本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法。
背景技术：
胡椒(Piper nigrum L.)为胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)多年生木质藤本植物，其果实具有辛辣香气，素有“香料之王”的美誉，是世界重要的香辛料作物，也是人们喜爱的调味品。在医学领域，胡椒可被用作健胃剂、解热剂和支气管粘膜刺激剂等。在食品工业上，可被用作抗氧化剂、防腐剂和保鲜剂等。作为一种深受人们喜爱的调味品和具有众多用途的热带农产品，胡椒已遍及亚州、非州、拉丁美洲三大洲近20个国家和地区。其中我国主要分布在海南、云南、广东、福建等地，种植面积近3×104hm2、年产量超过3.6×105t，居世界第五位。我国胡椒市场长期存在供不应求的局面，每年需进口约1.0×104t满足内需。随着我国人民生活水平的不断提高和饮食结构的变化，胡椒消费量还将大幅增加。市场需求的不断扩大给胡椒产业提供了广阔的发展前景。
胡椒为多年生藤本植物，生产上胡椒种苗繁育以插条苗为主，该方法具有种苗与母本性状一致、后代发病率低等优点，但它对苗圃规划、母株选择、苗期培育等环节有着严格的要求，成本较高，且无法满足产业快速推进高通量种苗培育的要求，高通量种苗培育技术的缺乏限制了产业的进一步发展。体细胞再生是基于细胞全能型理论、以母本组织为外植体，在体外环境下通过愈伤诱导、分化等一系列过程获得组培苗的技术体系。胡椒体细胞再生体系的建立可以为种苗的高通量、规模化、商业化生产以及种植业的快速推广提供技术支撑。
尽管体细胞再生技术已广泛应用于种苗培育、转基因育种等领域，但不同作物的再生体系与外植体选择、培养基类型、培养环境等因素密切相关。现有研究《胡椒组织培养研究》以胡椒实生苗芽尖、胚轴、叶片为外植体开展了胡椒体细胞再生研究，并提供了种子灭菌、体细胞再生培养方法，但其文献公布的方法种子萌发污染率高达30％-60％，而体细胞分化率不到1％(刘进平等，热带农业科学,2002,22(3):18-22.)。目前胡椒生产上还未有一种适合于胡椒体细胞胚胎发生的培育方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，使得所述方法能够显著提高胡椒体细胞胚胎的分化率。
本发明的另外一个目的在于提供一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，使得所述方法能够显著降低种子萌发污染率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，包括：
步骤1、将成熟胡椒种子灭菌，然后培养成胡椒幼苗，从幼苗子叶处分离出外种皮；
步骤2、将外种皮进行愈伤诱导培养获得愈伤组织，愈伤诱导培养基以MS为基础培养基，包含活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2,4-D；
步骤3、将愈伤组织进行体细胞胚胎分化培养，获得胡椒体细胞胚胎，分化培养基以MS为基础培养基，包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。
针对现有胡椒组织培养方法中种子萌发污染率较高以及分化率较低的问题，本发明从外植体的选择和培养基配方调整两个方面入手，实现了较高体细胞分化率的目的，在此基础上进行适宜的消毒措施，降低了种子萌发的污染率。
作为优选，步骤1为：
将成熟胡椒种子灭菌，然后置于无菌培养基中，28±2℃、避光培养至胡椒幼苗长出，子叶完全展开后，将外种皮从子叶顶端剥离，无菌培养基配方为1/2MS+2g/L活性炭。
其中，所述灭菌具体为：
将完整的成熟胡椒种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在超净台无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，接着将去除果肉的种子置于0.1％的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次。
作为优选，所述愈伤诱导培养基中活性炭浓度为2g/L、聚乙烯吡咯烷酮浓度为1g/L，2,4-D浓度为0.5mg/L；所述分化培养基中活性炭浓度为2g/L、聚乙烯吡咯烷酮浓度为1g/L。在本发明具体实施中，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮40(PVP-40)。
作为优选，所述愈伤诱导培养和分化培养均在28±2℃下避光培养90天，每隔30天更换新培养基进行继代培养。
在本发明具体实施方式中，本发明方法中的成熟胡椒种子以成熟的热引1号(Piper nigrumc.v.Reyin-1)种子为材料，选择的种子完全成熟且无病虫害和机械损伤。
本发明以不同外植体和培养基作为对照方法，与本发明方法在相同环境条件下进行培养，结果显示，本发明方法的种子萌发污染率仅为5％左右，而文献《胡椒组织培养研究》中的方法的污染率高达50％以上；在愈伤组织诱导率和体细胞分化率方面，本发明的效果也是显著高于各对照方法。
由以上技术方案可知，本发明所述方法选择外种皮作为外植体，调整愈伤诱导培养基和分化培养基的配方，以MS为基础培养基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D等成分，实现了高达20％的胡椒体细胞胚胎分化率，对高通量胡椒种苗繁育研究及转基因育种体系建立具有重要意义。
具体实施方式
本发明公开了一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述方法
取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将种子从果穗剥离，无菌环境下75％(V/V)酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，再将种子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后将种子转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次，获得无菌种子。
无菌环境下，将无菌种子置于无菌培养基中萌发，(28±2)℃、避光培养60天。培养基配方为1/2MS+2g/LAC(活性炭)。待胡椒幼苗完全长出后，将外种皮从子叶顶端剥离。
