一种基于氧化石墨烯和共轭聚合物复合材料的生物大分子构象变化检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感及分析领域，具体设及一种基于氧化石墨締和共辆聚合物复 合材料的生物大分子构象变化检测方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质、核酸等生物大分子在生物体内起着重要作用，每一种大分子都有着自己 特有的=维结构，并且在执行功能时构象会发生特异性的变化。因此，检测生物大分子的构 象变化对理解其功能起着重要作用。巧调蛋白（Calmo化lin，CaM)是一种巧离子结合蛋白， 由148个氨基酸组成的单条多肤，相对分子质量为16. 7kDa。在生物体内，CaM参与众多巧 离子依赖的信号传导，通过与祀蛋白（蛋白激酶、离子通道等）相结合，激活祀蛋白，从而调 控生命体的代谢过程。CaM的两个球形的末端（N-和C-末端）各含有两个"EF-hand"，作为 巧离子结合的模体，中间由一段长而富有柔性的结构相连。与巧结合后，CaM的构象由"闭 合状态"转变为"打开状态"，中间的柔性连接变为一段长而僵硬的中屯、螺旋，从而导致CaM 的表面暴露出更多疏水基团W及负电荷的减少。该种活性的Ca"/CaM复合物进而识别激活 多种祀蛋白。因此，在Ca2+介导的信号传导中，CaM的构象变化起着重要作用。除CaM外， 生物体内还有众多生物大分子的构象变化对其功能起着重要作用。尽管目前存在多种技术 检测蛋白质的构象变化，例如：核磁共振、X-射线晶体技术、单分子光谱技术等，但是该些 方法都需要昂贵的设备、复杂操作过程W及经验丰富的实验者，从而导致不能广泛应用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种基于氧化石墨締和共辆聚合物复合材料的生物大分子 构象变化检测方法。
[0004] 本发明所提供的基于氧化石墨締和共辆聚合物复合材料的生物大分子构象变化 检测方法，包括：基于氧化石墨締和共辆聚合物复合材料的生物大分子构象变化辅助检测 方法和基于氧化石墨締和共辆聚合物复合材料的生物大分子构象变化检测方法。
[0005] 上述基于氧化石墨締和共辆聚合物复合材料的生物大分子构象变化辅助检测方 法，包括下述：
[0006] a)、将标记有巧光分子的生物大分子溶于检测缓冲液中，得到空白溶液；向多个所 述空白溶液中的每一个空白溶液中加入该生物大分子特异性的底物，得到多个底物含量不 同的生物大分子-底物溶液，解育后，得到多个标准溶液；
[0007] b)、分别向所述空白溶液和所述多个标准溶液中的每一个标准溶液中加入相同量 的氧化石墨締，得到含氧化石墨締的空白溶液和多个含氧化石墨締的标准溶液，解育后，再 分别加入相同量的共辆聚合物，解育后，得到空白样品和多个标准样品；
[000引 C)、在紫外灯下分别观察所述空白样品和所述多个标准样品中的每一个标准样品 的颜色，得到生物大分子构象与颜色的对应关系；
[0009] d)、将标记有巧光分子的构象待测的生物大分子用所述检测缓冲液配置成待测溶 液，所述待测溶液中的生物大分子的含量与所述a)中所述空白溶液中的生物大分子的含 量相等；向所述待测溶液中加入氧化石墨締，解育后，再加入所述共辆聚合物，解育后，得到 待测样品，所述待测样品中氧化石墨締的含量与所述b)中所述多个标准样品中的每一个 标准样品中的氧化石墨締的含量相等，所述待测样品中所述共辆聚合物的含量与所述b) 中所述多个标准样品中的每一个标准样品中的所述共辆聚合物的含量相等；
[0010] e、在紫外灯下观察所述待测样品的颜色，根据步骤C)中所述生物大分子构象与 颜色的对应关系，辅助判断所述待测样品中所述生物大分子的构象。
[00川上述方法所述a)中，所述检测缓冲液可为肥阳S缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液 或PBS缓冲液，具体可为20mM，pH 7. 4的肥阳S缓冲液。
