专利名称：抗除草剂的草类物种的开发的制作方法
技术领域：
本文所揭示的本发明大致涉及对选择性除草剂具有抗性的草类和开发所述草类 的方法。
背景技术：
海雀稗(Seashore paspalum/Paspalum vaginatum)是一种温季草坪草,一般适 合于沙丘环境。海雀稗的有利性质包括其对盐、水浸和干旱的耐受性。这些特征使得雀稗 属(paspalum)成为用于任何或所有这些环境问题都会成为问题的比赛场地的优质草坪草 候选者。举例来说，高尔夫球场设计师推荐海雀稗用于盐或水质会影响草坪草生长和维护 的热带或亚热带沿海地区的新球场。另外，许多现有的高尔夫球场已用雀稗属替代狗牙根 (bermudagrass/Cynodon dactylon)。与狗牙根相比，雀稗属需要的氮气更少并且对用含盐 或劣质水冲洗的耐受性更好，这会降低管理成本并改善冲冼灵活性。用雀稗属替代狗牙根的主要局限性是狗牙根的重新建植。狗牙根具有高竞争性并 且一旦建植就难以去除。狗牙根和其它似杂草的草类会大大降低雀稗属草坪的审美价值和 质量。因此，需要控制或限制雀稗属繁殖区中的狗牙根或似杂草的草类生长。为控制雀稗 属繁殖草坪草区中的似杂草的草类的生长，需要开发对选择性除草剂具有抗性的雀稗属草 坪草。过去开发抗除草剂的草坪草的方法包括使用基因工程方法。然而，由于政府关于使 用基因改造植物的条例和限制，因此通过基因工程方法制造的植物可能难以商业化。因此， 本发明的实施例包括开发对除草剂具有非转基因抗性的草坪草栽培品种，以及具有转基因 抗性的栽培品种。
发明内容
本发明的实施例涉及一种选择和培养的来自黍亚科群组的抗乙酰辅酶A羧化酶 抑制剂除草剂的植物，或其组织、种子或子代。在一些实施例中，从已经历选择方法的抗 除草剂的未分化细胞再生抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物，其中所述选择方法包 括从黍亚科群组的植物提供未分化细胞的愈合组织，使所述愈合组织与足以延缓生长或 杀死愈合组织的量的至少一种除草剂接触，基于所述除草剂的不同作用选择至少一种抗性 细胞，和从所述至少一种抗性细胞再生所述品种的能生存的整个植物。在一些实施例中，所 述植物是非转基因植物。在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物是黍族 (Paniceae)的成员。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物是一种选 自以下的群组的植物地毯草属(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、马唐属(Digiteria) (马唐草(crabgrass))、稗属(Echinochloa)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)(百喜草 (Bahiagrass))(Pennisetum)(Setaria)禾口 1 卩十胃属(Stenotaphrum) (圣奥古斯丁草(St. Augustine grass))。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂 除草剂的植物是一种选自以下的群组的植物海雀稗(seashore paspalum/P. vaginatum)、剪股颖属草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、结缕草(Zoysiagrass)、狗 牙根(狗牙根属(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克萨斯早熟 7^ (Texas Bluegrass) > H^Jft (Perennial ryegrass) > Sf 41 ^ (buffalograss/Buchloe dactyloides)、百足草(假俭草(Eremochloa ophiuroides))和圣奥古斯丁草(偏序钝叶 胃(Stenotaphrum secundatum)) > WMM- ( WMiM-M )禾口 15 胃(Bahiagrass/Paspalum notatum)。在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物对乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)抑制剂具有抗性。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂 除草剂的植物对环己二酮除草剂、丙酸芳氧基苯氧酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混 合物具有抗性。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物对至少一 种选自以下的群组的除草剂具有抗性禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、 氯丙氧定(cloproxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、环苯草酮 (clefoxydim)、克草同(clethodim)、环杀草(cycloxydim)、得杀草(tepraloxydim)、苯草 酮(tralkoxydim)、炔禾灵(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、赛伏草 (cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、恶唑禾草灵(fenoxaprop)、噻唑禾草灵(fenthiaprop) > 精吡氟禾草灵(fluazaf op-butyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、合氯氟(haloxyfop)、异 恶草醚(isoxapyrifop)、恶唑酰草胺(metamifop)、普拔草(propaquizafop)、快伏草 (quizalofop)、三氟丙酸(trifop)和唑啉草酯(pinoxaden)。