hCE1及其抗体在制备用于诊断主体中肝癌的组合物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于肝癌(hepatocellular carcinoma ；HCC)的诊断的血楽生物标记物(羧酸酯酶I)以及相关的确定健康志愿者与患有HCC的病人之间的差异生物标记物表达的筛选方法，该筛选方法采用双向荧光凝胶电泳(2-D DIGE)、免疫沉淀以及纳升液相色谱质谱(Nano-LC-MS/MS)系统。分泌到血浆中的生物标记物蛋白的量被测定并被用作HCC的存在的指示。
【背景技术】
[0002]肝癌(HCC)在全世界是第五大最常见的癌症并且具有第四高的致死率。它是亚洲和非洲人群中特别主要的问题。与患有其他癌症(例如，肺癌和乳腺癌)的病人不同，95%以上的HCC病人在诊断患有HCC的五年内死亡。
[0003]尽管HCC是不断研宄的对象，并且它的症状已经众所周知，但是该疾病的早期诊断仍然困难并且确诊后的存活率非常低(3%至5% )。
[0004]除了通过计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)用来诊断HCC的活组织切片检查以外，诸如血浆之类的体液提供了临床样品以允许蛋白的同时测量来确定可能存在HCC0
[0005]如今，生物标记物甲胎蛋白(AFP)、des-γ-羧基凝血酶原(DCP)、glypican-3(GPC3)、α _1_岩藻糖苷酶以及转化生长因子_bl已被单独或组合地用于HCC病人的临床筛选。尽管这些生物标记物对于HCC的检测是有用的，但是它们存在敏感性和/或特异性差的问题。例如，已被用作HCC的血清标记物多年的甲胎蛋白具有低敏感性(39%至65% )和中等特异性(76%至94% )。因此，急需一类新的具有提高的敏感性和特异性并能早期诊断HCC的生物标记物。
[0006]本发明的发明人已经发现了是HCC的特异生物标记物的N-连接糖基化蛋白。通过双向凝胶电泳(2-D DIGE)和纳升液相色谱质谱(Nano-LC-MS)鉴定出了该蛋白，即，人肝羧酸酯酶I (hCEl)，并发现该蛋白在从健康志愿者和HCC病人获得的临床血浆样品中差异表达。
[0007]已知主要在肝脏中表达的候选的HCC生物标记物蛋白(hCEl)在HCC组织中相对于正常肝组织以较低水平表达。然而，没有关于在人体液(即，血浆)中直接检测到分泌的hCEl蛋白的报道。与此一致的是，本发明的发明人对公共血浆蛋白数据库(http://WWW.plasmaproteomedatabase.0rg)的检索未能发现血楽中存在hCEl的证据。
[0008]有关人血浆中的hCEl的在先研宄已经使用采用了非特异性基质、三油酸甘油酯或乙酸对硝基苯酯的酶测定法，来测量通过琼脂糖亲和色谱纯化的样品中的hCEl或其异形物的活性。然而，最近已经报道该水解活性可能归因于同样存在于人血浆中的丁酰胆碱脂酶、对氧磷酶(paraoxonase)和白蛋白的醋酶活性。观察到特异的hCEl抑制剂一双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)，未证实人血浆中存在hCEI，该观察支持了上述解释。
[0009]在该上下文中，本发明的发明人使用蛋白质组学技术在肝组织和血浆中检测hCElo使用免疫沉淀以及2-D DIGE和Nano-LC-MS/MS系统的蛋白质组学技术，本发明的发明人已经证明hCEl存在于健康志愿者和患有HCC的病人的血浆中，并且提供了 hCEl代表一种新的HCC生物标记物的证据。
【发明内容】
[0010]技术问题
[0011]本发明的目的在于提供hCEl是能够使用病人血浆来有效地检测HCC的存在的HCC诊断生物标记物的新的证据，以及常规的检测方法。
[0012]本发明提供的HCC筛选方法包括以下的必要步骤:确认人血液样品中hCEl的存在；通过使用免疫沉淀、蛋白质印记分析(Western blot analysis)和Nano-LC-MS/MS系统对血浆中的hCEl进行定量检测而在患有HCC的病人和健康志愿者之间做出区分。
[0013]技术方案
