专利名称：氯离子含量测定方法及氯离子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氯离子含量测定方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的氯离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
体液中的氯以离子形式存在，全部几乎与钠离子平衡增减。测定氯离子含量对于医学鉴定具有重要意义，目前已知测定方法有多种化学测定法—硝酸汞滴定法、硫氰酸汞比色法电量分析法离子选择电极法酶法销酸汞滴定法判断滴定终点比较困难，不同样本蛋白质含量不等，其终点的深浅和强度是变化不定的，且受胆红素、血红蛋白和血脂的干扰，因此本法精密度明显不佳，而且工作效率低。硫氰酸汞比色法在测定时，血清中其他因素如F.Br和I也可以起反应，其量少于1mmol/L，故可忽略不计。某些药物及胆红素均对其有影响。这种比色法消除主观因素的影响，并可在自动生化分析仪进行批量测定，属临床常用的一种方法。滴定法需要熟练的操作，终点要准确，尽可能排除主观因素的干扰，否则误差很大。血清中过多的胆红素。血脂及血红蛋白(溶血)对结果干扰很大。滴定法有淘汰的趋势。
电量分析法属于物理学方法。在恒定的电流下，以银电极置于标本中，从电极释放的Ag+与Cl-反应开始生成不解离的AgCl沉淀开始计时，当Cl-全部与Ag+作用完毕，游离的Ag+出现，其溶液电导明显增加，使仪器传感器和计时器立即切断电流并计算滴定所需的时间作为完成测定过程。标本中Br-和I-对其有一定干扰，其量很少，可忽略不计。该法简便，快速，测定时需要控制好电流。
离子选择电极法是目前测定氯离子的最好方法，因为测定氯离子的电极均与K+、Na+电极配套，仅需100μl全血即可测出标本中K+、Na+和Cl-的含量而快速、准确，操作简便，是目前广为临床使用的方法。但是氯离子电极寿命较短，一般有效期仅4-6个月。而且不同型号的仪器测定结果有一定误差。
近年来，研究出用酶法测定氯离子的新方法，本法稳定性好，结果准确可靠，适合大型生化分析仪使用。在临床化学分析中必定取代其他方法成为常规分析项目。然而，目前这方面的研究还不够深入，尤其是国内，检索包括专利文献在内的现有技术资料，尚未发现适合国情的实用技术方案。
检索中国专利，仅发现申请号为94112025.2、申请日为1994.01.21之类测定工业氯的专利，而未发现医学领域氯离子的测定专利，这从一个侧面说明，我国此方面的研究还比较欠缺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的氯离子含量测定方法，同时本发明还给出相应的氯离子诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行氯离子含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定氯离子含量的步骤如下1)、将样品与主要由α-淀粉酶(失活)、3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(3-CNP-β-G7)、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖2)、检测最终反应物在主波长405nm吸光度上升的速度，测算出氯离子含量的大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，测算出氯离子含量的大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用氯激活淀粉酶偶联葡萄糖苷酶反应比色法，应用氯离子激活已失去活性的淀粉酶使之重获活性后，偶联葡萄糖苷酶反应水解3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖产生氯-硝基酚，氯-硝基酚在405nm处有吸收峰，从而在405nm处发生吸光度升高，反应所产生的吸光度变化和样品中氯离子的含量成正比。在405nm处，在固定时间间隔内测定吸光度上升速度，即可将氯离子的含量算出。酶法测定无机氯离子试剂盒有操作简便、特异性高、灵敏度好等特点。
用于实现本发明方法的氯离子诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/Lα-葡萄糖苷酶 500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500--20000U/L稳定剂 10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂试剂I缓冲液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/Lα-葡萄糖苷酶 500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500--20000U/L稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/L稳定剂 10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖可以放在试剂II，试剂II其中的成分，α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶等也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/lα-淀粉酶(失活)500--50000U/L
稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/lα-葡萄糖苷酶500--20000U/Lβ-葡萄糖苷酶500--20000U/L稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.2--3mmol/L稳定剂 10--80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，α-淀粉酶(失活)可以放在试剂II中。试剂II其中的成分，α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等也可以放在试剂I中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的βH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是磷酸盐(Phosphate)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明氯离子诊断试剂盒较为理想
缓冲液 80--120mmol/lα-淀粉酶(失活)10000--40000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.5--2mmol/Lα-葡萄糖苷酶 5000--13000U/Lβ-葡萄糖苷酶 5000--13000U/L稳定剂 20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的氯离子诊断试剂盒包括缓冲液80mmol/lα-淀粉酶(失活) 10000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 0.5mmol/Lα-葡萄糖苷酶 5000U/Lβ-葡萄糖苷酶 5000U/L稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长405nm，测试副波长460nm以上，被测氯离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应
