一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法与流程

本发明属于树木育种技术领域，具体涉及一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法。

背景技术：

赤松(Pinus densiflora)，主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯东南部及我国东部，可作庭院、荒山造林的树种，但易感染松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)而大量死亡，对林业生产和生态环境造成了严重破坏。由于常规种苗繁殖系数低，选育出的抗病材料难以满足大规模林业生产的需求。为了大量快速繁殖已选优良抗病基因型，在短时间内实现规模化生产，对赤松离体组织培养技术的研究显得尤为重要。

体细胞胚胎发生具有繁殖系数大、周期短、结构完整、再生率高、不受季节影响等特点(Gupta et al,1993)，是植物大规模无性繁殖的一种主要手段(汪小雄等，2006；Stasolla and Yeung,2003)。国内外学者已通过体细胞胚胎发生成功获得50多种针叶树体细胞胚或体细胞胚再生植株(孙志强等，2010)，其中火炬松(Pinus taeda)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)和辐射松(Pinus radiata)等树种体细胞胚发生已经应用于规模化生产(张守攻，2004)。Taniguchi(2001)首次对日本赤松体细胞胚胎发生进行研究，建立了胚性细胞系和进行体细胞胚胎成熟试验，但转化率非常低；随后，Maruyama等(2005)、Maruyama和Hosoi(2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈伤组织增殖、体细胞胚胎成熟、萌发及转化的影响因子，但存在胚性愈伤组织诱导率低、胚性愈伤组织能力的丧失，体胚成熟与转化率低等问题。而国内外目前对赤松组织培养器官发生植株再生有所研究(朱丽华等，2010；李清清，2012)。目前国内关于赤松体细胞胚胎发生的研究报道很少(吴静等，2015)。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，为抗病赤松体细胞胚胎发生条件进行优化以提高其体细胞胚胎的质量和数量，从而来提高萌发率和植株转化率，为抗性赤松的种质资源保存、基因转化、体胚苗的工厂化生产提供可行的技术支撑。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖-固成熟方式进行。

所述的液—固增殖-固成熟为：取生长良好的胚性愈伤组织，转入不含激素的DCR液体培养基中，剧烈震荡形成良好的悬浮体系，取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体增殖培养基中，15天之后转入固体成熟培养基中。

所述的体细胞胚的萌发为：将诱导的成熟体细胞胚22#-1水平置于萌发培养基上进行萌发，萌发培养基为LP，添加20g/L麦芽糖，2g/L AC，3g/L植物凝胶，pH5.8；非直射光培养4-7天，再放入直射光下培养14-17天；然后将萌发的体细胞胚转入WPM基本培养基，附加1.5mg/L IBA，0.2mg/L NAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉胶，光照培养1个月。

所述的体细胞胚的转化为：待再生植株根伸长2cm后进行移栽，移栽前7d逐渐将封口膜揭开，使幼苗适应外界的环境，移栽时将幼苗根部的卡拉胶小心洗掉，移栽在珍珠岩、苗圃土和河沙构成1：1：2的基质中，移苗一个月内注意保持空气湿度、温度和基质湿度的稳定，3个月后移栽成活。

在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加15mg/L ABA和140g/L PEG8000。

在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加8g/L肌醇。

在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加60g/L麦芽糖。

在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加3g/L植物凝胶。

有益效果：与现有技术相比，本发明的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，以抗松材线虫病赤松的未成熟合子胚为外植体，通过对抗病赤松未成熟合子胚已成功诱导获得的胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟、萌发与植株再生等试验，成功获得了成熟的体细胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培养基上产生体细胞胚的萌发率和植株转化率高，分别为67.2％和46.5％，再生植株3个月移栽成活率为32.7％。为抗病赤松的大规模繁殖和工厂化生产提供了重要的科学依据，为抗性赤松的种质资源保存、基因转化、体胚苗的工厂化生产提供可行的技术支撑。

附图说明

图1是不同糖类对抗病赤松体细胞胚成熟的影响结果图；

图2是肌醇浓度对抗病赤松体细胞胚成熟的影响结果图；图中：J1为肌醇0g/L，J2为肌醇2g/L，J3为肌醇4g/L，J4为肌醇6g/L，J5为肌醇8g/L，J6为10g/L，J7为肌醇16g/L；