在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物的除草剂抗 性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个选自以下的群组的氨基酸位置的突变来赋予 1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过氨基 酸位置1781的异亮氨酸突变成亮氨酸来赋予。本发明的实施例还涉及一种如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制 剂除草剂的植物的子代。在一些实施例中，所述子代是抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂 的植物亲代有性繁殖的结果。在一些实施例中，所述子代是抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除 草剂的植物亲代无性繁殖的结果。本发明的实施例还涉及一种如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制 剂除草剂的植物的种子或其子代。本发明的实施例涉及包含如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂 除草剂的植物或其子代或种子的草地。本发明的实施例还涉及一种包含如任一上述段落中 所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物或其子代或种子的草坪草苗圃地。在本发 明的实施例中，提供一种包含如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂 的植物或其子代或种子的商业草坪、高尔夫球场或牧场。本发明的实施例还涉及一种从黍亚科群组中鉴别抗除草剂植物的方法，其包括 从黍亚科群组的植物提供未分化细胞的愈合组织，使所述愈合组织与足以延缓生长或杀 死愈合组织的量的至少一种除草剂接触，基于所述除草剂的不同作用选择至少一种抗性细 胞，和从所述至少一种抗性细胞再生所述品种的能生存的整个植物，其中所述再生植物对 至少一种除草剂具有抗性。在一些实施例中，所述方法进一步包括将至少一种抗性细胞扩 增为多种未分化细胞。在一些实施例中，从非转基因植物提供未分化细胞的愈合组织。
7
在本发明的一些实施例中，方法中所提供的植物是一种选自黍族的植物。在一 些实施例中，所述植物是一种选自以下的群组的植物地毯草属(地毯草)、马唐属(马唐 草)、稗属、黍属、雀稗属(百喜草)、狼尾草属、狗尾草属和钝叶草属(圣奥古斯丁草)。在 一些实施例中，所述植物是一种选自以下的群组的植物海雀稗、剪股颖属草(剪股颖属 (Agrostis spp))、高羊茅草(tall fescue)、结缕草、狗牙根(狗牙根属)、草地早熟禾、得 克萨斯早熟禾、黑麦草、野牛草、百足草(假俭草)和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、地毯草 (地毯草属)和百喜草。在本发明的一些实施例中，方法中所使用的至少一种除草剂是乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)抑制剂。在一些实施例中，至少一种除草剂是选自以下的群组禾草灭、丁苯草 酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草 酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、 异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。在本发明的一些实施例中，植物的除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的选 自以下的群组的至少一个氨基酸位置的突变来赋予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过氨基酸位置1781的异亮氨酸突变成亮 氨酸来赋予。本发明的实施例还涉及一种抗除草剂植物的可再生细胞的组织培养，其是通过如 上述段落中所述的方法来进行。在本发明的实施例中，一种控制抗除草剂植物附近的杂草的方法，其中所述抗除 草剂植物是通过上述段落中所述的方法来鉴别，所述方法包括使至少一种除草剂与所述 杂草和抗除草剂植物接触，其中所述至少一种除草剂是以足以抑制同一物种的非选择植物 生长或足以抑制杂草生长的速率与杂草和植物接触。在一些实施例中，抗除草剂植物对乙 酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂具有抗性。在一些实施例中，方法包括使除草剂直接与抗 除草剂植物接触。在一些实施例中，方法包括使除草剂与抗除草剂植物所在的生长培养基 接触。