α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长405nm吸光度上升的幅度，从而测算出氯离子的含量。
本实施例应用氯激活淀粉酶偶联葡萄糖苷酶反应比色法，应用氯离子激活已失去活性的淀粉酶使之重获活性后，偶联葡萄糖苷酶反应水解3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖产生氯-硝基酚，氯-硝基酚在405nm处有吸收峰，从而在405nm处发生吸光度升高，反应所产生的吸光度变化和样品中氯离子的含量成正比。在405nm处，在固定时间间隔内测定吸光度上升速度，即可将氯离子的含量算出。
实施例二(双剂)本实施例的氯离子诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/lα-淀粉酶(失活) 25000U/Lα-葡萄糖苷酶 9000U/Lβ-葡萄糖苷酶 9000U/L稳定剂 50％(总体积)试剂II
缓冲液 100mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖1mmol/L稳定剂 20mmol/L测定氯离子含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长405nm，测试副波长460nm以上，被测氯离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长405nm吸光度上升的幅度，从而测算出氯离子的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的氯离子诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/lα-淀粉酶(失活) 40000U/L稳定剂50％(总体积)试剂II
缓冲液 120mmol/lα-葡萄糖苷酶 13000U/Lβ-葡萄糖苷酶 13000U/L稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 2mmol/L稳定剂 20mmol/L在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长405nm，测试副波长460nm以上，被测氯离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长405nm吸光度上升的幅度，从而测算出氯离子的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的氯离子诊断试剂有
试剂I缓冲液 100mmol/lα-淀粉酶(失活)20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 10000U/L稳定剂 50％(总体积)试剂II缓冲液 100mmol/lα-葡萄糖苷酶 10000U/L稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 100mmol/l3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖 2mmol/L稳定剂 50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长405nm，测试副波长460nm以上，被测氯离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应α-淀粉酶(失活) Cl α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖(CNP-β-G7)+3水 α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖(CNP-β-G2)+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖(G3)+葡萄四糖(G4)+葡萄五糖(G5)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶 2 氯-硝基酚-β-葡萄糖(CNP-β-G1)氯-硝基酚-β-葡萄糖+水 β-葡萄糖苷酶 氯-硝基酚+葡萄糖将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长405nm吸光度上升的幅度，从而测算出氯离子的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种氯离子含量测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由α-淀粉酶(失活)、3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶组成的试剂混合，使之发生如下反应α-淀粉酶(失活)Clα-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖+3水α-淀粉酶(得活)3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄四糖+葡萄三糖+葡萄四糖+葡萄五糖3-氯4-硝基酚-β-葡萄二糖+3-氯4-硝基酚-β-葡萄三糖+2水α-葡萄糖苷酶2氯-硝基酚-β-葡萄糖氯-硝基酚-β-葡萄糖+水β-葡萄糖苷酶氯-硝基酚+葡萄糖2)、检测最终反应物在主波长405nm吸光度上升的速度，测算出氯离子含量的大小。
2.根据权利要求1所述氯离子含量测定方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速(程)度，测算出氯离子的含量。
3.根据权利要求1或2所述氯离子含量测定方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述氯离子含量测定方法，其特征在于被测氯离子样品与试剂的比例控制在1/10到1/500。
5.一种氯离子诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40——200mmol/lα-淀粉酶(失活)500——50000U/L3-氯4-硝基酚-β-葡萄庚糖0.2——3mmol/Lα-葡萄糖苷酶 500——20000U/Lβ-葡萄糖苷酶 500——20000U/L稳定剂 10——80％(总体积)
6.根据权利要求5所述氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定氯离子含量的方法，同时本发明还涉及氯离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、α－淀粉酶(失活)、3－氯4－硝基酚－β－葡萄庚糖、α－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出氯离子的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/40GK1763220SQ200410065049
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者王尔中 申请人:王尔中