图3是抗病赤松体细胞胚胎成熟、萌发及植株再生结果图；图中，A1，A2：正常子叶胚；B1，B2：畸形子叶胚；C1；C2：萌发培养基中5d后的体细胞胚；C3：萌发培养基中20d后体细胞胚形成的再生植株；D1，D2：WPM培养基中壮苗的再生植株；E1，E2：WPM培养基中壮苗1个月的再生植株；F1，F2：WPM培养基中壮苗3个月的再生植株；G1：移栽后体细胞胚苗；G2：移栽后3个月体细胞胚苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料为：抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江苏句容林场抗松材线虫病赤松种质资源库(2004年2月从日本林木良种繁育中心引种建立)，从球果中剥离出未成熟合子胚，诱导出具有胚性的愈伤组织(22#-1和13#-1)，并已继代培养7次，再经过3次继代培养，将胚性愈伤组织生长状况良好的两个无性系22^#-1和13^#-1作为体细胞胚胎发生的材料(吴静，朱丽华，许建秀，吴小芹，叶建仁.抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖.南京林业大学学报，2015，39(1)：17-21)。

以下实施例的结果数据采用Excel 2007处理，用SPSS17.0软件进行方差分析和差异显著性检验。

实施例1

ABA浓度(10、15、20mg/L)、PEG(聚乙二醇)8000浓度(100、140、180g/L)进行两因素随机区组试验。将22^#-1的胚性胚柄团(embryonic suspensor mass，ESM)转接至设计的培养基(基本培养基LP，另附加肌醇8g/L，麦芽糖60g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)中，每处理30块ESM，重复3次，实时观察体胚的成熟情况。培养基。培养基用高压灭菌121℃20min。

抗病赤松体细胞胚胎诱导、增殖和成熟试验在培养温度设定为23±2℃的组培室中，暗培养，每两个星期观察一次。正常体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝正常体细胞胚个数/愈伤组织鲜质量，畸形体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝畸形体细胞胚个数/愈伤组织鲜质量，体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝体细胞胚个数(包括正常和畸形)/愈伤组织鲜质量。

不同ABA和PEG8000浓度对抗病赤松体细胞胚成熟有显著影响(表1)。当ABA的浓度为15mg/L时，PEG在140g/L浓度组合下，正常体细胞胚数达到171个/g，均高于其他处理；当ABA浓度为20mg/L时，正常体细胞胚数都偏低(79个/g)。添加适当浓度的ABA可促进体细胞胚胎单个化并进一步发育成熟。PEG(聚乙二醇)在合适的浓度下，促进体细胞胚的成熟。本实施例结果表明PEG对抗病赤松体细胞胚成熟诱导有显著影响。当PEG浓度达到180g/L时，正常体细胞数反而有所下降，可见PEG的使用并不是浓度越高，正常体细胞胚数就越多，它们之间并不存在正相关。结果表明，ABA浓度为15mg/L和PEG8000 140g/L的组合最适合抗病赤松的体细胞胚成熟诱导。

表1不同ABA和PEG8000浓度对抗病赤松体细胞胚成熟的影响

实施例2

将22^#-1的ESM转接在以LP为基本培养基，添加不同种类的糖(麦芽糖、蔗糖)及不同浓度(20、30、45、60、70g/L)，每处理30块ESM，重复3次，实时观察体胚的成熟情况。培养基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。培养基用高压灭菌121℃20min。体细胞胚培养及测定同实施例1。

结果表明，糖类型及浓度对抗病赤松体细胞胚成熟的影响呈显著差异，麦芽糖比蔗糖更能增加抗病赤松体细胞胚胎数量(图1)。其中麦芽糖浓度为60g/L时，抗病赤松体细胞胚数达到235个/g，而且畸形胚也降到最低。当糖浓度升高时，体细胞胚数降低并且畸形胚也多。当糖浓度低于60g/L时，体细胞胚数低。因此，抗病赤松体细胞胚成熟培养基中，麦芽糖比蔗糖更适合进行抗病赤松的体细胞胚胎发生，最适浓度为60g/L。

