、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织 免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS和蛋白芯片等。此外，可以使用相关领域中 通常使用的任何方法。
[0143] 通过上述分析方法，可以将受试肝癌患者的样品中的抗原-抗体复合物的形成水 平和形成模式与标准水平进行比较，并可以从中确定出本发明的肝癌预后标志物所编码的 蛋白的存在水平或存在模式，并最终能够预估出肝癌患者的预后。此处，"抗原-抗体复合 物"是指肝癌预后标志物所编码的蛋白与其特异性抗体的复合物。抗原-抗体复合物的形 成水平或形成模式通常可以通过检测与二抗联结的检测标记的信号的大小和模式来测量。 此类检测标记的实例可以是酶、荧光物质、配体、发光物质、纳米颗粒、氧化还原分子和放射 性同位素等，但并不限于此。当使用酶作为检测标记时，可以使用的酶有(6-葡糖醛酸糖苷 酶、P-D-葡萄糖苷酶、P-D-半乳糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯 酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、RNA酶、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷 酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶和(6-内酰胺酶等，但 所述酶并不限于此。当使用荧光物质作为检测标记时，可以使用的荧光物质有荧光素、异硫 氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺等，但所述荧光物质 并不限于此。当使用配体作为检测标记时，可以使用的配体有生物素衍生物等，但所述配体 并不限于此。当使用发光物质作为检测标记时，可以使用的发光物质有吖啶酯、荧光素和荧 光素酶等，但所述发光物质并不限于此。当使用纳米颗粒作为检测标记时，可以使用的纳米 颗粒有胶体金和彩色乳胶等，但所述纳米颗粒并不限于此。当使用氧化还原分子作为检测 标记时，可以使用的氧化还原分子有二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰 亚胺、1，4_ 苯醌、氢醌、K4W(CN)S、[0s(bpy)3]2+、[Ru(bpy)3]2+和[Mo(CN) 8]4 等，但所述氧化 还原分子并不限于此。当使用放射性同位素作为检测标记时，可以使用的放射性同位素有 3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I或 186Re等，但所述放射性 同位素并不限于此。
[0144] "测量结果"是指步骤（A)中的从肝癌组织等收集的基因的表达水平或表达模式中 的至少一项，"对照组的结果"可以指在通过对从肝癌预后已知的肝癌患者组（Al组、A2组、 B组、C组）获得的测量值进行连续变量回归分析而获得的结果中具有最低p值的基因表达 水平，或从表达水平获得的风险评分（参见NEnglJ.Med2007 ;356:11-20)。测量结果或 对照组的结果是用相同方法获得的表达水平或表达模式（高表达或低表达），并且可以根 据不论患者是否患有肝癌都以恒定表达水平表达的对照基因（或基因的组）（B2M、GAPDH、 HMBS、HPRTl和SDHA等）的平均表达水平来确定。
[0145] 通过与从上述患者组获得的对照组的结果进行比较，来表征肝癌患者的测量结 果，从而可以检测出其间的差异，并且可以使用任何可以检测出这种差异的物质来作为用 于特异性地检测肝癌预后标志物的表达水平和/或表达模式的物质。对照组结果与测量结 果之间的差异的检测结果能够为确定肝癌的治疗方法提供信息。
[0146] 另外，本发明提供一种用于预测肝癌预后的方法，所述方法包括：(A)检测获自肝 癌患者的样品中的选自由上表2所示的基因组成的组的一种或至少两种基因（已在对本发 明的用于根据肝癌分期来预测预后的预测肝癌预后用组合物和试剂盒的说明中有所描述） 的表达水平或表达模式中的一项或多项；和（B)将步骤（A)的结果与对照组的测量结果进 行比较，从而预测肝癌预后。
[0147] 上述由基因组成的组还可以包含上表3所示的基因（已在对本发明的用于根据肝 癌分期来预测预后的预测肝癌预后用组合物和试剂盒的说明中有所描述）。
[0148] 除非存在矛盾，针对本发明的用于根据肝癌分期来预测预后的肝癌预后预测方法 而提及的内容也等同地适用于上述方法。
[0149] 此外，除非存在矛盾，针对本发明的组合物或试剂盒而提及的内容也等同地适用 于本发明的方法。
[0150] 本发明的预测肝癌预后的方法可以是为预测肝癌预后提供信息的方法。
[0151 ] 此外，本发明提供包含在本发明的组合物中的核酸或抗体在预测肝癌预后中的应 用。
[0152] 此外，本发明提供用于预测肝癌预后的核酸或抗体，且所述核酸或抗体是包含在 本发明的组合物中的核酸或抗体。
[0153] 除非存在矛盾，针对本发明的标志物、组合物或试剂盒、方法和用途而提及的内容 都等同地适用。
[0154] 发明效果
[0155] 本发明的标志物、组合物或试剂盒以及方法使得可以有效地预测肝癌预后、优选 根据分期来有效地预测肝癌预后。
【附图说明】
[0156] 图1图不了 BCLC分类表。
[0157] 图2~图106是Kaplan-Meier曲线，其图示了通过在复发、存活和无病存活方面 测量本发明的肝癌预后标志物而得到的数据。
【具体实施方式】
[0158] 下文中，将借助于实施例来详细说明本发明；但描述这些实施例仅是为了帮助理 解本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
[0159] 实施例1 :预测肝癌预后