在一些实施例中，抗除草剂植物对环己二酮除草剂、丙酸芳氧基苯氧酯除草剂、苯 基吡唑啉除草剂或其混合物具有抗性。在一些实施例中，抗除草剂植物是非转基因植物。在本发明的一些实施例中，植物的除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的至 少一个选自以下的群组的氨基酸位置的突变来赋予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的氨基酸位置 1781的异亮氨酸突变成亮氨酸来赋予。在一些实施例中，方法中所使用的至少一种除草剂是选自以下的群组禾草灭、丁 苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、 炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合 氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。本发明的实施例涉及一种以ATCC寄存编号_寄存的海雀稗特异性DNA标
记，或其能够鉴别抗除草剂的草类栽培品种的片段。在一些实施例中，海雀稗特异性DNA标 记包含SEQ ID NO 5或其片段。本发明的实施例还涉及一种鉴别抗除草剂植物的方法，其包括获得植物的遗传
8学样品，和测定所述样品中存在或不存在乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的突变，其中 存在位置1781的突变指示植物具有除草剂抗性。还涵盖乙酰辅酶A羧化酶的位置1781的 标记在鉴别抗除草剂植物的方法中的用途。本发明的实施例涉及一种标记辅助育种的方法，其包括以下步骤鉴别所关注用 于育种和选择的特征，其中所述特征与乙酰辅酶A羧化酶基因有关；提供带有能够赋予植 物对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的抗性的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的第一植物， 其中所述植物进一步包含所关注之特征；用第二植物培育所述第一植物；鉴别育种步骤的 子代为具有所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体；和基于所述鉴别步骤选择可能具有所关注 的特征的子代。在一些实施例中，所述特征选自性状或基因。在一些实施例中，所述性状 是至少一种选自由以下组成的群组的性状除草剂耐受性、疾病抗性、害虫昆虫抗性、脂肪 酸改变、蛋白质或碳水化合物代谢、生长速率增加、胁迫耐受性增强、优先成熟、感官性质增 强、形态特征改变、不能繁殖、其它农业性状、工业用途的性状或改善消费者吸引力的性状。在本发明的一些实施例中，方法中所包括的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体包括以 下至少一个位置的变化:1756、1783、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例 中，植物抗性所针对的除草剂是至少一种选自以下的群组的除草剂禾草灭、丁苯草酮、氯 丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯 伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶 草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯.在一些实施例中，方法中所包括的鉴别步骤包括选自以下的过程序列变异体的 分子检测、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性的观察和通过应用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂进行 选择。本发明的实施例涉及一种用包含具有从ATCC寄存编号_的序列衍生的
至少250个碱基的DNA区段转化的转基因植物，和其子代植物。在一些实施例中，所述子代 植物选自回交子代、杂交、克隆子代和同胞交配子代。在一些实施例中，所述DNA区段包含 从SEQ ID NO 5衍生的至少个250碱基。本发明的实施例还涉及一种含有包含从ATCC寄存编号_的序列衍生的
至少250个碱基的DNA区段的转化细胞。在一些实施例中，所述DNA区段包含从SEQ ID NO 5衍生的至少个250碱基。在本发明的实施例中，提供一种鉴别乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的突变的 方法，所述方法包括从细胞获得遗传学样品，通过在扩增步骤中使用SV384F引物和SV348R 引物来选择性扩增DNA片段，和对所述DNA片段测序以确定存在或不存在乙酰辅酶A羧化 酶基因的位置1781的突变，其中DNA片段中存在突变指示细胞中存在位置1781的突变。
所属领域的技术人员应了解下文所述的图示仅用于说明性目的。所述图示无论如 何也不打算限制本发明教示的范围。图1是植物的脂肪酸生物合成路径的图。图2是用于如本文所揭示的选择非转基因抗除草剂植物的除草剂选择方案的一 实施例的说明。