实施例3

将22^#-1的ESM转接在LP基本培养基中，添加肌醇0、2、4、6、8、10、16g/L，每处理30块ESM，重复3次，实时观察体胚的成熟情况。培养基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，MES 250mg/L、CH 500mg/L、VC 10mg/L、谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8。培养基用高压灭菌121℃20min。体细胞胚培养及测定同实施例1。

结果表明(图2)，在缺乏肌醇的情况下，抗性赤松虽能产生子叶胚，但是子叶胚胚头膨大，胚柄短小甚至不能正常发育，胚体短而粗颜色偏黄，生长状态不良，都为畸形胚；而且愈伤组织颜色偏褐，结构逐渐紧密，生长状况明显衰退(图2-J1)。当加入肌醇时(2-8g/L)，抗病赤松体细胞胚数明显提高(图2-J2、J3、J4、J5)。而肌醇浓度大于8g/L时，体细胞胚数剧增，但出现的都是畸形胚，胚头膨大，胚柄短小，生长状态不佳(图2-J6、J7)。由此表明肌醇的最适浓度为8g/L(图2-J5)。

实施例4

本实施例采用两种凝固剂分别为植物凝胶(Phytagel)和琼脂(Agar powder)。将22^#-1的ESM转接在以LP为基本培养基，添加不同植物凝胶和琼脂(2.5、3、3.5、4g/L)，每处理30块ESM，重复3次，实时观察体胚的成熟情况。培养基附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L，pH5.8。培养基用高压灭菌121℃20min。体细胞胚培养及测定同实施例1。

结果表明(表2)，在培养基质中琼脂从6g/L添加至12g/L时，培养基都不能凝固，愈伤组织无法生长，也无子叶胚形成。当加入植物凝胶且浓度为3g/L，培养基凝固，软硬适中，产生的子叶胚，子叶胚细长，发育正常，生长良好。当植物凝胶浓度为2g/L，子叶胚生长良好，但是培养基较软，不易固定。当植物凝胶浓度增为3.5g/L时，培养基开始偏硬，只出现少量非正常的子叶胚。当植物凝胶浓度增为4g/L时，培养基很硬，愈伤组织干燥颜色发白，没有出现子叶胚。因此，在抗病赤松发育成熟阶段宜选用植物凝胶浓度为3g/L，对体细胞胚数和子叶胚的质量有较好的影响。

表2不同凝固剂对抗病赤松体细胞胚成熟的影响

实施例5

I.液—固增殖-固成熟：取胚性细胞系22^#-1和13^#-1生长良好的胚性愈伤组织，转入20mL不含激素DCR液体培养基中，用手剧烈震荡形成良好的悬浮体系，用1mL的移液枪吸取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体增殖培养基中，15天之后转入固体成熟培养基中。

II.固增殖—固成熟：直接用镊子夹取生长良好的胚性细胞系22^#-1和13^#-1的胚性愈伤组织于固体增殖培养基上，15天之后转入固体成熟培养基中。

Ⅲ.液-固成熟：取胚性细胞系22^#-1和13^#-1生长良好的胚性愈伤组织，转入20mL不含激素DCR液体培养基中，用手剧烈震荡形成良好的悬浮体系，用1mL的移液枪吸取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体成熟培养基中。

培养基均附加ABA 15mg/L，PEG8000 140g/L，肌醇8g/L，麦芽糖60g/L，MES 250mg/L，CH 500mg/L，VC 10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。培养基用高压灭菌121℃20min。体细胞胚培养及测定同实施例1。

结果表明(表3)，采用三种不同培养方式，抗病赤松体细胞胚成熟的时间明显不同，但发育程度基本相同。当采用方式Ⅰ(液-固增殖-固成熟)进行培养时，胚性愈伤组织经11-12周能发育成完整结构的成熟体细胞胚，其中22#-1的正常体细胞胚数达到239个/g，畸形体细胞胚数降到25个/g，且同步化程度最高。当采用方式Ⅱ(固增殖-固成熟)进行培养时，胚性愈伤组织经8-9周能发育成完整结构的成熟体细胞胚，较方式Ⅰ和Ⅲ有优势，但正常体细胞胚数较方式Ⅰ有所下降，只有200个/g左右，畸形体细胞胚数提高，且同步化程度最低。当采用方式Ⅲ进行培养时，胚性愈伤组织经12-14周才能发育成完整结构的成熟体细胞胚，非常缓慢，且表面水渍化严重，正常体细胞胚数下降到最低，畸形体细胞胚数增至最高。结果表明，方式Ⅰ的正常体细胞胚数最高和畸形体细胞胚数最低，虽成熟时间较方式Ⅱ多了3周左右，但同步化程度高，所需材料少，因此，该方式适合进行抗病赤松体细胞胚成熟培养。