[0012] 所述巧光分子为能量受体。
[0013] 所述巧光分子可为化学巧光素分子，如绿色巧光蛋白（GF巧、黄色巧光蛋白 (YFP)、青色巧光蛋白（CFP) W及它们的各种突变体，具体可为增强型绿色巧光蛋白 巧GF巧。
[0014] 所述空白溶液中，所述生物大分子的摩尔浓度为0. 5-5. 0 uM。
[0015] 所述生物大分子-底物溶液中，所述底物的摩尔浓度为大于0到5. OmM，具体可为： l〇-3mM、l〇-2mM、〇. lmM、〇. 3mM、0. 5mM、0. 8mM、1. OmM 或 5. OmM。
[0016] 所述解育的温度为室温（20-25°C )，时间为5-30min。
[0017] 所述b)中，所述含氧化石墨締的空白溶液和含氧化石墨締的标准溶液中，氧化石 墨締的质量浓度均为5. 0-50. 0 y g/mL。
[001引所述b)中，所述共辆聚合物为式I所示的共辆聚合物：
[0019]
【主权项】
1. 一种生物大分子构象变化辅助检测方法，包括下述： a) 、将标记有荧光分子的生物大分子溶于检测缓冲液中，得到空白溶液；向多个所述空 白溶液中的每一个空白溶液中加入该生物大分子特异性的底物，得到多个底物含量不同的 生物大分子-底物溶液，孵育后，得到多个标准溶液； b) 、分别向所述空白溶液和所述多个标准溶液中的每一个标准溶液中加入相同量的氧 化石墨烯，得到含氧化石墨烯的空白溶液和多个含氧化石墨烯的标准溶液，孵育后，再分别 加入相同量的共轭聚合物，孵育后，得到空白样品和多个标准样品； c) 、在紫外灯下分别观察所述空白样品和所述多个标准样品中的每一个标准样品的颜 色，得到生物大分子构象与颜色的对应关系； d) 、将标记有荧光分子的构象待测的生物大分子用所述检测缓冲液配置成待测溶液， 所述待测溶液中的生物大分子的含量与所述a)中所述空白溶液中的生物大分子的含量相 等；向所述待测溶液中加入氧化石墨烯，孵育后，再加入所述共轭聚合物，孵育后，得到待测 样品，所述待测样品中氧化石墨烯的含量与所述b)中所述多个标准样品中的每一个标准 样品中的氧化石墨烯的含量相等，所述待测样品中所述共轭聚合物的含量与所述b)中所 述多个标准样品中的每一个标准样品中的所述共轭聚合物的含量相等； e、在紫外灯下观察所述待测样品的颜色，根据步骤c)中所述生物大分子构象与颜色 的对应关系，辅助判断所述待测样品中所述生物大分子的构象。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在通过颜色变化无法判断生物 大分子的构象时还进一步包括下述： f) 采集所述空白样品的荧光发射光谱，计算所述空白样品的荧光发射光谱上，两个不 同的发射波长处的荧光强度比值；分别采集所述多个标准样品中的每一个标准样品的荧光 发射光谱，计算每一个标准样品的荧光发射光谱上，所述两个不同的发射波长处的荧光强 度比值，从而得到生物大分子构象与所述两个不同的发射波长处的荧光强度比值的对应关 系； g) 采集所述待测样品的荧光光谱，计算所述待测样品的荧光光谱上所述两个不同的发 射波长处的荧光强度比值，根据所述f)中的所述生物大分子构象与所述两个不同的发射 波长处的荧光强度比值的对应关系，判断所述构象待测的生物大分子的构象状态。
3. -种生物大分子构象变化检测方法，包括下述： 1) 将标记有荧光分子的生物大分子溶于检测缓冲液中，得到空白溶液；向多个所述空 白溶液中的每一个空白溶液中加入该生物大分子特异性的底物，得到多个底物含量不同的 生物大分子-底物溶液，孵育后，得到多个标准溶液； 2) 分别向所述空白溶液和所述多个标准溶液中的每一个标准溶液中加入相同量的氧 化石墨烯，得到含氧化石墨烯的空白溶液和多个含氧化石墨烯的标准溶液，孵育后，再分别 加入相同量的共轭聚合物，孵育后，得到空白样品和多个标准样品； 3) 采集所述空白样品的荧光发射光谱，计算所述空白样品的荧光发射光谱上，两个不 