％acn/0.1mteaa水溶液纯化。用水中约32％acn/0.1mteaa洗脱观察到大的峰。从洗脱液中除去溶剂，并将残余物在真空下进一步干燥，得到4.9mg化合物[xiv]。

dcp4-乳糖的合成(化合物[xvi])

关于成dcp4-乳糖(化合物[xvi])的合成，参见图28a-28b。

将2-叠氮基乙基-β-d-吡喃乳糖苷(化合物[xv]，3.23mg，10.4μmol)和dcp4-点击(化合物[viii]，10mg，7.86μmol)在0.5ml的1:1水/乙腈中混合，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。除去乙腈，将浓缩的物质直接加载到4gc18柱中，用0-100％acn/0.1mteaa水溶液纯化。在水中约25％acn/0.1mteaa洗脱中观察到大的峰。从洗脱液中除去溶剂，并将残余物在真空下干燥，得到10.4mg化合物[xvi]。来自ht实验室的质谱证实观察到期望的质谱。hplc表明产物与原料dcp4-点击[viii]具有不同的保留时间。

dcp4-peg9的合成(化合物[xviii])

图29a-29b显示了dctp-peg9(化合物[xviii])的合成。

将peg9-叠氮化物(化合物[xviii]，3.4mg，8μmol)和dcp4-点击(化合物[viii]，7.5mg，5.9μmol)在0.38ml的1:1水/乙腈中混合，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。除去乙腈，将浓缩的混合物直接加到4gc18柱上，用0-100％acn/0.1mteaa水溶液纯化。用水中33％acn/0.1mteaa洗脱观察到大的峰。除去溶剂后，在真空下干燥2小时，得到5.0mg化合物[xviii]。质谱证实了化合物[xviii]的身份。hplc显示与起始材料dcp4-点击[viii]不同的保留时间。

经修饰的dntp的进一步的实施方式和考虑因素

现在参考图30a和图30b，描绘了在dntp末端提供正电荷的r¹的实例。这些示例性r¹部分中的任一个可以用于一般结构[17]、[18]或[19](参见图16-19)。通过r¹上的正电荷与分子传感器的导电部分(例如桥分子)的直接相互作用，这些r¹选择项为纳入事件提供独特的电信号的产生。在图30a中，正电荷是ph依赖性的，并且通过质子化，它们位于叔氮原子中的任一个或两个上，如以下部分结构所示：

类似地，在图30b中，dntp的r¹基团上的正电荷是ph依赖性的，并且通过质子化，其位于叔氮上，如以下部分结构所示：

现在参考图30c和图30d，描绘了在dntp的信号传导末端提供负电荷的r¹的实例。这些示例性r¹部分中的任一个可以取代到一般结构[17]、[18]或[19](参见图16-19)中。通过r¹上的负电荷与分子传感器的导电部分(例如桥分子)的直接相互作用，这些r¹选择项提供独特的电信号的产生。当磺酸基团去质子化为磺酸根阴离子(即so3^-)时，图30c中的r¹部分提供单个负电荷。类似地，当所有四个磺酸基团各自去质子化成为它们各自的磺酸根阴离子时，图30d中的r¹部分能够提供4个负电荷，认识到吲哚中的季铵化氮携带有永久正电荷，并且当在合适的缓冲液中携带时，整个分子携带最多-3个电荷。在各种缓冲条件下，携带图30d的r¹取代基的经修饰的dntp可具有0、-1、-2或-3的总电荷。

图31a-31d示出了r¹的四个单独选择项，其提供了r¹上的芳环与分子传感器的导电部分(例如桥分子)的通过直接π-π和疏水相互作用产生独特电信号的机制。通常，这些取代基包括芳族环系(苯、萘、蒽等)与主要包含peg单元的拴系物的组合。拴系物的长度可以通过单元的加或减来调节，如当通过聚合酶纳入经修饰的dntp时，优化芳香族信号传导基团与传感器的传导部分相互作用的可能性。

