一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：（1）插田泡茎段的消毒和接种：取当年抽出的插田泡新茎，剪成带腋芽的中度木质化茎段进行接种；（2）丛生芽的诱导；（3）不定芽的增殖；（4）再生植株的生根培养；（5）炼苗移栽。在上述步骤中采用了不同成分及配比的培养基。采用本发明的方法，能够快速地获得插田泡植株，利于产业化生产。采用本发明方法，插田泡丛生芽的不定芽诱导率高达92.5%，不定芽增殖倍数可达7.2，植株移栽成活率可达95%以上。
【专利说明】一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物培养【技术领域】，具体涉及插田泡组织培养与快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002] 插田泡OftzZw1S corea/ws Miq.)，又名大乌泡、乌沙莓、菜子泡、回头龙、两头草、两 头忙等，为蔷薇科悬钩子属落叶小乔木，分布于陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、河南、湖 北、四川及贵州等省。以果实、叶、根及茎、藤着地所生的不定根入药。果性温，味甘、酸，具补 肾固精功效，主治阳萎、遗精、遗尿，也作覆盆子入药；根、不定根性凉，味苦，具调经活血、止 血止痛功效，主治跌打损伤、骨折、月经不调及外伤出血。叶性凉，味苦、涩，具祛风明目，除 湿解毒之功效，主治风眼流泪、风湿痹痛和狗咬伤。除药用外，果实可直接食用或酿酒。目 前同属的一些种已有报道，但插田泡的组织培养和快速繁殖尚未见报道。
[0003] 同属多种植物的组培快繁已有报道，但红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的报道尚 未见。悬钩子属植物采用的基本培养基绝大部分为MS培养基或改良MS培养基，极少为其它 培养基，如裂叶悬钩子采用的是改良NN69培养基。采的外植体主要为茎段，通过直接诱导 丛生芽或先诱导愈伤组织再分化的方式，而叶片、叶柄等主要采用的是直接诱导不定芽。茎 段直接诱导丛生芽的激素组合一般是6-BA和NAA的组合或6-BA和IBA的组合，也有6-BA 和NAA的组合诱导茎段产生愈伤组织并分化的报道(地被悬钩子）；叶片直接产生不定芽主 要采用的是BA和IAA的组合、BA和NAA的组合、TDZ和NAA的组合及ZT和NAA的组合。生 根主要用的基本培养基是1/2浓度，主要采用的是NAA，还有采用IBA，也有采用NAA与IAA 混合使用，也有体外使用0.5 g/L IBA浸下再生根的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利 于实现产业化生产的插田泡组织培养与快速繁殖的方法。
[0005] 为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种插田泡组织培养与快速 繁殖的方法，依次包括以下步骤： (1)插田泡茎段的消毒和接种 取当年抽出的插田泡新茎，剪成带腋芽的茎段，根据木质化程度分成轻度、中度和高 度，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h 后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有 5滴吐温-80,质量分数为0. 1%的HgCl2溶液内浸泡消毒11-17 min，然后用无菌水充分浸 洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基 中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L，pH为5. 8-6.0,培养基事 先于121°C下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培 养；培养条件为：培养温度为25±1°C，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h ;光照强度 30-40 μ mol/ (m2 · s); (2) 丛生芽的诱导 选取新茎中的中度木质化茎段，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶 液浸泡2-4 min，用流水冲洗0. 5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0. 1% HgCl2溶液内浸泡消毒13-14 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. 0 mg/L，IAA 0-5. 0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖 添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌 20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 yrnoVOn2 · s); (3) 不定芽的增殖 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5.0mg/L，IAA 0-5.0 mg/L，CH O-LO mg/L 的 WPM 基本培养基中进行培养， 培养条件为：培养温度为（25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 ymol/ (m2 · s); (4) 再生植株的生根培养 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12. 5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培养基中，培养基中添加的蔗糖为10-50 g/L， 琼脂添加量为7. 0 g/L，pH 5. 8-6. 0 ; (5) 炼苗移栽 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中 注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶 盖，让灯光直照再生植株培养2 d。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残 留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩，泥炭重量比为I :(1-5)的混合基质中，浇透水并用 透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28°C之间。
[0006] 作为优选方案：所述步骤（1)中接种的茎段为木质化中度茎段，消毒时间为13-14 min〇
[0007] 作为优选方案：所述步骤（2)中的WPM培养基添加有TDZ 0· 5 mg/L，6-BA 2. Omg/ L，IAA 0· 5 mg/L，CH 0·1-0. 2 mg/L。
[0008] 作为优选方案：所述步骤（3)中WPM培养基添加有TDZ 0· 3 mg/L，6-BA I. 0 mg/ L，IAA I. 0 mg/L，CH 0·1-0. 2 mg/L。
[0009] 作为优选方案：所述步骤（4)中的生根培养基为50-100%WPM，NAA 0. I mg/L，IAA 0. 2 mg/L，AC 0. I -Ο. 2 mg/L。
[0010] 作为优选方案：所述步骤（5)中混合基质的珍珠岩，泥炭重量比为I: 5。
[0011] 与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，能够快速地获得插 田泡植株，利于产业化生产。采用本发明方法，插田泡丛生芽的不定芽诱导率高达92. 5%，不 定芽增殖倍数可达7. 2,植株移栽成活率可达95%以上。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤： (1)插田泡茎段的消毒和接种 取当年抽出的插田泡新茎，剪成带腋芽的茎段，选取木质化程度为中度的茎段，先用牙 刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净 台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80 的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒13-14 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方 向接种到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添 加量为30 g/L，琼脂添加量为7. 0 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌 20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后统计发 现，污染率低于10%，外植体成活率在80%以上。
[0013] 步骤（1)为预实验，用以选取最佳的丛生芽进行诱导。
[0014] (2)丛生芽的诱导 选取当年抽出的新茎中的中度木质化茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量 的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液 中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0. 1% HgCl2溶液内浸泡消毒 13-14 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L， 6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖 添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌 20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后统计发 现，不定芽诱导率在92. 5%，不定芽数在5. 4,而且不定芽叶色浓绿，生长良好，株高和茎粗 适中。