将外种皮置于愈伤诱导培养基中，(28±2)℃、避光培养90天。培养基配方为MS+2g/L AC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，90天后可诱导出愈伤组织。
将愈伤组织转移至分化培养基中，(28±2)℃、避光培养。培养基配方为MS+2g/LAC+1g/L PVP-40，每隔30天将材料转移至新的培养基中继带培养，连续培养90天后可得到胡椒体细胞胚胎。
实施例2：对照方法1(以叶片、胚轴为外植体采用实施例1中培养方法)
取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将果实从果穗剥离，无菌环境下75％(V/V)酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，再将种子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后将胡椒种子转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次，获得无菌种子。
无菌环境下，将无菌种子置于无菌培养基中萌发，(28±2)℃、避光培养60天。培养基配方为1/2MS+2g/L AC。待胡椒幼苗完全长出后，切取无菌实生苗的胚轴(1.5厘米长)、叶片为外植体。
将胚轴、叶片置于愈伤诱导培养基中，(28±2)℃、避光培养90天。培养基配方为MS+2g/LAC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，90天后统计愈伤诱导率。
将愈伤组织转移至分化培养基中，(28±2)℃、避光培养。培养基配方为MS+2g/LAC+1g/L PVP-40，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，连续培养90天后可得到胡椒体细胞胚胎。
实施例3：对照方法2(将实施例1中MS培养基更换为无激素SH培养基)
取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将种子从果穗剥离，无菌环境下75％(V/V)酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次；在无菌环境下去除果肉，将去除果肉的种子在75％酒精中浸泡2分钟，然后无菌水清洗5次，再将种子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分钟灭菌，最后将种子转移至新的无菌容器中，无菌水清洗5次，获得无菌种子。
无菌环境下，将无菌种子置于无菌培养基中萌发，(28±2)℃、避光培养60天。培养基配方为SH+2g/L AC。待胡椒幼苗完全长出后，将外种皮从子叶顶端剥离。
将外种皮置于愈伤诱导培养基中，(28±2)℃、避光培养90天。培养基配方为SH+2g/L AC。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，90天后可诱导出愈伤组织。
将愈伤组织转移至分化培养基中，(28±2)℃、避光培养。培养基配方为SH+2g/L AC+1g/L PVP-40，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，连续培养90天后可得到胡椒体细胞胚胎。
实施例4：对照方法3(文献《胡椒组织培养研究》中的方法)
取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将果实从果穗剥离置于饱和洗衣粉溶液中去皮，然后用流水冲洗干净，再依次用75％的酒精浸泡2分钟，0.1％的升汞消毒15分钟，2％的次氯酸钠消毒10分钟，无菌水清洗3-5次，然后接种到1/2MS培养基上萌发。种子在(28±2)℃、避光条件下萌发60天后，切取无菌实生苗的胚轴、叶片为外植体。
将胚轴、叶片置于诱导培养基中培养，培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，培养基配方为1/2MS+5mg/L萘乙酸(NAA)+2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)。培养条件为温度(28±2)℃，光照时间10小时/天，连续培养90天后可诱导出愈伤组织。
将愈伤组织转移至体细胞胚胎分化培养基，培养基配方为1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，培养条件为温度(28±2)℃，光照时间10小时/天，连续培养90天后统计胡椒体细胞胚胎。
实施例5：对照方法4(文献《胡椒组织培养研究》中的方法)
取5年生、生长正常且无病虫害影响的热引1号植株成熟果实；将果实从果穗剥离置于饱和洗衣粉溶液中去皮，然后用流水冲洗干净，再依次用75％的酒精浸泡2分钟，0.1％的升汞消毒15分钟，2％的次氯酸钠消毒10分钟，无菌水清洗3-5次，然后接种到1/2MS培养基上萌发。种子在(28±2)℃、避光条件下萌发60天后，切取无菌实生苗的胚轴、叶片为外植体。
将胚轴、叶片置于诱导培养基中培养，培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，培养基配方为1/2MS+3mg/L 2,4-D+100mg/L腺嘌呤。培养条件为温度(28±2)℃，光照时间10小时/天，连续培养90天后可诱导出愈伤组织。
将愈伤组织转移至体细胞胚胎分化培养基，培养基配方为1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培养期间，每隔30天将材料转移至新的培养基中继代培养，培养条件为温度(28±2)℃，光照时间10小时/天，连续培养90天后统计胡椒体细胞胚胎。
实施例6：对比试验
按照实施例1-实施例5的方法进行试验，统计种子萌发污染率、愈伤组织诱导率以及体细胞胚胎分化率，结果见表1。
表1不同培养方法污染率、体细胞胚胎分化率对比
由表1可以看出，采用本发明的以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法，污染率为5％，远远低于现有文献公布的培育方法。采用本发明所提供的愈伤诱导、分化培养基和培育方式，愈伤诱导率在95％以上、体细胞分化率高达20％左右，相比其他对照方法，为最优的培育方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。