图32a-32b示出了r¹的另外两个选择项，其提供了通过电荷和π相互作用产生独特电信号的机制。图32a中的实例包括n-烷基吡啶鎓部分(正电荷)，而图32b中的实例包括芘磺酸根部分(负电荷)。

图33a示出了r¹的选择项，其提供了通过电化学氧化产生独特电信号的机制。在该实施例中，r¹上的1,4-苯醌部分可还原成相应的阴离子，当通过聚合酶纳入这种经修饰的dntp时，其可以与传感器的传导部分相互作用。类似地，图33b示出了r¹的选择项，其提供了通过电化学氧化产生独特电信号的机制。在该实施例中，r¹上存在二茂铁(fe(n⁵-c5h5)2)部分经过单电子氧化还原过程到二茂铁阳离子([cp2fe]^●+，当这种经修饰的dntp被聚合酶纳入时，它可以与传感器的传导部分相互作用。

图34显示了图16中化合物[16]的r¹基团的选择项。看待该取代基的另一种方式是图18中化合物[18]的r⁴、r⁵、l²和r¹的组合。该取代基纳入经修饰的dntp中，通过在两个电极之间产生和断开导电连接，提供了产生独特电信号的机制。图34中的取代基包括长的导电聚噻吩聚合物部分(其长度取决于整数n＝1至100)。据推测，在没有任何经修饰的dntp的情况下，组合了聚合酶和桥分子的结构允许非常小的电流在源电极和漏电极之间流动。还假设存在到电极的左和右导电路径，使得当适当导电的聚合物跨越时，将提供可区别性更高的电流。目的是使输入的经修饰的dntp通过所示的r¹基团瞬时提供该导电聚合物连接。换句话说，当在纳入事件期间，图34中所示的r¹的导电聚合物部分跨越桥的非导电区域时，可以闭合开放电路(包括聚合酶、桥分子和电极)。因此，图34描绘了一种合适的导电聚合物家族，其可用于在纳入事件期间闭合开放电路。在r¹的各种实施方式中，n可以是1至约100的整数，例如r¹的长度为约0.5nm至约50nm。在其它实施方式中，可以选择n，使得r¹的长度为约1nm至约20nm。

在各种实施方案中，桥分子可以有意地包含绝缘连接，例如在桥分子与聚合酶连接的分支点处的环己烷-1,4-二基。在dntp结合到活性位点期间，在纳入之后、或在两个时间上(取决于整数n和导电聚合物部分与dntp的多磷酸之间的r¹的连接部分的结构(这里，显示为短的peg-4跨度，肟官能团和连接到γ-磷酸o原子的四亚甲基部分)),图34的r¹可以在绝缘连接上产生导电连接。r¹可以类似地创建跨越桥的任何其他绝缘段的瞬态传导连接，从而完成导电路径。

图35a描绘了另一系列独特的经修饰的datp分子。对于这些经修饰的datp，n是1至约100的整数。在各种实例中，可以选择n，使得分子的重复部分的长度为约0.5nm至约50nm，或约1nm至约20nm。图35a的经修饰的datp提供用于产生独特电信号的机制。datp分子的r¹部分(它从四磷酸部分的最后一个磷酸基团开始并延伸到分子的末端)包含一个长而坚硬的“茎”结构，在磷酸键附近空间狭窄开始，在另一端空间膨大结束，可以看出其包括庞大的稠环系统、旋转的酰胺键和两个吡啶取代基。在包含dna桥、石墨烯纳米带桥或包含芳环的其它桥的传感器中，图35a的经修饰的datp的宽末端与传感器的桥分子在空间上相互作用，导致接头部分(即重复的吡嗪/哌嗪亚基)从聚合酶延伸到导电桥，以取决于r¹的长度的方式改变接头部分和导电桥之间的相互作用。