[0015] (3)不定芽的增殖 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0.3 mg/ L，6-BA 1.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0. 2 mg/L 的 WPM 基本培养基中进行培养，培 养条件为：培养温度为（25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 ymol/ (m2 · s)。30 d后统计发现，增殖倍数在7. 2,且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。
[0016] (4)再生植株的生根培养 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到50-100%WPM，NAA 0. I mg/L， IAA 0. 2 mg/L，AC 0. I -0. 2 mg/L的生根培养基中，培养基中添加的蔗糖为10-50 g/L，琼 脂添加量为7.0 g/L，pH 5. 8-6.0。30 d时统计发现，生根率在95%以上，根数4. 6根，根粗 适中，适于炼苗移栽。
[0017] 其中50-100%WPM指的是培养基中WPM基本培养基的浓度，其它物质的浓度不受影 响。50% WPM就是指WPM基本培养基配方里的所有物质用量为原来的1/2。
[0018] (5)炼苗移栽 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中 注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶 盖，让灯光直照再生植株培养2 d。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残 留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩，泥炭重量比为I: 5的混合基质中，浇透水并用透明 的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28°C之间。待新叶长出，即可揭开 薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽大田中，移栽成活率可达95%以上。
[0019] 文中所涉及的缩略词含义： AC活性炭 6-BA 6-苄氨基腺嘌呤 CH水解酪蛋白 IAA吲哚乙酸 NAA萘乙酸 TDZ噻苯隆（脱叶脲） 实施例2 本实施例与实施例1的区别在于步骤（1):插田泡茎段的消毒和接种：取当年抽出的 插田泡新茎，剪成带腋芽的茎段，根据木质化程度分成轻度、中度和高度，先用牙刷于自来 水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将 茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的 0. 1% HgCl2溶液内浸泡消毒11-17 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向 接种到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2. 0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添 加量为30 g/L，琼脂添加量为7. 0 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌 20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μπι〇ν(πι2·8)。30 d后统计发 现，污染率低于10%，外植体成活率在80%以上，其中木质化中度茎段〉木质化轻度茎段〉木 质化重度茎段，滴加有5滴吐温-80的0. 1% HgCl2溶液内浸泡消毒13-14 min为最佳消毒 时间，既消毒完全又不损伤外植体，无污染，外植体成活率达95%。
[0020] 表1不同部位取材的外植体和消毒时间对污染率和成9活率的影响
【权利要求】
1. 一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤： (1) 插田泡茎段的消毒和接种 取当年抽出的插田泡新茎，剪成带腋芽的茎段，根据木质化程度分成轻度、中度和高 度，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h 后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5 滴吐温-80,质量分数为0.1%的取(：12溶液内浸泡消毒11-17 min，然后用无菌水充分浸洗 3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中， 该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L，pH为5. 8-6.0,培养基事先于 121°C下高温高压灭菌20 min ;接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养；培 养条件为：培养温度为25±1°C，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h;光照强度30-40 μ mol/ (m2 · s)； (2) 丛生芽的诱导 选取新茎中的中度木质化茎段，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶 液浸泡2-4 min，用流水冲洗0. 5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0. 1% HgCl2溶液内浸泡消毒13-14 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. 0 mg/L，IAA 0-5. 0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖 添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌 20 min;接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 ymoVOn2 · s); (3) 不定芽的增殖 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0-2. 0 mg/L，6-BA 0-5. Omg/L，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L 的 WPM 基本培养基中进行培养， 培养条件为：培养温度为（25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μ mol/ (m2 · s); (4) 再生植株的生根培养 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12. 5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培养基中，培养基中添加的蔗糖为10-50 g/L， 琼脂添加量为7. 0 g/L，pH 5. 8-6. 0 ; (5) 炼苗移栽 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中 注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶 盖，让灯光直照再生植株培养2 d ;然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残 留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩，泥炭重量比为1 :(1-5)的混合基质中，浇透水并用 透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28°C之间。
2. 根据权利要求1所述的一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步骤（1)中接种的茎段为木质化中度茎段，消毒时间为13-14 min。
3. 根据权利要求1所述的一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步骤（2)中的 WPM 培养基添加有 TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/Lo
4. 根据权利要求1所述的一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步骤（3)中WPM培养基添加有TDZ 0.3 mg/L，6-BA 1.0 mg/L，IM 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L〇
5. 根据权利要求1所述的一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步骤（4)中的生根培养基为 50-100%WPM，NAA 0· 1 mg/L，IAA 0· 2 mg/L，AC 0· 1 -0· 2 mg/ L〇
6. 根据权利要求1所述的一种插田泡组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述 步骤（5)中混合基质的珍珠岩，泥炭重量比为1: 5。
【文档编号】A01H4/00GK104221865SQ201410510772
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】孙骏威, 朱诚, 王飞娟, 江琼, 丁艳菲, 蔡冲 申请人:中国计量学院