[0160] 用下述方法发现了可用于预测肝癌预后的标志物，经确认，使用这些标志物可以 预测肝癌预后。
[0161] 1-1. RNA 抽提和 cDNA 合成
[0162] 从547位肝癌患者（已诊断出其出现肝癌，并确认了其肝癌的发展）中采集肝癌 组织和附近的正常组织。这些肝癌患者是在诊断后经历了癌症肝脏切除术但没有接受其他 治疗的患者，所述组织是在所述癌症肝脏切除术前采集并冷冻的组织。
[0163] 抽提每份组织的RNA，并按照下述方法合成cDNA。
[0164] 按照制造商的使用说明，使用RNeasy Minikit(Qiagen,德国）从肝癌组织和附近 的正常组织中抽提出总RNA。使用Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies,美国）对所 获得的RNA抽提物的总RNA进行称重。在抽提步骤中进行DNA酶I处理，以将污染了的基 因组DNA从RNA抽提物中除去。将包含4 y g总RNA的样品与2 y 1的10 yM寡聚d(T) 18 引物（Genotech，韩国）在70°C温育7分钟，随后在冰上冷却5分钟。单独制备酶混合物 [总体积11 y 1，制备方法为：添加2 y 1 0.IM的DTT (Duchefa，荷兰）、2 y 110 X逆转录缓 冲液、5 y I 2mM的dNTP、I y I 200U/ y 1的MMLV逆转录酶和I y I 40U/ y 1的RNA酶抑制 剂（Enzynomics，韩国）]。将该酶混合物添加到包含RNA的样品中，之后将其在42°C温育 90分钟，而后在80°C温育10分钟，从而使逆转录酶失活。添加用焦碳酸二乙酯（DEPC)处 理过的水使上述样品的最终体积为400 y 1。
[0165] 1-2:定量实时PCR
[0166] 按照制造商的使用说明，在下表所示的基因标志物的存在下，使用 PRISM7900HT (Applied Biosystems,美国）对从实施例1-1获得的每个cDNA样品进行实时 PCR扩增。
[0167] 该实时PCR分析在10y1的总体积中进行，其中包含5y1的2XTaqman基因表达 主混合物（AppliedBiosystems,美国）、5yM的正向引物和反向引物各Iy1、1y1的IyM 探针（Genotech，韩国）和2y1的cDNA(在对照组中为等量的水）。上述扩增以以下步骤 组成的循环来进行：在95°C进行10分钟的解链步骤，之后是在95°C进行15秒的解链步骤， 以及在60°C进行1分钟的合成步骤。使用PrimerExpress3. 0(AppliedBiosystems,美 国）来设计引物和探针的序列，并用FAM标记所有探针序列的5'末端，用TAMRA标记所有 探针序列的3'末端。将下表16中的以下引物和探针序列用于每种标志物。
[0168][表16]
[0169]
[0170] 每种标志基因的表达都平行测量3次，随后通过减去5种参照基因（B2M、GAPDH、 HMBS、HPRT1和SDHA)的平均表达来进行标准化。将下表17中的引物和探针序列用于参照 基因。
[0171][表 17]
[0172]
[0173] 测量每种标志物的CT(达到阈值所需的循环数），并计算ACT值（每种标志物的 CT减去参照基因的平均CT)。mRNA的拷贝数以2ACT计算。使用对cDNA样品的梯度稀释液 进行同时扩增的结果构建了标准曲线。
[0174] 从以上结果可以看出，利用包含在本发明的组合物中的核酸，可以测量标志物的 表达水平和表达模式。此外，由于mRNA作为转录本被翻译成蛋白，还可以推知，利用包含在 本发明的组合物中的抗体，还可以测量标志物的表达水平和表达模式。
[0175] 1-3.统计学分析
[0176] 考虑到从实施例1和2获得的每种标志物的标准化表达以及提供肝癌组织的患者 的进展，完成了Kaplan-Meier曲线，并随后进行了显著性分析。
[0177] 基于提供了肝癌组织的患者的进展，对于复发、存活和无病存活的各种情况，按时 期升序排列了患者。通过用存活者（或复发的患者）的数量除以面临风险的患者数量，计 算出了区间存活率（或区间复发率）。累积存活率（或累积复发率）为条件概率，其通过以 下方法来计算：用之前的累积存活率（或累积复发率）乘以当前的区间存活率（或区间复 发率）。Kaplan-Meier曲线被构建为阶跃函数，其中横轴为存活时间（或观察期），纵轴为 累积存活率（或累积复发率）。
[0178] 对于每种标志物，完成了对应于复发、存活和无病存活的Kaplan-Meier曲线。根 据经实验确定的在统计学上具有显著性的参照值，将在实施例1和2中测得的每种标志物 的表达分类为高表达和低表达，并使每种标志物的高表达情形和低表达情形彼此分开，从 而完成Kaplan-Meier曲线。作为所述参照值，选择了在连续变量的回归分析结果中具有最 低P值的基因表达值（见NEnglJMed2007;356:11-20)。将这些值用于Kaplan-Meier 曲线以绘制成图（J.Amer.Statist.Assn. 53:457481，1958)。用于确定Kaplan-Meier曲线 中的显著性的标准是单基因或基因组合的P值是否低于0. 05。
[0179] 绘制Kaplan-Meier曲线是为了在547位分期尚未得到归类的肝癌患者中针对57 种单基因、31种单基因和其中的至少两种的组合组成的基因的组来预测复发、存活和无病 存活。将57种单基因的结果示于图2~22中。57种单基因的关于复发的Kaplan-Meier 曲线示于图2~8中，57种单基因的关于存活的Kaplan-Meier曲线示于图9~15中，57 种单基因的关于无病存活的Kaplan-Meier曲线示于图16~22中。
[0180] 从这些图中可以确认，在针对复发、存活和无病存活而完成的Kaplan-Meier曲线 中，每种标志物都形成了高表达情形和低表达情形彼此明显区分开