专利名称：桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程领域，更具体涉及一种桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法。
在Gene bank对比分析得到如下结果与拟南芥同源基因比较，相同核酸254个bp，期望值为3e-65，在进行蛋白质比较时发现，根据OEM1基因序列和拟南芥同源序列推导编码的氨基酸，其相同性为86％，相似性为91％，gaps为2％，与garden Pea的外膜蛋白比较，其相同性为47％，相似性为55％，gaps为5％，与拟南芥外膜蛋白的类似蛋白比较，相同性51％，相似性61％，gaps为12％，与Spinaciaoleraies的叶绿体外膜蛋白比较，相同性为43％，相似性为57％，与garden pea的叶绿体外膜蛋白比较，其相同性为53％，相似性为60％，这些事实证明，在本发明被公布之前，尚未有公开或报道过桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法。
本发明的目的是提供了一种桂竹香外膜蛋白基因全长cDNA的克隆的方法，在桂竹香幼叶中提取总RNA，方法易行，操作简便。克隆的桂竹香外膜蛋白cDNA序列包括一个开放阅读框(ORF)，全长537bp。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施桂竹香外膜蛋白cDNA文库的建立，利用同源探针，采用噬菌斑原位杂交的方法从桂竹香苗期cDNA文库中筛选阳性克隆，并转入E.coli BM25.8中，经限制酶切分析确证为重组子。将重组子送出测序并在数据库搜索获得结果.具体步骤如下1)一步法提取桂竹香幼叶总RNA2)利用RNA直接进行反转录，3)利用同源序列合成探针；4)用地高辛标记探针，噬菌斑原位杂交的方法筛选桂竹香苗期cDNA文库；5)利用PCR的方法快速确定阳性克隆是所筛选的重组子；6)限制酶切分析，Southern杂交分析确定为重组子；7)测序，并通过Bioinfo matics分析，确定该基因为新的未被克隆过的桂竹香外膜蛋白基因(cDNA)序列。桂竹香外膜蛋白基因序列是GGCCATTATGGCCGGGGGTTGAAGTGAAGAAGAAACTGCAGCAATGGAGAAATCAGGAGATGATGTCAAATTCCCAAAACTGGAGAAACCTACAGGAAAGAAACAGACAGCGACGGTTGTTGTGGGAGTGTTGGCCGTGGGATGGTTGGCGATAGAGCTCGTGTTTAAGCCATTGTTCAAGAAGCTGAGCTCCGCTAAGGACAAATCCGATTCGGACGATGCCAGTGCCACCGCTCCTCCTCCCGCGTCGGACGCCTGAATTGGTGAGAATTATAAAGTCGACACGTGGAGGTCTTAATTACTTTTTTCTTAATGAAGGCTCATATTAAAAGCAAAATGTTGTGTGTTCTTTCCTTGCTTCGTTTGTAATATCGTTCGGTTTTACTTCTTTTGACGATGTTTTTAATTAATCTCCCTTTCCCTTTTCAATAAAATCCCGAGAGAAGGATTAATAAATCAATGAGATACGATGTACTAATTGGGTTTCACAAAACACCCCCCCCNCCCACCAAAAACCATGTCGGCCGCCCTCGGCCCCA构建桂竹香苗期cDNA文库的基础材料是十字花科桂竹香(Cheiranthus cheiri L.)的幼嫩叶片，利用一步法提取叶片总RNA，LD-PCR的方法构建cDNA文库，并在噬菌斑原位杂交方法筛选cDNA文库的同时，利用PCR的方法快速筛选cDNA文库，使选择重组子的把握性更大。
本发明有如下优点和积极效果
真核生物基因组DNA十分庞大，且含有大量的重复序列，因此直接以染色体DNA为材料来克隆目的基因是很困难的，于是人们采用的由mRNA产生的cDNA进行克隆，即建立cDNA文库，目前发现的基因及用来进行研究的目的基因，绝大部分是通过cDNA文库筛选得到的。