同的发射波长处的荧光强度比值；分别采集所述多个标准样品中的每一个标准样品的荧光 发射光谱，计算每一个标准样品的荧光发射光谱上，所述两个不同的发射波长处的荧光强 度比值，从而得到生物大分子构象与所述两个不同的发射波长处的荧光强度比值的对应关 系； 4) 将标记有荧光分子的构象待测的生物大分子用所述检测缓冲液配置成待测溶液，所 述待测溶液中的生物大分子的含量与所述1中所述空白溶液中的生物大分子的含量相等； 向所述待测溶液中加入氧化石墨烯，孵育后，再加入与所述共轭聚合物，孵育后，得到待测 样品，所述待测样品中氧化石墨烯的含量与所述2中所述多个标准样品中的每一个标准样 品中的氧化石墨烯的含量相等，所述待测样品中所述共轭聚合物的含量与所述2中所述多 个标准样品中的每一个标准样品中的所述共轭聚合物的含量相等； 5) 采集所述待测样品的荧光光谱，计算所述待测样品的荧光光谱上所述两个不同的发 射波长处的荧光强度比值，根据所述3中的所述生物大分子构象与所述两个不同的发射波 长处的荧光强度比值的对应关系，判断所述构象待测的生物大分子的构象状态。
4. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子为蛋白质分子。
5. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子为钙调蛋白；所述底 物为钙离子。
6. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述检测缓冲液为HEPES缓冲液、 Tris缓冲液、PB缓冲液或PBS缓冲液； 所述荧光分子为化学荧光素分子。
7. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述荧光分子选自下述任意一种：绿 色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白以及它们的各种突变体。
8. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述共轭聚合物为式I所示的共轭 聚合物：
式I中，η大于8小于等于50, X = 2-12, B为卤素。
9. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述荧光发射光谱的条件为：激发光 波长为325nm-400nm，荧光波长为400nm-700nm〇
10. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子为钙调蛋白，所述 荧光分子为增强型绿色荧光蛋白，所述共轭聚合物为PFP，所述两个不同的发射波长处的荧 光强度比值为波长510nm处的荧光强度与波长420nm处的荧光强度的比值。
【专利摘要】本发明提供一种基于氧化石墨烯和共轭聚合物复合材料的生物大分子构象变化检测方法。生物大分子构象转变时，表面所带的疏水基团、电荷等性质也发生改变，使得其与氧化石墨烯的组装方式不同，通过共轭聚合物和生物大分子标记的荧光分子FRET效率不同，从而判断生物大分子所处的构象状态。FRET效率较低时，说明生物大分子与石墨烯之间的结合紧密，不能有效地能量转移，说明生物大分子所处的构象状态表面带有较多的疏水基团以及较少的负电荷；FRET效率提高时，则相反。同时，基于底物分子特异性与生物大分子相结合，本发明还可特异性检测诱导生物大分子构象转变的底物分子。另外，在紫外灯下可以直接通过颜色变化判断生物大分子的构象变化。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104749148
【申请号】CN201510118279
【发明人】展永, 邢成芬, 袁宏博, 安海龙, 李瑞华, 牛瑞民
【申请人】河北工业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月18日