专利名称：一种与耐氯嘧磺隆相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与耐氯嘧磺隆相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
现代生物技术已引起农业中若干领域的重大变革，其中最突出的是将外源基因导入植物体中的表达，给作物育种带来革命性的变化，使人们摆脱了利用传统杂交技术培育新品种的局面，进入自由构建遗传性状的新时代。通过遗传工程培育转基因抗除草剂作物品种是发展最快、研究最深、农民接受程度最高的案例，其中最关键的环节是抗除草剂基因的获得，从突变的抗除草剂植物和微生物体中分离抗性基因是最主要途径。乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂通过抑制植物体内的乙酰乳酸合成酶活性，从而阻止支链氨基酸的合成，导致蛋白质的合成受到破坏，阻碍细胞分裂期的DNA合成，从而使植物细胞的有丝分裂停止在Gl阶段的S期(DNA合成期)和G2阶段的M期，干扰了 DNA的合成，细胞因此不能完成有丝分裂，进而使植物停止生长，最终导致植物个体死亡。Lawther等(1978)首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中发现并克隆到了乙酰乳酸合成酶基因。Falco等(1985)在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中也发现并克隆到了其ALS基因，各国科学家花费了大量精力去研究各物种中的乙酰乳酸合成酶基因，到目前为止，可在NCBI中搜索到与乙酰乳酸合成酶基因相关的相关信息多达上千条，概括起来至少来源于50个不同的生物种类。随着抗除草剂乙酰乳酸合成酶基因的不断发现和分离，通过转化抗性基因培育抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂作物发展突飞猛进。至今，通过转化乙酰乳酸合成酶酶突变基因，创制出了抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的大豆、玉米、小麦、水稻、油菜、烟草、亚麻等多种作物的抗性品系(Saari L L.et al, 1996 JamesC，1999 ；Baylis A D，2000 ;苏少`泉，2002 James C，2009)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与耐氯嘧磺隆相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐氯嘧磺隆相关的由序列2衍生的蛋白质。上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述的序列2由690个氨基酸组成。编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。上述编码基因为如下(I)或(2)或⑶的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与耐氯嘧磺隆相关蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与耐氯嘧磺隆相关蛋白的DNA分子。上述编码基因中，所述严格条件可为如下:在6XSSC，0.5%305的溶液中，在65°〇下杂交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和1XSSC,0.1% SDS各洗膜一次。上述的序列I由2073个脱氧核苷酸组成，自5’端的第I至2073位核苷酸为蛋白的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),组成。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。上述重组载体具体为将所述蛋白的编码基因插入pGBKT7载体的BamH I和Sal I酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。上述重组菌为将上述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，在本发明的实施例中，上述宿主菌具体为BL21 (DE3)。扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围；在本发明的实施例中，上述引物对的一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列3，上述引物对中的另一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4。