[0014]为了实现上述目的，使用2-D DIGE和蛋白质印记分析，本发明证实了与患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织相比，患有HCC的病人的肿瘤性肝组织中的hCEl表达显著降低。
[0015]本发明还使用蛋白质组学技术(Nano-LC-MS/MS系统)确定了 hCEl实际上是一种血浆蛋白，这在此前未使用传统方法予以证明。此外，本发明表明与健康志愿者的血浆中的hCEl蛋白的水平相比，患有HCC的病人的血浆中的hCEl蛋白的水平平均是其2至5倍。
[0016]由于hCEl是结合血凝素的N-连接糖蛋白，所以在非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织的分析中，本发明采用血凝素亲和色谱来分离糖蛋白。接下来进行2-D DIGE，以将hCEl蛋白定位在2-D图谱上的与大约62kDa分子量和4.5至5.3PI对应的位置上。
[0017]通过本发明描述的方法，在磁珠(Dynabeads，Invitrogen)上富集之后使用免疫沉淀以及基于高灵敏度的Nano-LC-MS/MS的方法来验证hCEl的存在。在确定最佳的Dynabeads分装和血浆浓度条件的过程中，还确定了健康志愿者与患有HCC的病人的血浆中hCEl的水平的比较分析可以使用蛋白质印记分析来完成。
[0018]根据本发明，通过采用下面步骤的蛋白质组学技术的使用，可以证实人血浆中hCEl的存在:
[0019]a)将血液样品收集到含有乙二胺四乙酸二钾(K2EDTA)的试管中并在室温下保持30分钟；以2，400 X g离心15分钟，以获得血浆(上清物)；
[0020]b)将400 μ g抗hCEl的抗体与1mg磁珠结合，然后将500 μ g抗体包被的磁珠转移到含有8mg来自HCC病人或健康志愿者的血浆的Iml试管中并培育2小时，以对hCEl进行免疫沉淀并将其与剩余的血浆蛋白分开；
[0021 ] c)在裂解缓冲液中使经免疫沉淀的来自健康志愿者的hCEl和经免疫沉淀的来自HCC病人的每种样品变性，然后使用一维凝胶电泳将样品分离；
[0022]d)在大约60kDa处切割凝胶条带，并使用胰蛋白酶将蛋白消化为肽；
[0023]e)使用高灵敏度的Nano-LC-MS/MS系统来分析消化的肽，以鉴定hCEl蛋白(参见图6和图7) ο
[0024]此外，在本发明中也对人血浆中的分泌的hCEl的水平进行了测定，并且可将分泌的hCEl用作使用下面一系列步骤而在患有HCC的病人与健康志愿者之间做出区分的生物标记物:
[0025]I)使用2-D DIGE和蛋白质印记分析证实与非肿瘤性肝组织中的hCEl表达水平相比，来自患有HCC的病人的肿瘤性肝组织中的hCEl的表达水平显著降低；
[0026]2)按上述a)至b)步骤对血浆样品进行免疫沉淀，以获得hCEl的溶液；
[0027]3)通过使用抗hCEl的抗体的蛋白质印记分析确认hCEl信号的存在；以及
[0028]4)证实患有HCC的病人的血浆中的hCEl信号比健康志愿者的血浆中的hCEl信号强(参见图8和图9)。
【附图说明】
[0029]图1是示出来自患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织的分级的糖蛋白的2-D DIGE图像的照片；hCEl的位置被示出。
[0030]图2是示出来自患有HCC的病人的肿瘤性肝组织的分级的糖蛋白的2-D DIGE图像的照片；hCEl的位置被示出。
[0031]图3是示出来自另外十名患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织的成对样品的hCEl表达水平差异的照片。
[0032]N:非肿瘤性肝组织
[0033]T:肿瘤性肝组织
[0034]图4是示出hCEl表达水平的免疫组化染色、石蜡包埋的组织阵列的照片，该组织阵列通过来自47名患有HCC的病人的成对的非肿瘤性肝脏部分和肿瘤性肝脏部分而构建。
[0035]图5是描绘出染色得分的频率分布的图表，该频率分布图表通过患有HCC的病人的成对的非肿瘤性肝脏部分和肿瘤性肝脏部分的免疫组化