图3是说明海雀稗的稀禾定剂量-反应曲线的图。图4是生长于含有稀禾定的愈合组织诱发培养基上的海雀稗的抗稀禾定愈合组 织的照片。图5是一系列色谱图，其说明如本文所揭示而选择的抗除草剂海雀稗植物的乙酰 辅酶A羧化酶基因的位置1781的氨基酸突变。图6是说明在处理后7天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物 对kgment 稀禾定的反应的照片。图7是说明在处理后7天(DAT) kgment 稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选 择的抗除草剂植物的损伤的图。图8是说明在处理后14天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植 物对kgment 稀禾定的反应的照片。图9是说明在处理后9天(DAT) kgment 稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选 择的抗除草剂植物的损伤的图。图10是说明在处理后21天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植 物对kgment 稀禾定的反应的照片。图11是说明在处理后21天(DAT) kgment 稀禾定对对照植物和抗除草剂植物的 损伤的图。图12是说明在处理后42天(DAT)在用kgment 稀禾定处理后对照植物和如本 文所揭示而选择的抗除草剂植物的平均干重的图。图13是说明在处理后21天(DAT)Poast 稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选 择的抗除草剂植物的损伤的图。图14是说明在处理后21天(DAT)Fusilade II 精吡氟禾草灵除草剂对对照植物 和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的损伤的图。图15是说明在处理后21天(DAT)Acclaim Extra II精恶唑禾草灵 (fenoxaprop-p-butyl)除草剂对对照植物和抗除草剂植物的损伤的图。图16是由植物居间分生组织获得的愈合组织产生的一实施例的说明。
具体实施例方式对选择性除草剂的抗性可提供控制各种草坪草物种中的似杂草的草类的高效方 法。已提出用于开发抗除草剂植物的基因工程方法，然而由于政府关于使用基因改造植物 的条例和限制，因此这些方法可能难以商业化。相比之下，目前通过非转基因方法得到的具 有除草剂抗性的植物的环境释放不服从严格的政府条例。因此，本发明的实施例涉及筛选 和选择抗除草剂的草坪草植物的方法，包括不通过转基因而有效的方法。^X除非另作说明，否则所属相关领域的技术人员应根据常规用途来了解术语。如本文中所使用，术语“外植体”是指包括分生组织的植物组织。其也可指包括 (但不限于)一个或一个以上胚、子叶、下胚轴、叶基、中胚轴、胚芽、原生质体和胚轴的植物 组织。如本文中所使用，术语“愈合组织”是指可生长或维持在培养基中以产生遗传一致细胞的未分化的植物细胞块。如本文中所使用，术语“抗除草剂”或“除草剂耐受”(包括其任何变化形式)是 指植物从与足以引起同一物种的非抗性植物的生长延缓或死亡的量的除草剂接触中恢复、 在接触后存活和/或茁壮成长。足以引起非抗性植物的生长或死亡的除草剂的量通常在约 2μΜ到约100 μ M除草剂浓度的范围内。在一些实施例中，除草剂的足够量在约5μ M到约 50 μ M除草剂浓度、约8 μ M到约30 μ M除草剂浓度或约10 μ M到约25 μ M除草剂浓度的范 围内。或者，足以引起非抗性植物的生长或死亡的除草剂的量在每公顷约25克活性成分(g ai ha-1)到约6500g ai ha—1除草剂施用的范围内。在一些实施例中，除草剂的足够量在约 50g ai ha—1到约5000g ai ha"1除草剂施用、约75g ai ha"1到约2500g ai ha"1除草剂施 用、约 IOOg ai ha4 到约 1500g ai ha—1 除草剂施用、或约 250g ai ha4 到约 IOOOg ai ha-1 除草剂施用的范围内。如本文中所使用，术语“标记辅助选择”是指通过检测与所需性状有关的一个或一 个以上标记来选择植物的所需性状的过程。所述标记可为表型标记，例如除草剂或抗生素 抗性。而且，所述标记可为分子标记，例如一种或一种以上多态现象(如下文所述)、DNA或 RNA酶、或容易检测的其它序列。对于个别植物为“外源性”的多核苷酸是通过除有性杂交外的任何方法引入植物 中的多核苷酸。下文描述可用来完成的方法的实例，并且包括转化、基因枪法、电穿孔等。所 述含有外源性核酸的植物是称作Rtl (用于在活体外从转化细胞再生的植物)产生转基因植 物。R。还可指无论是转基因还是非转基因的任何其它再生植物。如本文中所使用，术语“转基因”描述含有人工改造的基因组的非天然存在的植 物，其中所述植物在其基因组中包括外源性核酸分子，所述分子可来源于相同物种或不同 物种，包括非植物物种。外源性核酸分子可为基因调控元件，诸如启动子、增强子或其它调 控元件，或可含有可与天然或异源基因调控元件有关的编码序列。通过有性杂交或通过自 体受精产生的转基因植物是所述植物的子代。如本文中所使用，“多态现象”意思是在一个或一个以上个体的群体中核酸序列的 一个或一个以上基因座存在一个或一个以上变化。所述变化可包含(但不限于)一个或一 个以上碱基变化、一个或一个以上核苷酸插入或一个或一个以上核苷酸缺失。多态现象包 括单核苷酸多态现象(SNP)、简单序列重复(SSR)、插入缺失(indel)(插入和缺失)、限制 片段长度多态现象、单倍体和标记SNP。另外，多态现象可包括遗传标记、基因、DNA衍生序 列、RNA衍生序列、启动子、基因的5 ‘未翻译区、基因的3 ‘未翻译区、微小RNA (microRNA)、 siRNA、定量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录概况或甲基化模式。