本发明的另一个目的是提供一种耐氯嘧磺隆产品。本发明提供的产品，其活性成分为上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌。上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在制备耐氯嘧磺隆产品中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在耐氯嘧磺隆中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在培育耐氯嘧磺隆植物中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种培育耐氯嘧磺隆重组菌的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:将上述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，所述重组菌的耐氯嘧磺隆性高于所述宿主菌，所述宿主菌具体为酵母AH109R。本发明的实验证明，本发明发现了一个新的蛋白，将其编码基因转入大肠杆菌中表达，可提高转基因菌株的耐氯嘧磺隆能力，得到耐氯嘧磺隆产品。因此，本发明的基因可用于培育高耐氯嘧磺隆转基因作物品种，具有很高的应用价值。
图1为抗氯嘧磺隆TR-H菌株乙酰乳酸合成酶(ALS)酶活性的测定图2为转pGKT7-AnALSl基因的酵母菌株(AH109R)对氯嘧磺隆抗性鉴定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、氯嘧磺隆抗性菌株TR-H的鉴定1、抗氯嘧磺隆TR-H菌株乙酰乳酸合成酶(ALS)酶活性的测定TR-H菌株为东北农业大学农药学科筛选保存，黑曲霉菌株Hml、Hm2、Hm3为黑龙江省微生物研究所提供。供试药剂为98%氯嘧磺隆原药，由大连瑞泽农药股份有限公司生产。取1.0g待测菌体，乙酰乳酸合成酶的提取及活性测定方法，参照陈以峰和路凯介绍的方法，并加以改进(路凯·，钱传范.2000.萘二甲酸酐减轻胺苯磺隆对水稻药害的作用机制.植物保护学报.27(3):268 272 ;陈以峰，李宜慰，汤日圣等.1996.乙酸乳酸合酶活性的简易测定方法建立.江西农业大学学报.18 (2):213 218)。酶比活力定义为单位时间(Ih)内单位蛋白(Img)生成乙酰甲基甲醇的含量,单位为nmol./(h mg.ργο)。相对比活力为同一菌株药剂诱导情况下与微诱导时酶比活力的比值。数据分析如图1所示，TR-H菌株耐氯嘧磺隆的能力显著高于其他菌株，酶活力在供试浓度下与其他三种菌株有显著性差异。2、菌体总DNA的提取将活化好的保存抗氯嘧磺隆菌株孢子接种于液体察氏培养基中，在30°C，150rpm条件下振荡培养2 3d，收集菌丝体，用无菌水冲洗，尽量吸干水分，基因组DNA提取采用Fermentas 公司 Genomic DNA puritication kit 试剂盒法。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量，将基因组DNA溶液放入_20°C冰箱中保存。3、TR-H 菌株 18S rRNA 克隆以Fermentas公司Genomic DNA puritication kit提取的基因组为模板，设计引物为:5' SSU,5; -AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3'；3' SSU, 5; -TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3'进行PCR扩增。反应体系为:DNA模板(20ng/μL)，2.0 μ L ； 10 X PCR Buffer (含 25 μ mol/mLMg2+)，2.0μ L ；2mmol/L dNTPs，2.0 μ L ;5' SSU (2 μ mol/L)，1.5 μ L ;3' SSU (2 μ mol/L), 1.5 μ L ；ExTaq DNA 酶(5U/ μ L)，0.2 μ L ;灭菌 ddH20,10.8 μ L ;总体积 20 μ L。PCR 反应程序:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35个循环；72°C延伸8min。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的条带。PCR产物经Axygen公司的凝胶回收试剂盒提供的方法回收纯化后与T载体连接，测序。以获得序列为信息探针利用GenBank的BLAST程序进行序列比对分析，其与黑曲霉(Aspergillus niger)的18S rRNA具有较高的同源性,进一步利用DNA Star软件包中的MegAlign进行序列比对,其与黑曲霉(Aspergillus niger)的序列同源性高达98%。以菌株TR-H的18S rRNA序列为比对序列，通过GenBank中的BLAST程序比对并下载其近缘菌株的18S rRNA序列。与TR-H的18S rRNA序列一起输入MEGA 4.0软件构建进化树并进行系统发育分析。由系统发育树分析可知，菌株TR-H与Aspergillus niger JC(ER)68267)具有较高的同源性，相似性为92%，遗传距离最近。将菌株TR-H确定为黑曲霉(Aspergillusniger),命名为 Aspergillus niger TR-H(18S 序列，GeneBank 登录号 GU981468)。