图35b描绘了具体的栓系物，其可以在分子传感器中在聚合酶和桥分子之间结合，用于与各种经修饰的dntp(例如图35a中所示的datp)相互作用。图35b中的实例包括多个芳环(苯、萘、芘等，作为栓系物骨架的间歇性的附属物)，其可以结合到导电桥并且在缔合和解离时改变导电性。对于图35b中所示的栓系物上的多个基团，可能观察到对于短栓系物没有基团从导电桥解离、对于中间长度栓系物有一些基团部分解离、对于足够长的栓系物的基团的完全解离——每个通过与导电桥的相互作用产生独特且可区分的电信号。因此，这种不同形式的栓系物为不同的a/c/g/t修饰的dntp提供了产生可区分信号的手段。r¹的基团的接头刚性和远端宽端确保当结合时导电桥与聚合酶接触并被推开，从而在足够长的r¹处发生基团的部分或完全解离。

图35a的经修饰的datp和图35b的共价结合的栓系物的组合提供了在纳入经修饰的datp期间信号增强的独特机会。图35b的栓系物的硫化物末端可以(通过硫化物或二硫键)共价结合到聚合酶的氨基酸上。栓系物的另一端可以通过许多可能性共价结合到桥分子上。对于聚芳烃导体桥分子(例如石墨烯)，栓系物的另一端可以通过c-c键、o-c键或s-c键如通过与导体的芳基连接(例如，使用芳烃重氮盐(arendiazonium)形成)，或通过芳烯(azirene)连接或环丙基连接到导体(使用氮宾或卡宾形成)共价连接到桥上。对于dna桥分子，栓系物可以连接到脱氧核糖的2'位置、连接到经修饰的碱基的位置、或通过p-s或p-c键连接到磷酸基团。

当纳入期间图35a的经修饰的datp在聚合酶活性位点非共价结合时，经修饰的datp与图35b的栓系物在空间上相互作用。经修饰的datp(图35a)与特殊栓系物(图35b)的相互作用通过与桥的间歇性相互作用或通过改变聚合酶到桥的距离或取向来影响信号传导电流，(例如，通过与栓系物结合来缩短或延长它)。通常，可以设计经修饰的dntp(如图35a中的经修饰的datp)以与栓系物相互作用，从而改变聚合酶相对于桥的构象或距离，并且通过这种方式调节桥电流并产生信号。

图36描绘了导电桥/聚合酶-栓系物实例，其中聚合酶-栓系物以改变聚合酶构象并因此影响信号的方式提供与图35a的经修饰的dntp的相互作用。因此，该经修饰的dntp通过在纳入事件期间改变聚合酶的构象变化间接地提供了独特电信号产生的机制。通常，可以设计如图35中的经修饰的dntp以与栓系物相互作用，从而改变聚合酶相对于桥的构象或距离，并且通过这种方式调节桥电流并产生信号。

图37显示了几种经修饰的dntp和这些经修饰的dntp的聚合酶活性测定结果。该实验的目的是显示klenow聚合酶能够通过这些不同的化学修饰而具有活性。

其他修饰的dntp包括以下包含硫代或硼烷修饰的化合物：

如上述结构所示，硫代和硼烷修饰可以在dntp的三磷酸的α-、β-或γ-磷酸处。靠近碱基的这些小修饰的放置可以通过改变酶作用或修饰与分子桥的接近来增强甚至干涉经修饰的dntp的纳入的信号传导，同时仍然被酶非常好地耐受。除了硫和硼取代之外，还可以考虑包含相似数量的键的其他原子水平修饰(例如，碘原子)。

经修饰的dntp中的亲和基团

本公开的其它实施方式包括在经修饰的dntp中的亲和基团的使用，其中相应的亲和补体位于传感器上，以进一步增强信号传导基团对通过分子传感器的电流的影响。在各种实施方式中，在多磷酸链和信号传导基团之间提供亲和基团，更靠近栓系物的信号传导基团末端。这样做的目的是促进信号传导基团相对于传感器的分子复合物的最有影响的定位，并增加dntp与传感器的导电桥分子的相互作用的持续时间。存在于复合物上的亲和补体促进电荷基团在经修饰的dntp上的定位和停留，从而对通过桥的电流具有更大的影响。在某些实例中，对于dntp的每个碱基(c、g、a、t)，可以在dntp上使用不同的亲和基团。亲和团体可以是高度特异的，例如单链dna5聚体，它与用作传感器的分子桥的dna寡核苷酸的互补部分具有亲和力，或者它可以仅表示电荷亲和力，例如dntp上的负电荷被吸引到桥分子上的正电荷。

