核糖核酸酶B。这证明了所得材料优异的特异性。
[0054]对于转铁蛋白糖链的印迹材料，测试方法与上述步骤完全一致。
[0055]由图4可知:转铁蛋白糖链的印迹材料可以特异性地识别转铁蛋白。这证明了所得材料优异的特异性的同时，也说明了此种印迹策略的普适性。
[0056]实施例6:印迹材料对于糖肽(完整糖蛋白的特征片段)的选择性测试
[0057]首先配制肽段的混合溶液，将核糖核酸酶B，转铁蛋白，辣根过氧化物酶三种蛋白的酶解肽(lmg/mL)等量混合后，用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)稀释10倍。取2mg由实施例4制备得到的核糖核酸酶B糖链的印迹材料，加入100 μ L上述稀释后的溶液中，在25°C下振荡I小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)洗涤三次，每次lmL，然后加入20 μ L洗脱液(洗脱液是10mM醋酸溶液)，振荡I小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中的肽段信息。
[0058]对于非印迹材料，测试方式与上述步骤完全一致。
[0059]对于转铁蛋白糖链的印迹材料，将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的10mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液。其余步骤保持不变。
[0060]由图5和图6可知，印迹材料对于相应的糖肽同样具有优异的特异性识别能力。
[0061]实施例7:单糖干扰物对于材料性能影响的考察
[0062]考虑本实验中糖链的结构，选用甘露糖作为代表性的单糖干扰物。应该说明的是，其他种类的单糖对材料性能的影响和甘露糖类似，在此不再赘述。
[0063]首先考察甘露糖对于抓取步骤的影响。取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200 μ L核糖核酸酶B (lmg/mL)与甘露糖(100mg/mL)的混合溶液中。(溶液由含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)配制而成)。在25°C下振荡I小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次lmL，然后加入20 μ L洗脱液(洗脱液是10mM醋酸溶液)，振荡I小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，测定其在214nm下的吸光度，由于甘露糖在214nm时不具有紫外吸收，其吸光度的大小可以代表印迹材料结合的核糖核酸酶B的量。
[0064]由图7可知，高浓度单糖的干扰并不会影响印迹材料对于目标分子的识别能力。
[0065]甘露糖对于解吸步骤的影响通过如下步骤考察:按照实施例5中的步骤进行。但将解吸液替换为lOOmg/mL的甘露糖溶液(溶液由含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)配制而成)。在上述操作步骤后，再用10mM醋酸溶液对抓取材料进行解吸。
[0066]由图8可知，高浓度单糖并不能将印迹材料所结合的模板顶替下来，而10mM醋酸溶液却可以基本达到完全解吸。
[0067]上述两个结果保证了该材料在复杂样品中仍具有优异的特异性识别性能。
[0068]实施例8:印迹材料对于血清中完整糖蛋白的选择性测试
[0069]首先考察核糖核酸酶B糖链的印迹材料对于血清中核糖核酸酶B的选择性。由于血清中没有核糖核酸酶B的存在，所以选择人为添加一定量的核糖核酸酶B。具体配置方法:人血清用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.5)稀释10倍以后，人为添加核糖核酸酶B使其在血清中的浓度达到0.lmg/mL?取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200 μ L上述稀释血清中。在25°C下振荡I小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次lmL，然后加入20 μ L洗脱液(洗脱液是10mM醋酸溶液)，振荡I小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中蛋白质的信息。
[0070]对于非印迹材料，其操作步骤与上述步骤保持一致。
[0071]对于转铁蛋白糖链的印迹材料，由于血清中存在一定浓度的转铁蛋白，所以血清直接稀释即可，同时将缓冲溶液替换为含500mM氯化钠的10mM磷酸盐(pH 7.4)缓冲溶液。其余步骤保持不变。
[0072]如图9和图10可知，印迹材料可以抓取血清样品中相应的完整蛋白，说明该材料对于相应的糖蛋白有良好的专一性识别能力，且抗干扰能力强。
[0073]实施例9:印迹材料对于血清中糖肽(完整糖蛋白的特征片段)的选择性测试
[0074]由于血清中没有核糖核酸酶B肽段的存在，所以选择人为添加一定量的核糖核酸酶B肽段。具体配置方法:人血清用含有500mM氯化钠的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5)稀释10倍以后，人为添加核糖核酸酶B肽段使其在血清中的浓度达到0.lmg/mLo取2mg核糖核酸酶B糖链的印迹材料分散于200 yL上述稀释血清中。在25°C下振荡I小时。随后用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，去除上清液后，用相应的缓冲液洗涤三次，每次lmL，然后加入20 μ L洗脱液(洗脱液是10mM醋酸溶液)，振荡I小时。最后，用磁铁将磁性纳米粒子吸附于管壁上后，取出洗脱液，用质谱鉴定其中肽段的信息。
[0075]对于非印迹材料，其操作步骤与上述步骤保持一致。
[0076]如图11可知，印迹材料可以抓取血清样品中相应的糖肽，说明该材料有良好的专一性识别能力，且抗干扰能力强。
【主权项】
1.一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，该方法为:先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，然后通过硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，通过缩聚反应的反应条件来控制印迹层对模板分子的覆盖程度，最后在酸性条件下移除模板分子形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
2.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于:所述的糖链是任意目标糖蛋白上的不同结构的糖链。
3.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于:所述基体材料是取代硼酸功能化的材料；所述取代硼酸功能化的材料是硼酸功能化的磁性纳米颗粒、或者磁性微球、或者其他纳米材料和玻璃片或其他表面材料。
4.根据权利要求3所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于:用于硼酸功能化的取代硼酸为含有羟基、或者醛基、或者羧基、或者巯基、或者不饱和键，或者氨基等活性基团的苯硼酸或杂环取代硼酸。
5.根据权利要求1所述的一种分子印迹材料的合成方法，其特征在于，所述硅烷化试剂是正硅酸乙酯或其他取代正硅酸酯，所述硅烷化试剂的浓度为ImM?50禮。
6.根据权利要求1所述的的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于:所述印迹层的厚度通过控制缩聚反应的反应条件控制在糖链模板分子长度的三分之一至三分之二。
7.根据权利要求1所述的的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于:模板分子的去除采用酸性溶液洗提。
8.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，所述凝集素模拟物在pH多7.0条件下结合目标物，而在pH < 3.0条件下释放被结合的目标物。
9.权利要求1所述的制备方法得到的基于分子印迹技术的凝集素模拟物。
10.权利要求9所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物在分离、富集糖蛋白组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，随后利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。该凝集素模拟物制备简单，成本低廉，性质稳定，并且所识别的目标物更容易释放。具有良好的专一性、亲和力，且抗干扰能力强。不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白的特征片段-糖肽和聚糖。在用于复杂生物样品时仍能保持其专一识别能力。该材料在糖蛋白组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面有着良好的应用前景。
【IPC分类】C07K1-14, G01N33-68
【公开号】CN104820100
【申请号】CN201510182716
【发明人】刘震, 别子俊, 陈阳
【申请人】南京大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月16日