)图；b)图为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取酶解混合物后的MALD1-TOF MS图；c)图为检测相应的非印迹材料萃取酶解混合物后的MALD1-TOF MS图。注:心形表示核糖核酸酶B的糖链；梅花表示辣根过氧化物酶的糖链。
[0026]图6为转铁蛋白糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对不同糖蛋白的糖肽结合，其中a)图为直接检测转铁蛋白，核糖核酸酶B和辣根过氧化物酶的胰蛋白酶解混合物的基质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱(MALD1-TOF MS)图；b)图为检测转铁蛋白糖链的印迹材料萃取酶解混合物后的MALD1-TOF MS图；c)图为检测相应的非印迹材料萃取酶解混合物后的MALD1-TOF MS图。注:心形表示核糖核酸酶B的糖链；梅花表示辣根过氧化物酶的糖链；方块表示转铁蛋白的糖链。
[0027]图7为高浓度甘露糖对糖核酸酶B糖链的印迹材料结合糖核酸酶B的干扰，其中左边表示材料结合糖核酸酶B时不加入甘露糖，右边表示材料结合糖核酸酶B时加入甘露糖。
[0028]图8为高浓度甘露糖对结合了糖核酸酶B的核酸酶B糖链的印迹材料的顶替，其中A表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后直接用10mM醋酸溶液解析，B表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后用高浓度甘露糖解析，C表示核酸酶B糖链的印迹材料结合了核糖核酸酶B后，用高浓度甘露糖解析后，用10mM醋酸溶液解析。
[0029]图9为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中加入的核糖核酸酶B的结合，其中a为直接检测核糖核酸酶B添加的血清的MALD1-TOF MS图，b为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取混合物后的MALD1-TOF MS图；(:为检测相应的非印迹材料萃取混合物后的MALD1-TOF MS图。
[0030]图10为转铁蛋白糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中的转铁蛋白的结合，其中a为直接检测血清的MALD1-TOF MS图，b为检测转铁蛋白糖链的印迹材料萃取血清后的MALD1-TOF MS图；c为检测相应的非印迹材料萃取血清后的MALD1-TOF MS图。
[0031]图11为核糖核酸酶B糖链的印迹材料与相应的非印迹材料对血清中加入的核糖核酸酶B胰蛋白酶解混合物的结合，其中a为直接检测核糖核酸酶B的胰蛋白酶解混合物添加的血清的MALD1-TOF MS图，b为检测核糖核酸酶B糖链的印迹材料萃取混合物后的MALD1-TOF MS图；c为检测相应的非印迹材料萃取混合物后的MALD1-TOF MS图。
【具体实施方式】
[0032]如图1所示，一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，该方法是先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用可硅烷化试剂在合适条件下的缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。
[0033]最近，我们已经发展出制备能专一识别糖蛋白的分子印迹聚合物的通用、便捷的方法一硼亲和可控定向表面印迹法[S.S.Wang, J.Ye, Z.J.Bie, Z.Liu, Chem.Sc1.《化学科学》2014，5，1135-1140 ；X.D.Bi, Z.Liu, Anal.Chem.《分析化学》2014，86，959-966]。虽然本发明在技术路线上与该方法有一定的相似性，但是，本发明与该方法具有根本的不同:1)本发明以糖蛋白酶解得到的糖链为模板，而该方法以完整蛋白为模板；2)本发明得到的分子印迹聚合物不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白的特征片段，而该方法所制备得到的分子印迹聚合物只能识别完整糖蛋白；3)本发明以硅烷化试剂为单体制备印迹层，而该方法以其他自聚合试剂制备印迹层。
[0034]下面通过具体实施例来进一步阐述本发明，应该说明的是，下面的实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均在本发明的保护范围之内。
[0035]实施例1:糖链(印迹模板分子)的获得
