cm的小 段。用75%乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗4次后置于超净台，将0.1%HgCl 2倒入装有外植体 的瓶中，以浸泡的方式静置6min，用无菌水冲洗4次;然后再倒入0.1 %HgCl2，以振荡的方式 进行灭菌处理4min，最后用无菌水冲洗4次。
[0045] 2.3、茎段的初始培养
[0046] 将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌 动，培养30d芽高3~5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成 一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
[0047]初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg · L-b蔗糖30000mg · L-b琼脂 3000mg · L-、
[0048] 〈3>芽器官的继代增殖培养
[0049] 待无菌初代芽长度2 1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度 <1.5cm，则待其继续生长，待长度2 1.5cm再转入继代增殖培养;初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度2 1.5cm;分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基 上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养;芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的 芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
[0050]继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.75mg · L-i+NAAO.Smg · L-b蔗糖30000mg · 1^+琼脂3500mg · L-1。
[00511经过30d培养，增殖系数达到6.6,有效芽6.0个(有效芽指高度2 1.0cm，生长健壮 的芽）。
[0052] 实施例3
[0053] 〈1>优良单株的选择
[0054]选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到"茶树 油"国际标准IS04730-2004,其4-松油醇含量>35%，1，8_桉叶素含量<5%。
[0055] 〈2>初始芽的获取
[0056] 2.1、外植体的采集
[0057]在优良单株选出的基础上，在前一年的11月~12月，对选择出的4-松油醇型互叶 白千层优良单株进行伐粧或者环割促萌(环割一整周），割伤至韧皮部。萌芽条生长至30~ 40cm时，于晴天午后采集接种。
[0058] 2.2、外植体消毒
[0059] 将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净， 再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗5次，剪切成3cm~6cm的小 段。用75%乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗5次后置于超净台，将0.1%HgCl 2倒入装有外植体 的瓶中，以浸泡的方式静置8min，用无菌水冲洗5次;然后再倒入0.1 %HgCl2，以振荡的方式 进行灭菌处理5min，最后用无菌水冲洗5次。
[0060] 2.3、茎段的初始培养
[0061] 将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌 动，培养30d芽高3~5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成 一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
[0062]初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg · L-b蔗糖30000mg · L-b琼脂 3000mg · L-、
[0063] 〈3>芽器官的继代增殖培养
[0064] 待无菌初代芽长度2 1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度 <1.5cm，则待其继续生长，待长度2 1.5cm再转入继代增殖培养;初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度2 1.5cm;分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基 上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养;芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的 芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
[0065] 继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA2.0mg · L-hNAAl .Omg · L-4蔗糖30000mg · L -工+琼脂3500mg · L-、
[0066] 经过30d培养，增殖系数达到7.4,有效芽6.8个(有效芽指高度2 1.0cm，生长健壮 的芽）。
[0067]应用本发明4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，经过一代及以上代数继代 增殖培养的芽器官的继代增殖剪切方式及继代增殖培养基、培养条件均与初代芽相同；其 中，继代增殖芽体采用横卧、平铺的方式，操作较单芽直立插入更简单。以增殖为目的的继 代增殖培养基可在一定范围内选择细胞分裂素较高，生长素较低的组合。而一边进行继代 增殖一边还需进行单芽生根，可在一定范围内选择细胞分裂素较低，生长素较高的组合。
【主权项】
1. 一种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为初代诱导培养基，该培养基 的配方为改良MS+6-BA 2.5mg · L-h蔗糖30000mg · L-4琼脂3000mg · L一、2. -种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为继代增殖培养基，该培养基 的配方为改良MS+6-BA 1.5~2.0mg · L-bNAA 0.6~l.Omg · L-4蔗糖30000mg · L-b琼脂 3500mg · L_1〇3. 权利要求1或2所述4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于所述改良MS培养 基的组成为： 跳 腳:mg-L-1 Nii4N0, 410 mrL1 CaCl2 ? 2H20 280 mg *1^ MgS〇4 * 7H；0 4ID： mgeL" Ca (NOj 2 · 4 ifcD 260： mg-I；1 K1 i；P〇i .3.10. mg*L 1 Mn$04 * 4 ；H20 22. 3 mg·^1 ZnS04 * 7 H2Q 8. 6 mg?L/1 CuS04 * 5 H20 0. 025 mg M:1 H,B0, 6. 2 mg?L；' Na2Mo(}4 * 2 H20 0. 25 mg*L ' KI 0. 83 rnp-L-1 CoClr * 6 H20 G. 025 mg?L 1 维生素 B1 0. 4 mg*L 1 维生素 B6 0, 5 mg ·L 1 烟酸 （X 5 mg?L -1 甘氣酸 2. 0 mg*L. 1 肌醇 150 mg-L-'l。4. 使用权利要求3所述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特 征在于选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐粧或者环割促萌，采集萌芽条，先后经 初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。5. 根据权利要求4所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于包括 以下步骤： 〈1>优良单株的选择； 〈2>初始芽的获取； 〈3>芽器官的继代增殖培养。6. 根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤〈 1>按以下操作进行:选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标 达到"茶树油"国际标准IS04730-2004。7. 根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤〈 2>按以下操作进行:在前一年的11月~12月，对选择出的优良单株进行伐粧或者环割促萌； 当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm~6cm的小段，酒精、升汞消毒处理，而后无菌水冲 洗，接种到初代诱导培养基上。8. 根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤〈 3>按以下操作进行:待初代芽长度2 1.5cm时，转入继代增殖培养;芽体转入继代增殖培养 基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。9.根据权利要求7或8所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于： 所述初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28~30°C，1500~2500LX，每天光照12~ 14h〇
【专利摘要】本发明公开了一种4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，该法选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数，缩短芽器官继代增殖周期，增加有效芽数，从而降低4-松油醇型互叶白千层组培产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增加单位面积的生物量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105613293
【申请号】CN201610026882
【发明人】刘海龙, 覃子海, 陈博雯, 肖玉菲, 张烨
【申请人】广西壮族自治区林业科学研究院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月15日