表3不同培养方式对抗病赤松体细胞胚成熟的影响

实施例6

将诱导的成熟体细胞胚22#-1水平置于萌发培养基上进行萌发，萌发培养基为LP，添加20g/L麦芽糖，2g/L AC，3g/L植物凝胶，pH5.8。非直射光培养5天左右，再放入直射光下培养15天左右，观察体胚的萌发状况，统计萌发率。然后将萌发的体细胞胚转入WPM基本培养基，附加1.5mg/L IBA，0.2mg/L NAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉胶，光照培养1个月，统计植株转化率。萌发率(％)＝萌发正常体胚的个数/接种体细胞胚个数*100％，植株转化率(％)＝生根的植株数/萌发正常体胚的个数*100％。

抗病赤松体胚成熟时，正常子叶胚是呈现乳白色或者乳黄色，子叶完全张开，可以清楚的看到有几个子叶，并出现明显的黄色细长胚轴和红色胚根(图3A1、A2)；畸形子叶胚是呈现乳白色或者乳黄色，子叶未张开或胚头膨大，胚轴短小甚至不能正常发育，胚根未形成或有点红色根点(图3B1、B2)。

将不同发育阶段产生的成熟体细胞胚轻轻挑出，转至无激素的萌发培养基，非直射光培养5d后，体细胞胚子叶由黄白色逐渐变为黄绿色(图3C1，C2)，后将子叶胚在光照下培养。光照后正常萌发的子叶逐渐张开，颜色变为深绿色；胚轴伸长，基部有微小红色根尖(图3C3)，后根尖逐渐变为深褐色，根部生长。正常萌发的子叶胚子叶张开，胚轴伸长，基部有微小红色根点(图3C3)，而畸形的子叶胚子叶很小未张开，胚轴很短或者几乎没有，基部有一点红色小根点或者没有，基部愈伤化严重(图3C3)。然后将萌发的体细胞胚转入WPM培养基中，1个月后长出初生针叶，形成再生植株：正常的子叶胚胚轴较长，胚根伸长，1个月后长出初生针叶，嫩白色根长1cm左右(图3D1、E1)；畸形胚胚轴很短，根部的愈伤组织严重(图3D2、E2)。在WPM壮苗培养基中的生长3个月后，正常子叶胚初生针叶继续生长，有的还长出了次生针叶，根部嫩白色，并只有一条主根，主根周围长出许多须根(图3F1)，这时可以直接移栽；而畸形子叶胚胚在WPM壮苗培养基中的生长3个月后，初生针叶虽继续生长，但未见有次生针叶，根部棕褐色，愈伤化严重，有的还长出若干侧根(图3F2)，移栽后可能会出现死亡。成熟培养基上产生体细胞胚的萌发率和植株转化率分别为67.2％和46.5％。

实施例7

待再生植株根伸长2cm左右后进行移栽，移栽前7d逐渐将封口膜揭开，使幼苗适应外界的环境，移栽时将幼苗根部的卡拉胶小心洗掉，移栽在珍珠岩、苗圃土和河沙构成1：1：2的基质中。移苗一个月内注意保持空气湿度、温度和基质湿度的稳定。3个月后统计移栽成活率。移栽成活率(％)＝植株成活的株数/移栽的株数×100％。

由抗病赤松正常子叶胚生长的移栽后体细胞胚苗(图3G1)较幼嫩，移栽3个月后抗病赤松体细胞胚苗(图3G2)都长出次生针叶，根系深入土壤，移栽体细胞胚再生植株为202棵，成活株数为66棵，移栽成活率为32.7％。