专利名称：一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法
技术领域：
本发明涉及植物抗逆性基因研究领域，具体涉及一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。
背景技术：
甘鹿(Saccharum officinarum L.)是世界上主要的糖料作物,鹿糖约占糖总产量的70%。而我国是世界甘蔗发源地之一，也是世界上主要的甘蔗糖生产国，目前蔗糖产量占据世界第三位。除了制糖以外甘蔗还用于造纸及燃料乙醇生产。同样，甘蔗糖业在国民经济中占有重要地位，是解决世界能源危机最重要的非粮生物质能源作物之一。近年来，螟虫是我国蔗区发生最普遍、危害最严重的甘蔗类害虫，具有全生长季、钻蛀性危害等的特点，苗期枯心率一般达10% 20%,严重的高达60% (HuangY K,Liff F. SugarCropsChina,2006(4) :34-35)，中后期危害造成蔗糖分显著降低，并引起风折等现象产生。目前，防治甘蔗螟虫危害已成为当前甘蔗生产上的一项非常重要的工作。而以综合及环保观点来治理螟虫，是当今甘鹿领域植保工作者面临的新任务(Reagan TE. LouisianaAgric,2001,44:16-18)。甘蔗转基因安全等级为I级，又是无性繁殖作物和工业原料作物，因此，转基因改良具有明显的优势。国外防治实践证明，种植抗虫甘蔗品种是防治甘蔗螟虫最安全、经济有效的方法，具有持久性和累积性的经济效益，因而是综合防治的首选措施(Smith C M. Wiley, New York. 1989) 并且该措施不与其它防治措施相冲突(KoganM. Wiley, New York. 1994. 73-128)。如果是大面积种植还可以降低整个区域的螟虫群体数量(Reay-JonesFPF, ShowlerAT, ReaganTE, et al. EnvironmentEntomology,2005,34 1558-1565)。自 1999 年 Arencibia 等(Arencibia A, Carmona E, Cornide M T, et a. ITransgenRes, 1999,8 (5) :349-360)最早报道转cryIA基因改良甘鹿抗螟虫性状以来,先后又报道了 3例转crylAb、gna和pinll基因改良抗莖螟或墨西哥稻螟的抗性研究。目前危害甘蔗的杂草有100多种，亚热带地区高温、高湿气候和蔗地长期裸露特别适合杂草生长，需要大量人工进行除草，大大增加了甘蔗生产的投入，同时也给甘蔗生产带来严重损失(李松，廖江雄，谢廷林，等.糖料甘蔗生产杂草防除技术[J].中国糖料，2010(3) :49-51)。种植转基因的抗除草作物能够大大减少工作量，实现机械化作业，降低成本，目前抗除草剂的大豆已经在生产上广为应用。在经过15年的发展后，2010年转基因作物累计种植面积已逾10亿hm2，抗除草剂转基因作物面积也逐年增加甘蔗没有抗除草剂的基因资源，只能通过导入外源基因才能增强甘蔗的抗除草剂能力。甘蔗转基因研究主要集中在抗病虫、抗旱和抗除草剂等领域。在甘蔗抗除草剂转基因育种中，来自土壤吸水链霉菌并能够编码膦丝菌素乙酰转移酶的Bar基因能使草丁膦的有效成份PPT的自由氨基乙酰化，不能抑制GS的活性，从而使植株获得抗除草剂的能力(段发平，梁承邺，黎垣庆.Bar基因和转Bar基因作物的研究进展[J].广西植物，2001，21 (2) =166-172. ) 0目前将Bar基因导入甘鹿已有成功报导，获得了具有抗草丁膦的甘鹿植株(Manickavasagam M, GanapathiA,Anbazhagan V R, et al. Plant Cell Rep,2004, 23 :134-143)。因此，针对以上提出的问题，有必要设计一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。为了解决以上提出的问题，本发明采用的技术方案为—种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，包括以下步骤SI、植物表达载体的构建步骤，具体为，参考载体pCambial300多克隆位点，分别设计抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和启动子引物组合，再分别用引物组合进行PCR扩增相对应的BT基因、Bar基因和启动子的质粒；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收，再经T-克隆、阳性筛选后，进行测序，依据pCambial300多克隆位点(MCS)和引物两端酶切位点的特点，将测序正确的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和Ubi-I启动子片段插入载体pCambial300,从而获得甘鹿转基因植物表达载体pCambial300-BT_bar ；S2、导入外源基因步骤，具体为，选取甘蔗植株受体，制作胚性愈伤组织；提取步骤SI中的植物表达载体pCamb i a 1300-BT-bar的质粒DNA并纯化，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理。S3、在轰击处理后，通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理后获得阳性的甘蔗转基因植株的步骤。优选的，所述步骤SI中，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳。优选的，所述步骤S2中，制作胚性愈伤组织的具体步骤为从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75%的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上IOcm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CMl上，在26°C _28°C黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。优选的，所述步骤S2中,植物表达载体pCambial300-BT-bar的质粒DNA并纯化后定量至I μ g μ L^10优选的，所述步骤S2中，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理的具体步骤为在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径O. 3-0. 5cm)，接种于高渗透培养基(MS+2mgL-12，4-D+0. 2mol/L 山梨醇 +0. 2mol/L 甘露醇 +30g L—1 蔗糖 +egL—1琼脂粉，PH5.8)中，进行预处理；在轰击前30min将渗透处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2. 5cm)位置；然后用基因枪对培养皿进行轰击处理。优选的，所述基因枪的型号为roS-1000/He型。优选的,所述基因枪的轰击参数为轰击距离6cm,气压IlOOpsi,鹤粉/DNA用量为600 μ gy L_l，沉淀剂用 2. 5mol/L 的 CaCl2 和 O. lmol/L 的亚精胺。本发明的有益效果在于本发明公开的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基·4因导入甘蔗后的蛋白质，该共价基因的超量表达，在一定程度上提高了甘蔗的抗螟虫和抗除草剂两种抗性，能够增产和改善农业操作，降低生产投入，具有极大的商业生产价值。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明提供一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其具体实现的方法为(I)选择受体材料用于甘鹿(Saccharum officinarum L.)