传统合成的dscDNA的方法是自我引导法，由于S1核酸酶的使用，使得到的cDNA克隆丧失了mRNA5’端的许多信息，因此我们采用不使用S1核酸酶的全长cDNA的合成技术，直接以总RNA为原料来合成dscDNA，而省去了纯化mRNA的步骤，在第一条cDNA链的合成中，以一已修饰的oligodT为引物，SMARTIII oligo为mRNA5’端的延伸模板，而在第二条链的合成，是以它们的互补位点为PCR引物的结合位点通过PCR的方法完成。合成中不完整的sscDNA或由polyA-RNA逆转录而来的cDNA由于缺乏这两个位点，而不被扩增成dscDNA，这样基因组DNA和PolyA-RNA的污染即可消除，从而达到选择的目的。
在噬菌斑原位杂交筛库的过程中，我们采用了BoehringerMannheim公司生产的地高辛-11-dUTP标记探针，采用抗体复合物标记和颜色反应两步检测法，从而避免了操作者会受同位素辐射需要防护装置和监控检测过程等同位素操作的弊端。
在筛库的同时，还使用了PCR反应进行快速筛选噬菌体克隆的方法，从而节省筛库的时间。方法易行，操作简便，效果好，克隆出桂竹香外膜蛋白cDNA序列，可广泛应用于研究桂竹香细胞的物质运输，信号传递和细胞代谢等打好基础。
基因克隆的具体方法如下1、桂竹香幼叶总RNA的提取(一步法)取0.5g新鲜桂竹香嫩叶，加入液氮研磨，用5ml异硫氰酸胍溶液裂解，在冰上放置2min，按次序加入2m NaAC 0.5ml，水饱和酚5ml氯仿/异戊醇(24∶1)1ml，旋涡振荡，冰浴5min，4℃10000g离心20min，将上层水相移入1.5ml Ep管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃中冰箱沉淀1hr；4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次，溶于300ul水中-70℃保存。取5ul RNA于1.1％琼脂糖凝胶电泳检测(60v，1hr)取1ul RNA用紫外分光光度剂测定纯度和含量。
2、利用RNA直接进行反转录，并用LD-PCR的方法构建桂竹香苗期cDNA文库；(1)cDNA文库的建立cDNA的合成参考Clontech公司试剂盒的用户手册，取1ul RNA溶液，稀释至10ul，再从中取1ul为模板，以已修饰的oligo(dT)为引物，SMARTIII oligo为延伸模板，经逆转录合成全长sscDNA，通过LD-PCR合成dscDNA，其循环参数为95℃1min，22个循环(95℃15sec，68℃ 6min)。取5ul PCR产物于1.1％argrose/EtBr胶中电泳检测。取50uldscDNA进行蛋白酶消化，sfi I酶切，通过一个CHROMASPIN-400柱子，收集大于500bp的cDNA。将此cDNA与同样sfi I酶切过的入Triplex2TM载体连在包装提取物中加入4ul cDNA，混匀；稍离心，沉淀碎片，取上清，此为包装产物。
(2)文库质量的测定由于提供的E.coli XL1-blue菌种是保存于-70℃，加有25％甘油的LB培养基中，故应先活化菌种。用接种环取一杯菌环菌种在LB/tetagar平板上划线，37℃培养过夜，此为菌种的储存平板；从储存平板上挑取单克隆在LB/MgSO4agar平板上划线，37℃培养过夜，此为菌种的工作平板。从工作平板上挑取单个克隆，接种到装有15mlLB/MgSO4agar液体培养基的50ml三角瓶中，37℃，140rpm振荡培养过夜。取2ml过夜培养物+2ml Ep管中，5.000rpm离心5min；去上清，用1ml 10mm MgSO4重悬沉淀。取1ul包装产物，用1Xlambda dilutlon buffer稀释至5ul；另取1ul，同样稀释至10ul，然后从这两个稀释后的包装产物中各取1ul，转染200ul MgSO4重悬的XLI-blue过夜培养物(37℃，30min)，然后与3ml熔化的LB/MgSO4上层琼脂混合，铺板(90-mm平板)，37℃培养21hr后计数，测其滴度3、利用同源序列合成探针在Gene bank中比较，获得该基因保守区段，以此为据，并按随机引物标记法合成用地高辛标记的探针，长约640bp。
4、用地高辛标记探针，采用噬菌斑原位杂交的方法筛选桂竹香苗期cDNA文库按常规铺cDNA文库的150mm培养皿平板10个，用尼龙膜揭膜，变性并在UV-交联仪下交联固定DNA。在42℃下杂交液中杂交过夜，常温洗膜2次，每次5min，68℃洗膜2次，每次15min，在washing buffer中浸1-5min，在10ml blocking solution中温育30min，在20ml antibody solution中温育30min，再用washing buffer20ml洗2-5min，最后用NBT/BCIP进行颜色反应，在黑暗中温育2-3hr，随时观察尼龙膜上是否出现斑点。挑取蓝色斑点所对应的噬菌斑于SM buffer中保存。