包含dna类似物的互补寡核苷酸也可以有益于此目的，因为那样可以在较短的寡核苷酸中提供可调节的结合能。例如，这样的寡核苷酸可包含rna、pna(肽核酸)或lna(锁核酸)来代替天然dna，或碱基类似物如肌苷。对于石墨烯纳米带桥的情况，包含芘的基团可通过芘和石墨烯的π-π堆积相互作用而对桥具有亲和力。更一般地，连接到桥的芘基和位于dntp上的芘基通过π-π堆积，彼此具有亲和力。其他亲和基团可以使用与和桥结合的材料同源的材料结合肽，或相互作用的蛋白质如蛋白质复合体的两个组件，或小分子或肽抗原和偶联至桥的fab抗体结合结构域的同源抗体，或适体。优选在较弱结合或瞬时相互作用的条件下选择和进行这种结合，因为不希望这些相互作用持续超过秒的时间尺度，并且优选仅在10至100毫秒的范围内。对于不同的dntp亲和基团，一个或多个亲和补体可以驻留在传感器复合体上，其相同或不同。在各种实施方式中，3-聚体至30-聚体范围内的dna寡核苷酸足以作为经修饰的dntp的可选择的特异性亲和基团，使用经修饰的形式的dna的寡核苷酸或与dna杂交的dna类似物也是如此。

提供了经修饰的dntp、合成经修饰的dntp的方法、以及经修饰的dntp用于在包含聚合酶的分子传感器中的dna测序期间增强的dntp纳入事件信号传导的用途。本文的详细描述中，对“各种实施方式”、“实施方式”、“示例实施方式”等的引用指示所描述的实施方式可以包括特定的特征，结构或特性，但是每个实施方式可能不一定包括特定的特征，结构或特性。而且，这样的短语不一定指相同的实施方式。此外，当结合实施方式描述特定特征、结构或特性时，认为结合其他实施方式影响这种特征、结构或特性是在本领域技术人员的知识范围内的，无论是否明确描述。在阅读说明书之后，相关领域的技术人员将清楚如何在替代实施方式中实现本公开。

此处关于具体示例描述了好处、其它优点以及对问题的解决方案。但是，不应认为这些益处、优点、解决问题的方案，以及可能产生任何益处、优点或解决方案或者使其更为显著的任何元素是本公开的关键、需要或必需的特征或元素。因此本公开的范围仅由所附权利要求限制，其中，除非明确指出，否则对单数元素的引用不旨在表示“一个并且仅有一个”，而是表示“一个或多个”。此外，在权利要求或说明书中使用类似于“a、b和c中的至少一个”或“a、b或c中的至少一个”的短语时，意图将该短语解释为表示在实施方案中可以单独存在a，在实施方案中可以单独存在b，在实施方案中可以单独存在c，或者在单个实施方案中可以存在元素a、b和c的任何组合；例如a和b、a和c、b和c、或a和b和c。

本领域普通技术人员已知的上述各种实施方式的元件的所有结构、化学和功能等同物通过引用明确地并入本文，并且旨在由本权利要求书涵盖。此外，分子、组合物或用途不必解决本公开试图解决的每个问题，因为它包含在本权利要求中。此外，本公开中的化学、组件或用途不旨在致力于公众，无论权利要求书中是否明确列举这些化学、组件或用途。此处的权利要求元素不意指调取美国专利法第112条(f)，除非使用短语“用于……的方法”特意地列举了该元素。如此处所使用的，术语“包括”、“包含”或其任意其它变型旨在覆盖非排他的包含，使得包括一列元素的化学、化学组合物、过程、方法、物品或装置不仅包括这些元素而且还可包括并未特意列出的或这些化学、化学组合物、过程、方法、物品或装置固有的其它元素。