实施例2、抗氯嘧磺隆蛋白及其编码基因的获得搜索NCBI数据库中与ALS抑制剂靶标酶-乙酰乳酸合成酶(ALS)相关序列，下载全部序列进行生物信息学分析，设计引物，用RT-PCR的方法从黑曲霉(Aspergillus nigerTR-H)的菌丝体中克隆该具有抗氯嘧磺隆功能的乙酰乳酸合成酶的基因的cDNA序列。具体方法为:将菌株黑曲霉(Aspergillus niger TR-H)(张洪岩，张庆贺，张利斌，陶波.2010.抗氯嘧磺隆黑曲霉乙酰乳酸合成酶(ALS)酶学特性研究.油料作物学报.32 (4) =563-566,公众可从东北农业大学；中国农业科学院作物科学研究所获得)接种在含有氯嘧磺隆500mg/L的察氏培养基(配方:蛋白胨5g、葡萄糖20g、NaN033g、KC10.5g、MgSO40.5g、K2HPO4Ig' FeSO40.lg、水 IOOOmL, pH 值自然)中，在 30°C，150rpm 的摇床中恒温培养 48h，收集菌丝体用DEPC水冲洗后提取RNA并反转录成cDNA第一链，以该cDNA为模板，用引物AncDF, 5; -ATG ATG CCT ATG AGA CCT TC-3'(序列 3) ；AncDR, 5; -TTA GAA ACC GGGAAC TTT C-3'(序列4)进行PCR扩增。PCR 反应体系为:10XBuffer 2.5 μ L, dNTP 2.5mM, AncDF 5 μ M, AncDR 5 μ Μ,cDNA 20ng, Taq酶1U，加去离子水至25 μ L。PCR 反应程序:先 94°C 5min ;然后 94°C 30S, 55°C 30s, 72°C lmin,扩增 35 个循环；最后72°C延伸8min。PCR扩增得到2. 1kb左右的片段。将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列I所示的核苷酸，将该基因命名为AnALSI，该基因编码的蛋白命名为AnALSI。该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。序列I由2073个核苷酸组成，其编码区为序列表中序列I的5’端的第I至2073位核苷酸，序列2由690个氨基酸组成。人工合成序列I。实施例3、抗氯嘧磺隆蛋白及其编码基因的功能验证1、抗氯嘧磺隆蛋白的获得将AnALSl的ORF克隆pGBKT7载体并置于T7启动子控制下，具体方法为:根据上述AnALSlcDNA序列设计引物，序列如下所示:AncDFl，5, GA GGA TCCGTATGA TGC CTA TGA GAC CTT C~3'(序列5，下划线标注的是BamH I酶识别位点)；AncDRl,5' -TC GTC GAC TTA GAA ACC GGG AAC TTT CC-3'(序列 6，下划线标注的是 Sal I 酶识别位点)。将菌株黑曲霉(Aspergillus niger TR-H)接种在含有氯卩密磺隆500mg/L的察氏培养基中，在30°C，150rpm的摇床中恒温培养48h，收集菌丝体用DEPC水冲洗后提取RNA并反转录成cDNA第一链，以该cDNA为模板，以AncDFl和AncDRl为引物进行PCR扩增。PCR扩增得到2073bp的片段，测序表明，该片段具有序列I的5’端的第I至2073位的核苷酸序列。
2、酵母中表达载体的构建将上述I得到的扩增得到2073bp的片段用BamHI和Sal I双酶切，将得到的片段与同样酶切得到的PGBKT7载体(购自Clontech公司，产品目录号为:630443)骨架载体连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I插入pGBKT7的BamH I和Sal I酶识别位点之间，得到重组载体，将该重组载体命名为pGBKT7_AnALSl。3、转 pGBKT7_AnALSl 酵母的获得用重组质粒pGBKT7-AnALSl导入酵母AH109R感受态细胞的方法获得转pGBKT7-AnALSl 酵母；具体方法为:制作酵母AH109R(购自Clontech公司，产品目录号为:630444)感受态细胞，将重组质粒pGBKT7-AnALSl转入酵母菌株AH109细胞中获得重组菌株。以重组菌株为模板，以AncDFl和AncDRl为引物进行PCR扩增，得到2073bp的片段的重组菌为阳性重组菌。提取阳性重组菌的质粒，送去测序，该质粒为pGBKT7_AnALSl，将含有该质粒的阳性重组菌命名为酵母pGB-ALS。采用相同的方法，将空载体pGBKT7转入酵母AH109R中，得到转空载体酵母AH109R,提取该酵母的质粒，以AncDFl和AncDRl为引物进行PCR扩增，没有目的片段，证明该酵母为转空载体酵母，命名为酵母PGB。4、转pGBKT7_AnALSl酵母的氯嘧磺隆抗性鉴定将酵母pGB-ALS，酵母pGB和酵母AH109R同时划线在含有氯嘧磺隆浓度Omg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L 的固体 YPD 培养基(购自 Clontech 公司，产品目录号为:630409)平板上；将酵母pGB-ALS，酵母pGB同时划线在含氯嘧磺隆浓度2000mg/L的SD/_Trp平板(购自Clontech公司，产品目录号:630309)上，72h后观察菌落生长情况。