遗传转化的受体材料为新台糖22号和桂糖03-1403甘蔗植株，本实施例中由广西农科院甘蔗研究所提供。菌株及质粒crylAc基因可以直接获得,植物表达载体质粒由澳大利亚Cambia公司引进，大肠杆菌(E.Coli)DH5a菌株在本实施例中由广西甘蔗遗传改良重点开放实验室提供。培养基诱导培养基CM1为MS+3mg 1^2，4-D+30gL_l蔗糖+egL—1琼脂粉，pH5. 8 ;继代培养基CM2为MS+2mg ^2,4-0+308 Γ1蔗糖+egL—1琼脂粉，pH5. 8 ;分化培养基CM3为MS+2. Omg L_1BA+0. 5mg L_1KT+0. 2mgr1NAA+30gr1 蔗糖 +6g Γ1 琼脂粉，Η5. 8 ;生根培养基CM4 l/2MS+0. 2mgr16-BA+3mg L^NAA+eOgL-1 蔗糖 +6gL-1 琼脂粉，pH5. 8。(2)植物表达载体的构建参考载体pCambial300多克隆位点，分别设计抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和启动子引物组合，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，测序全部由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物序列如下分别用引物组合进行PCR扩增相对应的BT基因、Bar基因和启动子的质粒，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，分别回收，T-克隆、阳性筛选，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，依据pCambial300多克隆位点(MCS)和引物两端酶切位点的特点，将测序正确的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和Ubi-I启动子片段插入载体pCambial300，获得甘鹿转基因植物表达载体pCamb ial 300-BT-bar。(3)导入外源基因从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75%的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上IOcm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CM1I，在26°C_28°C黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。提取植物表达载体pCamb ial 300-BT-bar的质粒DNA并纯化，定量至I μ g μ L—1。在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径O. 3-0. 5cm)，接种于高渗透培养基(MS+ZmgLlj-D+O. 2mol/L 山梨醇 +0. 2mol/L 甘露醇 +30g L—1 蔗糖 +egL—1 琼脂粉，pH5. 8)中，进行预处理。轰击前30min将渗透处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2. 5cm)位置。基因枪为Bio-Rad公司PDS-1000/He型，每皿轰击I次。采用优化的轰击参数轰击距离6cm，气压I IOOpsi。钨粉/DNA用量为600 μ g μ L_S沉淀剂用2. 5mol/L的CaCl2和O. lmol/L的亚精胺(现配现用)，其具体步骤按照roS-1000/He型基因枪操作说明书进行。
(4)转基因再生植株获得通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理获得阳性甘蔗转基因植株。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于，包括以下步骤51、植物表达载体的构建步骤，具体为参考载体pCambial300的多克隆位点，根据抗螟虫(BT)、抗除草剂(Bar)基因和启动子序列分别插入合适的酶切位点，通过基因重组技术将抗螟虫(BT)、抗除草剂(Bar)基因和启动子插入载体pCambial300，获得甘蔗转基因植物表达载体 pCambial300-BT-bar。52、导入外源基因步骤 ，具体为利用基因枪将包裹植物表达载体pCambial300-BT-bar的微子弹轰击甘鹿胚性愈伤组织。53、轰击处理后，通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理后获得阳性的甘蔗转基因植株。
2.根据权利要求I所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述步骤SI中，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。
3.根据权利要求I所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述步骤S2中，制作胚性愈伤组织的具体步骤为从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75%的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上IOcm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CMl上，在26°C _28°C黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。
4.根据权利要求I所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述步骤S2中，植物表达载体pCambial300-BT-bar的质粒DNA并纯化后定量至I μ g μ L^10
5.根据权利要求I所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述步骤S2中，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理的具体步骤为在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径O. 3-0. 5cm)，接种于高渗透培养基(MS+ZmgLl，4-D+O. 2mol/L山梨醇+0. 2mol/L甘露醇+30g L—1蔗糖+egL—1琼脂粉，PH5.8)中，进行预处理；在轰击前30min将渗透处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2. 5cm)位置；然后用基因枪对培养皿进行轰击处理。
6.根据权利要求5所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述基因枪的型号为ros-iooo/He型。
7.根据权利要求5所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于所述基因枪的轰击参数为轰击距离6cm，气压IIOOpsi，钨粉/DNA用量为.600 μ gy ΙΛ沉淀剂用2. 5mol/L的CaCl2和O. lmol/L的亚精胺。
全文摘要
本发明涉及植物抗逆性基因研究领域，公开了一种抗螟虫和抗除草剂共价外源基因导入甘蔗的方法，具体包括S1、植物表达载体的构建步骤；S2、导入外源基因步骤；通过抗性筛选、PCR鉴定和无毒处理后获得阳性的甘蔗转基因植株的步骤。本发明改良了甘蔗遗传特性，一定程度上提高了甘蔗的抗螟虫和抗除草剂的能力。
文档编号A01H5/00GK102911965SQ20121046223
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者李鸣, 梁朝旭, 方位宽, 何姗姗, 马建华 申请人:南宁奥扬高科农业科技有限公司