多态现象可由核酸复制的随机处理、通过突变诱发、由移动 基因组元件、由拷贝数变化和在减数分裂过程期间引起，诸如不等交换、基因组加倍和染色 体破坏和融合。变化可常见于群体中或可较低频率地存在于群体中，前者在普通植物育种 方面具有较大效用且后者可能与稀少但重要的表型变化相关。如本文中所使用，“标记”是指多态核酸序列或核酸特征。在更广泛的方面，“标记” 可为可用于区别有机体之间的可遗传差异的可检测特征。所述特征的实例可包括遗传标 记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组 成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药物、淀粉组成、淀粉水平、可发酵淀粉、发酵产率、发酵效率、能量产率、次要化合物、代谢物、形态特征和农业学特征。如本文所使用，“标记分析”指的是一种使用特定方法检测特定基因座的多态性的 方法，例如测量至少一种表型(例如种子颜色、花朵颜色或其他可目测的性状)、限制性片 段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、 随机扩增多态DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸定序技术等。如本文所使用，“基因型”指的是表型的遗传组成，且此可使用标记物间接表征或 通过核酸定序直接表征。适合标记物包括表型特征、代谢特征、遗传标记或一些其他类型的 标记物。基因型可构成至少一种遗传标记物基因座的等位基因或至少一种单倍体窗的单倍 体。在一些实施例中，基因型可表示单个基因座，且在其他实施例中，可表示全基因组的基 因座。在一些实施例中，基因型可以反映部分染色体、整个染色体、部分基因组和整个基因 组的序列。如本文所使用，“数量性状基因座(QTL) ”指的是数量上控制到一定程度的基因座， 其可表示一般连续分布的形状。如本文所使用，“核酸序列片段”指的是聚核苷酸的一部分核苷酸序列或多肽的一 部分胺基酸序列。核苷酸序列的片段可以编码保留天然或相应全长蛋白质的生物活性的蛋 白质片段。核苷酸序列的片段范围为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、 约250个核苷酸，且至多基因的全长核苷酸序列或编码本文所揭示蛋白质的序列。供筛选的适合植物本发明的实施例针对由除草剂抗性细胞(所述细胞已经历除草剂选择过程)再 生的黍亚科(Panicodae)除草剂抗性植物，以及其识别方法。所述植物可以从以下各物 的群组中选出柳叶箬族(Isachneae tribe)、Neurachneae 族、Arundinellaeae 族和黍 族(Paniceae tribe)。在一些实施例中，所述植物可为选自表A或表B中所提供的清单的 属的任何成员。适用于本发明的例示性(非详尽)植物清单包括黍族的成员，例如地毯草 (Carpetgrass)、马唐草、百喜草、圣奥古斯丁草(St. Augustine grass)和栗(millet)，包 括狐尾草(Foxtail)(谷子(Setaria italical))、珍珠粟(Pearl，Pennisetam glaucum) 禾口泰(Proso,Panicum miliaceum ；通常禾尔为“常见，，泰、高梁泰(broom corn millet)、赤泰 (hog millet)或白黍子(white millet)。在一些实施例中，所述植物为具有商业应用价值的草坪草种类，例如高尔夫球场、 田径场、商业绿化、商业或家庭草坪、和牧场。例示性草坪草种类包括(但不限于)海雀 稗、百喜草、狗牙根(狗牙根属)、blue gramma grass、野牛草、地毯草(地毯草属)、百足 草(假俭草)、克育草(kikuyugrass)、垂穗草(sideoats grama)、圣奥古斯丁草(偏序钝 叶草)、结缕草、一年生早熟禾(annual bluegrass)、一年生黑麦草(annual ryegrass)、加 拿大早熟禾(Canada bluegrass)、细叶型羊茅(chewings fescue)、细弱剪股颖(colonial bentgrass) ^1 ' ! !! (creeping bentgrass)、^水草(crested wheatgrass)、扁 (fairway wheatgrass)、硬羊茅(hard fescue)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、得克 萨斯早熟禾、果园草(orchard grass)、黑麦草、红牛毛草(red fescue)、红顶草(redtop)、 粗莲苗系草(rough bluegrass)、羊茅(sheep fescue)、无芒雀麦(smooth bromegrass)、 高羊茅草、猫尾草(Timothygrass)、绒毛剪股颖(velvet bentgrass)、碱茅(weeping alkaligrass)、纳托尔氏脸茅(western wheatgrass)等。
表A.黍亚科属成员(根据族编组)
权利要求
1.一种选择和培养的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其来自黍亚科 (Panicodae)群或其组织、种子或子代。
2.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其由经受选择方 法的除草剂抗性未分化细胞再生，其中所述选择方法包含提供来自所述黍亚科群的植物的未分化细胞的愈合组织；使所述愈合组织与至少一种足以延缓所述愈合组织生长或杀死所述愈合组织的量的 除草剂接触；基于所述除草剂的差别作用，选择至少一个抗性细胞；和由所述至少一个抗性细胞再生所述种类的活的全植物。