结果图2 所示，A =YPD 培养基；B:SD/-Trp+2000mg/L 氯嘧磺隆；C:YPD+2000mg/L氯嘧磺隆；D:YPD+3000mg/L氯嘧磺隆；E:YPD+4000mg/L氯嘧磺隆；F:YPD+5000mg/L氯嘧磺隆；结果表明，酵母pGB-ALS、酵母pGB和酵母AH109R在Omg/L的YPD平板上均能生长正常，证明三个菌种都具有较强的活力(图2-A);酵母pGB-ALS在含有氯嘧磺隆2000mg/L的YPD平板中均能正常生长，但是比在Omg/L的YPD平板中生长稍弱，可见随着氯嘧磺隆浓度的增加，氯嘧磺隆对酵母pGB-ALS的抑制作用增强，酵母pGB和酵母AH109R在含有氯嘧磺隆2000mg/L 的 YPD 平板上有微弱的生长(图 2-C);在 3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L 的 YPD平板中酵母PGB和酵母AH109R均不能正常生长，而pGB-ALS均正常生长(图2_D，E，F)。而菌种酵母AH109R本身就具有弱的抗氯嘧磺隆能力，但是在高氯嘧磺隆浓度下不能生长。
酵母pGB-ALS在含有氯嘧磺隆浓度2000mg/L的SD/_Trp平板上可以正常生长，而酵母PGB不能生长(图2-B)，证明转化质粒在酵母AH109R中成功复制表达，其功能得到了发挥。表明AnALSl基因在酵母中表达可以提高转基因酵母的抗氯嘧磺隆能力。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐氯嘧磺隆相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与耐氯嘧磺隆相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入PGBKT7载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌为将权利要求4所述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，所述宿主菌具体为酵母AH109R。
7.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对； 所述引物对具体为如下I)或2): 1)所示的引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，另一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4 ； 2)所示的引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，另一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列6。
8.一种耐氯嘧磺隆产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的重组载体、权利要求4所述的表达盒、权利要求4所述的转基因细胞系或权利要求4或6所述的重组菌。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的重组载体、权利要求4所述的表达盒、权利要求4或6所述的转基因细胞系或权利要求4所述的重组囷在制备耐氣卩密横隆广品中的应用； 或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的重组载体、权利要求4所述的表达盒、权利要求4或6所述的转基因细胞系或权利要求4所述的重组菌在耐氯嘧磺隆中的应用； 或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的重组载体、权利要求4所述的表达盒、权利要求4或6所述的转基因细胞系或权利要求4所述的重组菌在培育耐氯嘧磺隆植物中的应用。
10.一种培育耐氯嘧磺隆重组菌的方法，包括如下步骤:将权利要求4所述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，所述重组菌的耐氯嘧磺隆性高于所述宿主菌，所述宿主菌具体为酵母AH109R。
全文摘要
本发明公开了一种与耐氯嘧磺隆相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐氯嘧磺隆相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一个新的蛋白，将其编码基因转入大肠杆菌中表达，可提高转基因菌株的耐氯嘧磺隆能力，得到耐氯嘧磺隆产品。因此，本发明的基因可用于培育高耐氯嘧磺隆转基因作物品种，具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/60GK103184211SQ20111044465
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者陶波, 任洪雷, 张洪岩, 金龙国, 邱丽娟 申请人:东北农业大学, 中国农业科学院作物科学研究所