[0036]首先将完整糖蛋白溶于1mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 7.5)中，配制得到lmg/mL的混合溶液。取100 μ L上述混合溶液浸入沸水浴中10分钟，取出自然冷却至25°C后，加入10个单位的肽-N-糖苷酶F在37°C的水浴中反应24小时。反应结束后，在14000转/分钟的速度下用截留分子量为3000道尔顿的超滤管离心30分钟将糖链从反应体系中分离。所得糖链保存在_20°C下待用。
[0037]上述完整糖蛋白是核糖核酸酶B，或者转铁蛋白；或者其他糖蛋白。
[0038]上述肽-N-糖苷酶F是用来将完整糖蛋白上的糖链酶切下来的一种酶。
[0039]实施例2:2，4- 二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备
[0040]首先制备一种氨基修饰的磁性纳米粒子[制备方法参见但不限于以下文献L.Wang, J.Bao, L.Wang, F.Zhang, Y.Li, Chem.Eur.J.《欧洲化学》2006，12，6341-6347]。取200mg氨基修饰的磁性纳米粒子加入40mL无水甲醇中，随后加入400mg 2，4-二氟-3-甲酰基-苯硼酸以及400mg氰基硼氢化钠。混合物在25°C下搅拌反应24小时。所得产物用水和乙醇各清洗三遍，50°C下真空干燥12小时。即得到2，4- 二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子。
[0041]实施例3:印迹涂层厚度随时间变化关系的考察
[0042]将粒径与磁性纳米粒子相近的银纳米粒子加入40mL无水乙醇和0.7mL浓氨水(37%)的混合溶液中。最后加入1mL 1mM的正硅酸乙酯的乙醇溶液。在25°C搅拌，从搅拌后的10分钟开始至60分钟结束，每隔5分钟取样，用透射电子显微镜表征其表面印迹涂层的厚度。结果如图2。图中线性相关系数r2= 0.99，斜率s = 0.04nm/min，这表明聚合物的厚度与时间增长有着良好的线性相关性，为本技术的可控性提供了保障。
[0043]实施例4:印迹材料的制备
[0044]首先取20mg 2，4_ 二氟-3-甲酰基-苯硼酸修饰的磁性纳米粒子，分散在2mL的含500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵(pH 8.5)缓冲溶液中，随后向混合物中加入40 μ L由实施例I中得到的核糖核酸酶B的糖链。在25°C下振荡2小时。用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用50mM碳酸氢铵(pH8.5)缓冲溶液洗涤三次，每次500 μ L。所得材料记为M-1。
[0045]将M-1分散于160mL无水乙醇和2.8mL浓氨水(质量浓度28 % )的混合溶液中。最后加入40mL 1mM的正硅酸乙酯的乙醇溶液。在25°C搅拌50分钟(核糖核酸酶B糖链的尺寸为2.4至3.lnm，根据这个尺寸来确定搅拌时间为50分钟)。所得材料随后溶乙醇清洗三遍后，40°C真空干燥。所得材料记为M-2。
[0046]为了除去M-2中的模板分子，20mg M_2分散于2mL 10mM的醋酸溶液中，在25°C下振荡20分钟，上述清洗步骤重复3遍。随后所得材料用乙醇清洗3遍后，40°C真空干燥。所得材料即为核糖核酸酶B糖链的印迹材料，即为基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
[0047]对于非印迹材料，除了没有加入模板分子(糖链)以外，其余步骤保持不变。
[0048]对于转铁蛋白糖链的印迹材料，除以下步骤外其余均保持不变:①将核糖核酸酶B的糖链替换为转铁蛋白的糖链，②将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的10mM磷酸盐(pH7.4)缓冲溶液，③将印迹时间变为60分钟(转铁蛋白的糖链的尺寸为3.9nm)。
[0049]实施例5:印迹材料对于完整糖蛋白的选择性测试
[0050]首先配制一系列测试物溶液，其中包括核糖核酸酶B，核糖核酸酶A，转铁蛋白，辣根过氧化物酶，其浓度都是lmg/mL，所用溶液除转铁蛋白外均为含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)，转铁蛋白溶液的配制采用含500mM氯化钠的10mM磷酸盐(pH7.4)缓冲溶液。
[0051]取2mg由实施例4制备得到的印迹材料分别加入200 μ L上述配制的测试物的溶液中，在25°C下振荡I小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次lmL，然后加入20 μ L洗脱液(洗脱液是10mM醋酸溶液)，振荡I小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，测定其在214nm下的吸光度，其吸光度的大小可以代表该印迹材料结合对应测试物的量。
[0052]对于非印迹材料，测试方式与上述步骤完全一致。
[0053]由图3可知:核糖核酸酶B糖链的印迹材料可以特异性地识别