5、阳性克隆的PCR检测为了进一步确定所挑取的阳性克隆是重组子，并确定其碱基序列的长度，使用PCR的方法进行检测。分别以克隆载体上两段序列和探针上两段序列为引物，进行PCR，循环参数为72℃ 3min，95℃ 30sec、50℃ 30sec，72℃ 30sec(循环30次)72℃ 3min，所得PCR产物在0.8％ agrose电泳(80V，1hr)，发现以载体一段序列为引物进行PCR，电泳时长度大约在1kb左右，以探针的序列为引物，其PCR产物电泳时，长度在500bp-750bp之间。
6限制酶切分析，将经过PCR检测后的阳性克隆转入E.coliBM25.8中，并提取质粒，经限制酶切分析发现其结果与PCR结果相似。
7、将获得的重组子送出测序，并将测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，所得结果显示，没有相同基因顺序出现。
权利要求
1.一种桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法，包括下列步骤(1)一步法提取桂竹香幼叶总RNA；(2)利用总RNA直接进行反转录，并用LD-PCR方法构建桂竹香苗期cDNA文库；(3)利用同源序列设计并合成同源探针；(4)用地高辛标记同源探针，噬菌斑原位杂交方法筛选桂竹香苗期cDNA文库；(5)利用PCR的方法快速筛选并确定阳性克隆；(6)限制性酶切分析，Sourthen杂交分析确定为重组子；(7)测序，并通过Bioinfomatics分析，确定桂竹香外膜蛋白基因序列。
2.按权利要求1所述的一种桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法，其特征是桂竹香外膜蛋白基因序列是GGCCATTATGGCCGGGGGTTGAAGTGAAGAAGAAACTGCAGCAATGGAGAAATCAGGAGATGATGTCAAATTCCCAAAACTGGAGAAACCTACAGGAAAGAAACAGACAGCGACGGTTGTTGTGGGAGTGTTGGCCGTGGGATGGTTGGCGATAGAGCTCGTGTTTAAGCCATTGTTCAAGAAGCTGAGCTCCGCTAAGGACAAATCCGATTCGGACGATGCCAGTGCCACCGCTCCTCCTCCCGCGTCGGACGCCTGAATTGGTGAGAATTATAAAGTCGACACGTGGAGGTCTTAATTACTTTTTTCTTAATGAAGGCTCATATTAAAAGCAAAATGTTGTGTGTTCTTTCCTTGCTTCGTTTGTAATATCGTTCGGTTTTACTTCTTTTGACGATGTTTTTAATTAATCTCCCTTTCCCTTTTCAATAAAATCCCGAGAGAAGGATTAATAAATCAATGAGATACGATGTACTAATTGGGTTTCACAAAACACCCCCCCCNCCCACCAAAAACCATGTCGGCCGCCCTCGGCCCCA
全文摘要
本发明公开一种桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法,该方法包括下列步骤:1)一步法提取桂竹香幼叶总RNA;2)利用RNA直接进行反转录;3)利用同源序列合成探针;4)用地高辛标记探针,噬菌斑原位杂交的方法筛选桂竹香苗期cDNA文库;5)利用PCR的方法快速确定阳性克隆是所筛选的重组子;6)限制酶切分析,Southern杂交分析确定为重组子;7)测序,并通过Bioinfo matics分析,确定该基因为新的未被克隆过的桂竹香外膜蛋白cDNA序列。本发明方法易行,操作简便,效果好。克隆出的桂竹香外膜蛋白的cDNA序列还可应用与研究桂竹香细胞的物质运输,信号传递和细胞代谢等。
文档编号C12Q1/68GK1362517SQ0110640
公开日2002年8月7日 申请日期2001年1月2日 优先权日2001年1月2日
发明者李旭锋, 刘天艳, 王劲, 袁旭 申请人:成都天友发展有限公司