3.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为 黍族(tribe Paniceae)的成员。
4.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为 选自以下群组的一种地毯草属(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、马唐属(Digiteria) (马唐草(Crabgrass))、稗属(Echinochloa)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)(百喜草 (Bahiagrass))(Pennisetum)(Setaria)禾口 1 卩十胃属(Stenotaphrum) (圣奥古其J 丁草(St. Augustine grass))。
5.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物 为选自以下群组的一种海滨雀稗(seashore paspalum)(海雀稗(P. vaginatum))、剪股 颖属草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、结缕草(Zoysiagrass)、狗牙根 (bermudagrass)(狗牙根属(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克萨(Texas Bluegrass)、黑胃胃(Perennial ryegrass) > Sf 41 ^ (buffalograss/ Buchloe dactyloides)、百足草(centipede grass)(假俭草(Eremochloa ophiuroides)) 和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草(Menotaphrum secundatum))、地毯草(地毯草属)和百喜 (Bahiagrass/Paspalum notatum)。
6.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物对 乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂有抗性。
7.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述 植物对环己二酮(cyclohexanedione)除草剂、芳氧基苯氧基丙酸酯(aryloxyphenoxy proprionate)除草剂、苯基吡唑啉(phenylpyrazoline)除草剂或其混合物有抗性。
8.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述除草剂 抗性是由选自以下群组的乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予 1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099 和 2096。
9.根据权利要求8所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述除草剂 抗性是由氨基酸位置1781上异亮氨酸突变成亮氨酸所赋予。
10.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物 对至少一种选自以下群组的除草剂有抗性禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、 氯丙氧定(cloproxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、环苯草酮 (clefoxydim)、克草同(clethodim)、环杀草(cycloxydim)、得杀草(tepraloxydim)、苯 草酮(tralkoxydim)、炔禾灵(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、赛伏草(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、精恶唑禾草灵(fenoxaprop)、噻唑禾草 灵(fenthiaprop)、精 口比氣禾草灵(fluazafop-butyl)、口比氣禾草灵(fluazifop)、 合氯氟(haloxyfop)、异恶草醚(isoxapyrifop)、恶唑酰草胺(metamifop)、普拔草 (propaquizafop)、快伏草(quizalofop)、三氟丙酸(trifop)禾口唑啉草酉旨(pinoxaden)。
11.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为 非转基因植物。
12.一种根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂 抗性植物的子代。
13.根据权利要求12所述的子代，其中所述子代为所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草 剂抗性植物亲本株有性繁殖的结果。
