专利名称：利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法。
背景技术：
催乳素(prolactin，PRL)又称促乳素或生乳素，是繁殖成功所必需的垂体前叶肽类激素。催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)与生长激素受体(growth hormonereceptor，GHR)、胎盘催乳素受体(placental lactogen receptor，PLR)构成一个基因家族，该基因家族可能由某一共同祖先基因进化而来(Boutin J M，JolicoeurC，Okamura H，et al.Cloning and expression of the rat prolactin receptor，amember of the growth hormone/prolactin receptor gene family.Cell，1988，5369-77)。通过鹿、牛、人的基因图谱比较，发现催乳素受体基因是细胞因子受体超家族(cytokine receptor superfamily)的一员。催乳素受体家族成员与Jak家族成员紧密相连。这类受体蛋白有一种共同的功能，即通过与配体的结合引发各种不同的胞内反应。
研究表明，PRL受体结构具有多样性。受体结构的多样性主要由胞内域的变异造成。已知哺乳动物中PRL至少有2种形式的受体存在，即长型受体(long form)和短型受体(short form)。PRL受体为仅含有1个跨膜区域的跨膜蛋白，由膜外域、跨膜域和胞内域3部分组成，具有细胞因子受体超家族的结构特征。哺乳动物和禽类PRL受体结构的不同之处在于哺乳动物只有1个胞外配体结合区，而禽类则具有2个重复单位的配体结合区。
Boutin等最先从大鼠中克隆了短型PRLR cDNA，该cDNA为1635bp，只有一个开放阅读框，可编码310个氨基酸(Boutin JM，Jolicoeur C，Okamura H，et al.Cloningand expression of the rat prolactin receptor，a member of the growthhormone/prolactin receptor gene family.Cell，1988，5369-77)。随后Shirota等从大鼠的卵巢中克隆了含2132bp的长型PRLR cDNA(Shirota M，Banville D，Ali S.Expression of two forms of PRL receptor in rat ovary and liver.MolEndocrinol，1990，41136-1143)。Moore等又从小鼠的乳腺中分离了编码长型PRLR的cDNA，其长度为1992bp，与大鼠、兔长型PRLR的同源性分别为91％和72％；另外通过分析发现小鼠长型PRLR胞内域的中部区即384-524个氨基酸是最保守的；PRLRcDNA 3′非翻译区没有聚腺苷酸化共有序列(AATAAA)，这与报道的大鼠卵巢和牛PRLRcDNA序列相一致(Moore R C，Oka T.Cloning and sequencing of the cDNA encodingthe murine mammary gland long-form prolact in receptor.Gene，1993，134263-265)。
Tortonese等报道在绵羊垂体腺中检出PRLR mRNA，同时通过RT-PCR扩增得到的cDNA核苷酸序列与牛的PRLR cDNA序列有高达95.6％的同源性(Tortonese D J，BrooksJ，Ingleton P M，et al.Detection of prolactin receptor gene expression inthe sheep pituitary gland and visualization of the specific translation ofthe signal in gonadotrophs.Endocrinology，1998，139(12)5215-5223)。此外，还应用RT-PCR扩增特定形式的长型PRLR分离得到了2个cDNA，其中有一个胞内域有39bp的插入片段。这个片段与Anthony等在绵羊胎儿肝脏和成年羊黄体组织中发现的插入片段是相同的；插入位点与牛PRLR的第263个氨基酸是相对应的(Anthony R V，Smith G W，Duong A，et al.Two forms of the prolactin receptormessenger ribonucleic acid are present in ovine fetal liver and adult ovary.Endocrine，1995，3291-295)。最近，公布了绵羊PRLR cDNA的全长编码序列，短型和长型两种PRLR分别对应272和557个氨基酸，而且进一步证实了短型PRLR cDNA有39bp的插入片段，同时基因组分析表明这个片段的存在或缺失是造成共同转录物交替剪接的原因，并不是由于存在不同的基因。
催乳素的主要作用是促进乳腺发育和泌乳，通过增加基因转录及mRNA的半衰期，其能刺激乳蛋白基因的表达(Bole-Feysot C，Goffin V，Edery M，Binart N，KellyP A.Prolactin(PRL)and its receptoractions，signal transduction pathwaysand phenotypes observed in PRL receptor knockout mice.Endocrine Reviews，1998，19(3)225-268)。其功能是通过与位于质膜和一些组织中的特定高度亲和性受体相结合而引发的。PRLR基因在哺乳动物的乳腺、黄体、卵巢、睾丸、前列腺、肝脏等多种组织中表达，在不同的动物表达的主要组织器官并不一样。Shiu等最早在乳腺组织中发现了PRLR(Shiu R P C，Kelly P A，Friesen H G.Radioreceptor assay forprolactin and other lactogenic hormones.Science，1973，180968-971)，Posner等发现PRLR也大量分布在其它一些组织中(Posner B I，Kelly PA，Shiu R P C，et al.Studies of insulin，growth hormone and prolactin bindingtissuedistribution，species variation and characterization.Endocrinology，1974，95521-531)。
