一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米生物分析技术领域，具体涉及一种快速检测蛋白酶Jmjde与量子点结合速率的方法。
【背景技术】
[0002]纳米科学近年来发展快速，出现了很多新型的纳米材料。其中量子点(Quantumdots，QDs)由于具有荧光激发谱宽、发射谱窄而对称、发射波长可调、光化学稳定性好等光学性质，这些优点弥补了传统荧光探针的不足，逐渐使其在生物分析检测方面得到了广泛应用。
[0003]近年来，金属和六聚组氨酸多肽之间的自组装作为一种高效、定点检测方法已被开发，其是通过金属亲和驱动相互作用来使量子点表面功能化。这种结合具有很高的亲和力，解离常数(Kd)约10 9M,并且QD-寡聚组氨酸(Histag)多肽的偶联已广泛应用于纳米生物传感器的自组装。研究表明，Histag可以与量子点进行有效自组装。例如，QDs偶联抗体可用于抗原的检测；QDs与多肽偶联可用于水解酶的检测等。此外，带有寡聚组氨酸标签的生物分子和量子点偶联可以通过两者的摩尔比来控制。因此，含有Histag的生物分子可直接与量子点在水溶液中组装，避免使用有机交联剂完成结合步骤。
[0004]酶是催化生物反应的关键，Jmjd6是最近发现的一种依赖于Fe ( II )和α -酮戊二酸的双加氧酶，其在小鼠体内缺乏会胚胎致死。通常固定在纳米颗粒表面的酶具有特殊应用，利用纳米颗粒作为载体(包括量子点，氧化铁，聚苯乙烯，纳米金等)，对酶活性均有显著提高，其中量子点更具有优势，效果极为明显。
[0005]本发明研究了一种基于荧光毛细管电泳技术(CE-FL)快速检测重组蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法。Jmjd6酶与QDs按摩尔比例8:1在毛细管内进样相同时间，通过控制进样时间来改变进样量，用荧光毛细管电泳检测两者之间的组装，并线性拟合计算结合速率。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是:一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，拓宽其在生物分析领域中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提供了一种根据毛细管电泳峰面积之比的方法检测蛋白酶Jmjd6与量子点的结合速率，该方法稳定性好，重复性高，可以方便快速地得到蛋白酶Jmjd6与量子点的结合速率。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，包括以下步骤:(I)将脂溶性QDs经不同巯基配体稳定转换为水溶性QDs，提高QDs在水溶液中的稳定性，(2)设计含有六聚组氨酸标签的重组蛋白，并通过大肠杆菌原核表达纯化，(3) Jmjd6酶与QDs按摩尔比例8:1在毛细管内进样相同时间，通过控制进样时间来改变进样量，用荧光毛细管电泳检测两者之间的组装和结合速率。
[0009]步骤(3)所述的荧光毛细管电泳检测为含有六聚组氨酸标签的重组精氨酸甲基转移酶(Jmjd6)与QDs在毛细管内自组装，分离，荧光检测。
[0010]本发明所述的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe等，并采用GSH表面功能化QDs，使油溶性量子点转为水溶性，提高了 QDs在水溶液中的稳定性。
[0011]采用上述的技术方案后，本发明所取得的有益效果是，本发明提供了一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，可以更方便地计算酶与量子点的结合速率，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点-酶复合物作为纳米荧光探针在生物分析领域的应用。
【附图说明】
[0012]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0013]图1:加」(16和008(摩尔比8:1)在毛细管内进样不同时间后的自组装电泳图。(a)QDs，进样时间分别是 5s (b), 1s (c), 20s (d), 40s (e) ( λ ex= 420nm, λ em= 565nm)。
[0014]图2:S_plM/Stotal与进样时间之间的关系图(标准曲线)。
具体实施方案
[0015]实施例
[0016]本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
[0017]实施例1
[0018]CdSe/ZnS QDs与Jmjd6在毛细管内的结合速率检测
[0019]1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs
[0020]将18mg GSH, 5mg KOH，250 μ L甲醇混匀，取40 μ L混合溶液加入200 μ L脂溶性量子点中，振荡30min。振荡结束后，加入200 μ LlmM NaOH，脂溶性量子点即转移到水相中。取出上层量子点，加入ImL甲醇与30 μ L NaCl (30mg/mL)沉淀，溶于硼酸缓冲液(pH 7.4，1mM)中。反复沉淀两次，最后溶于200 μ L硼缓冲液(pH 7.4，1mM)中。
[0021]2、重组蛋白酶Jmjd6的克隆、表达、纯化