14.根据权利要求12所述的子代，其中所述子代为所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草 剂抗性植物亲本株无性繁殖的结果。
15.一种根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂 抗性植物的种子。
16.一种根据权利要求12所述的子代的种子。
17.一种根据权利要求13所述的子代的种子。
18.一种根据权利要求14所述的子代的种子。
19.一种草皮，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶 抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。
20.一种草皮草苗圃地，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶 A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。
21.一种商用草地、高尔夫球场或田野，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所 述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。
22.—种鉴别来自黍亚科群的除草剂抗性植物的方法，其包含提供来自所述黍亚科群的植物的未分化细胞的愈合组织；使所述愈合组织与至少一种足以延缓所述愈合组织生长或杀死所述愈合组织的量的 除草剂接触；基于所述除草剂的差别作用，选择至少一个抗性细胞；和由所述至少一个抗性细胞再生所述种类的活的全植物，其中所述再生植物对所述至少一种除草剂有抗性。
23.根据权利要求22所述的方法，其另外包含将所述至少一个抗性细胞扩大至多个未 分化细胞。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物为选自黍族的一种。
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述植物为选自以下群组的一种地毯草属 (地毯草)、马唐属(马唐草)、稗属、黍属、雀稗属(百喜草)、狼尾草属、狗尾草属和钝叶草 属(圣奥古斯丁草)。
26.根据权利要求M所述的方法，其中所述植物为选自以下群组的一种海滨雀稗 (海雀稗)、剪股颖属草(剪股颖属(Agrostis spp))、高羊茅草、结缕草、狗牙根(狗牙根 属)、草地早熟禾、得克萨斯早熟禾、黑麦草、野牛草、百足草(假俭草)和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、地毯草(地毯草属)和百喜草。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种除草剂为乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)抑制剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述除草剂抗性是由选自以下群组的乙酰辅酶 A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099 和 2096。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述除草剂抗性是由氨基酸位置1781上异亮氨 酸突变成亮氨酸所赋予。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种除草剂选自以下群组禾草灭、丁 苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、 炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、 合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
31.根据权利要求22所述的方法，其中未分化细胞的所述愈合组织由非转基因植物提{共。
32.—种通过根据权利要求22所述的方法鉴别的除草剂抗性植物的可再生细胞的组 织培养物。
33.一种控制通过根据权利要求22所述的方法鉴别的除草剂抗性植物附近的杂草的 方法，其包含使至少一种除草剂与所述杂草和所述除草剂抗性植物接触，其中所述至少一 种除草剂以足以抑制同一物种的未选择植物生长或足以抑制所述杂草生长的施用量与所 述杂草和所述植物接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物对乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)抑制剂有抗性。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物对环己二酮除草剂、芳氧 基苯氧基丙酸酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混合物有抗性。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述植物中的所述除草剂抗性是由选自以下 群组的乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予1756、1781、1999、 2027、2041、2078、2099 和 2096。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述除草剂抗性是由所述乙酰辅酶A羧化酶基 因的氨基酸位置1781上异亮氨酸突变成亮氨酸所赋予。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一种除草剂选自以下群组禾草灭、丁 苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、 炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、 合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物为非转基因植物。
40.根据权利要求33所述的方法，其包含使所述除草剂直接与所述除草剂抗性植物接触。
41.根据权利要求33所述的方法，其包含使所述除草剂与所述除草剂抗性植物所处的生长培养基接触。
42.一种寄存为ATCC寄存编号_的海滨雀稗特异性DNA标记物或其片段，其能够鉴别除草剂抗性草栽培品种。
43.一种鉴别除草剂抗性植物的方法，其包含获得植物的遗传样品；和分析所述样品中是否存在乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上的突变，其中位置1781 上存在突变表明所述植物具有除草剂抗性。
44.一种乙酰辅酶A羧化酶的位置1781上的标记物的用途，其用于鉴别除草剂抗性植 物的方法中。
45.一种标记物辅助的培育方法，其包含以下步骤鉴别用于培育和选择的相关特征，其中所述特征与乙酰辅酶A羧化酶基因有关联；提供携带能够赋予所述植物乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性的乙酰辅酶A羧化酶 序列变异体的第一植物，其中所述植物另外包含所述相关特征；将所述第一植物与第二植物一起培育；鉴别所述培育步骤中具有所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的子代；和基于所述鉴别步骤，选择可能具有所述相关特征的子代。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述特征选自性状或基因。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述性状为选自由以下组成的群组的至少一 种除草剂耐性，抗病性，抗虫性，脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢改变，生长速度提高，胁 迫耐性增强，优选的成熟，感官性质增强，地貌特征改变，无菌，其他农业性状，工业用途的 性状，或提高消费者吸引力的性状。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体包含至少一 个以下位置的变异1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099 和 2096。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述除草剂选自禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、 环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛 伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、 恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述鉴别步骤包含选自以下的方法序列变异 体的分子检测、观测对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的抗性、和通过应用乙酰辅酶A羧化酶抑制 剂来选择。
51.一种转基因植物，其经源于SEQ ID NO :5的包含至少250个碱基的DNA区段转化。
52.一种根据权利要求51所述的植物的子代植物。
53.根据权利要求52所述的子代植物，其中所述子代选自回交子代、杂种、克隆子代和 同胞交配子代。
54.一种转化细胞，其含有源于SEQ ID NO 5的包含至少250个碱基的DNA区段。
55.一种鉴别细胞中乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上的突变的方法，其包含从细胞获得遗传样品；通过在扩增步骤中使用SV384F引物和SV348R引物，选择性地扩增DNA片段；和对所述DNA片段测序，以确定所述乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上是否存在突变，其中所述DNA片段中存在突变表明所述细胞中位置1781上存在所述突变。
全文摘要
本发明涉及一种选择和培养的来自黍亚科(Panicodae)群组的抗乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂除草剂的植物，或其组织、种子或子代，和选择所述植物的方法。本发明还涉及控制抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物附近的杂草的方法。
文档编号A01H5/00GK102083303SQ200980123049
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月19日 优先权日2008年6月20日
发明者保罗·L·雷默, 道格拉斯·赫卡特, 韦恩·艾伦·帕罗特 申请人:乔治亚大学研究基金会公司