[0022]将jmjd6目的基因序列克隆到载体pET28a上，测序验证。后通过热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中后接种到含有K+(30 μ g/mL)平板上生长。选取单菌落接种到LB(1mL)培养液中，37°C培育过夜。细胞接种到含有I %抗生素LB (IL)培养基中，37°C培育(OD6。。?0.6)。16°C加IPTG(ImM)诱导表达16小时。在0°C进行所有后续步骤，超声处理裂解细胞40min，离心过滤。上清液装入5mL N1-NTA柱，用5倍柱体积的90%缓冲液A(300mM NaCl, 1mM tris-HCl pH 7.4，10%甘油，ImM二硫苏糖醇(DTT)，ImM PMSF)和 10%缓冲液B (与缓冲液A相同，另外加入500mM咪唑)混合冲洗柱子。然后用缓冲液B (10ml)从10%到100%线性梯度洗脱Jmjd6。通过12% SDS-PAGE凝胶分析Jmjd6纯度。Jmjd6酶在脱盐柱中洗脱后浓缩至?50 μ M，-80°C保存。IL细胞培养物产生约1mg纯化Jmjd6酶。
[0023]3、QDs与Jmjd6在毛细管内偶联与检测
[0024]Jmjd6酶与QDs按摩尔比例8:1在毛细管内进样相同时间，通过控制进样时间来改变进样量，用荧光毛细管电泳检测两者之间的组装和结合速率，分析发现，随着进样时间的增加，QDs-Jmjd6复合物(迀移时间330s左右，图l，e)的峰信号逐渐增强，而单独QDs (迀移时间480s左右，图1，a)的峰逐渐减弱，通过不同进样时间下S_plM/Stotal电泳峰面积积分并得到相应的峰面积比，绘制出标准曲线(图2)。
[0025]4、QDs与Jmjd6在毛细管内的结合效率
[0026]通过荧光毛细管电泳检测，其得到的峰面积之比S_plex/StotalS 0.024，标准曲线方程y = 0.024x+0.0266拟合计算Jmjd6与QDs每秒结合率2.4%。
[0027]实施例2
[0028]CdTe/ZnS QDs与Jmjd6在毛细管内的结合速率检测
[0029]1-3步骤同实施例1
[0030]4、QDs与Jmjd6在毛细管内的结合效率
[0031]通过荧光毛细管电泳检测，其得到的峰面积之比S_plM/StotalS 0.031，标准曲线方程y = 0.031x+0.0537拟合计算Jmjd6与QDs每秒结合率3.1 %。
[0032]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
【主权项】
1.一种快速检测蛋白酶Jmjde与量子点结合速率的方法，其特征在于，通过荧光检测蛋白酶Jmjd6与量子点在毛细管内的相互作用，从而测得蛋白酶Jmjd6与量子点的结合速率。2.根据权利要求1所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述蛋白酶Jmjd6与量子点均为纳升级。3.根据权利要求1所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述的蛋白酶Jmjde与量子点进样时间差应保证两者能在有效长度内相互作用。4.根据权利要求3所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于:优先进样量子点。5.根据权利要求1所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述蛋白酶Jmjd6为大肠杆菌原核表达重组蛋白酶，保留Histag。6.根据权利要求5所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述蛋白酶Jmjde带有六聚组氨酸标签，其与金属之间存在金属亲和驱动相互作用，这种结合具有很高的亲和力。7.根据权利要求1所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述量子点为含有Zn的量子点，为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。8.根据权利要求1所述的一种快速检测蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，其特征在于所述检测方法通过控制进样时间来检测两者在毛细管内的结合速率。
【专利摘要】本发明涉及一种基于荧光毛细管电泳技术快速检测毛细管内重组蛋白酶Jmjd6与量子点结合速率的方法，属于纳米生物分析技术领域。其特征在于含有六聚组氨酸标签的重组精氨酸甲基转移蛋白酶(Histag-Jmjd6)与量子点(QDs)在毛细管内相互作用，按摩尔比例8:1在毛细管内进样相同时间，通过控制进样时间来改变进样量，用荧光毛细管电泳检测两者之间的组装和结合速率。该方法可以准确、快速、灵敏的检测蛋白酶Jmjd6与量子点的结合速率，并且操作简单、重复性好，进一步拓宽了量子点在生物分析中与生物大分子之间结合检测的应用。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105181664
【申请号】CN201510560830
【发明人】王建浩, 李进晨, 陈瑶, 滕一万, 蒋鹏举, 邱琳, 王车礼, 张晨澄, 杨丽, 顾亚琴, 刘菲菲, 董冰玉
【申请人】常州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月6日