Arden等首先通过Southern杂交将PRLR基因定位于人的第5号染色体的短臂上，又通过染色体原位杂交将其进一步定位于5p13-p14，同时数据库信息表明人和兔的PRLR序列与猪的PRLR序列有较高的同源性，同源性分别为74％和67％；此外Barker等还将大鼠的PRLR基因定位于第2号染色体，小鼠的PRLR基因定位于第15号染色体(Barker C S，Bear S，Keler T，et al.Activation of the prolactin receptor geneby promoter insertion in a moloney murine leukemia virus-induced rat thymoma.Journal of Virology，1992，66(11)6763-6768)。
Vincent等通过参考家系DNA的RFLP分析以及体细胞杂交，将PRLR基因定位到猪16号染色体，同时发现其与3个标记S0006、GHR1和S0077紧密连锁，并用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，发现了PRLR基因的多态性；同时确定了不同品种来源猪的基因型，发现等位基因频率在不同品种中是不一样的(Vincent A L，WangL，Tuggle C K，et al.Prolact in receptor maps to pig chromosome 16.MammalianGenome，1997，8793-794)。等位基因频率在不同品种中的差别表明在某些群体中可以进行一个等位基因的选择，这样对等位基因影响不同性状的研究具有很大的意义。此外，张淑君等通过PCR-RFLP方法，对长大猪、二花脸猪和大白猪的催乳素受体基因的一个位点进行了限制性片段长度多态性分析(张淑君，熊远著，曾凡同等.PRLR和ESR四个基因位点在长大二花脸大白猪中多态性分析.Animal BiotechnologyBulletin，2000，7(1)101-102)，结果表明PRLR基因的这个位点在两个品种和长大母猪群中都存在多态性，而且其在一定程度上与Vincent等的研究(Vincent AL，Wang L，Tuggle C K，et al.Prolactin receptor maps to pig chromosome 16.Mammalian Genome，1997，8793-794)相符。
Jenkins等利用牛PRLR的cDNA克隆将绵羊的PRLR基因定位于第16号染色体，其与FST(Follistatin)基因以及GHR(growth hormone receptor)基因均位于第16号染色体的同一区域(Jenkins Z A，Henry H M，Sise J A，et al.Follistatin(FST)，growth hormone receptor(GHR)and prolact in receptor(PRLR)map onto sheep chromosome 16.Animal Genetics，1998，29(Suppl.1)37)；初步的连锁分析表明PRLR基因位于两个标记McM150和OarCP99之间。在这个区域，有8个微卫星标记已经被确定。Jenkins等又进一步通过群体多点连锁分析发现PRLR基因位于BMS703和BM5004之间，其与BMS703的距离大约为5cM(Jenkins Z A，HenryH M，Sise J A，et al.Follistatin(FST)，growth hormone receptor(GHR)andprolactin receptor(PRLR)genes map to the same region of sheep chromosome 16.Animal Genetics，2000，31280)。
PRLR基因是生长与分化的一个重要调控基因，用限制性内切酶消化，通过RFLP分析发现PRLR具有多态性。PRLR基因由于它在几个繁殖途径中的综合作用而被作为繁殖性状的一个候选基因(储明星.猪产仔数性状候选基因的研究进展.畜牧与兽医，2001，33(1)36-37)。猪黄体细胞中PRLR数目在妊娠期间增加，并且PRLR基因已定位到猪第16号染色体。鉴于这些特性，将PRLR基因作为猪繁殖性状的一个候选基因是有理由的。Vincent等将PRLR基因作为由大白猪(2个不同来源)、长白猪、杜洛克猪、大白猪/梅山猪来源组成的5个PIC品系繁殖性状的一个候选基因进行了研究(Vincent A L，Evans G，Short T H，et al.The prolactin receptor gene isassociated with increased litter size in pigs.InProceedings of the 6th WorldCongress on Genetics Applied to Livestock Production，Armidale，Australia，1998，2715-18)。对每一种基因型，都计算了总产仔数和活产仔数的最小二乘平均值，并按品系进行了加性和显性效应的分析。结果表明，这个基因与所测定的5个品系中的3个品系的总产仔数和/或活产仔数显著相关(P＜0.05)。在纯合基因型之间，效应大小是每窝增加0.66头到1头以上的仔猪，随遗传背景而变化。Rothschild等报道在几个物种之间保守的PRLR基因一个区域内所包含的一个氨基酸残基在猪中发生了变化，这一突变与猪高窝产仔数相关联(Rothschild M F，Vincent A L，Tuggle CK，et al.A mutation in the prolactin receptor gene is associated withincreased litter size in pigs.Animal Genetics，1998，29(Suppl.1)69)。当与传统选择方法结合使用时，PRLR基因检测作为一种强有力工具对一些品系是有潜力的。
Ormandy等通过大鼠胚胎干细胞的基因定位得知其携带着PRLR的种系无效突变基因，该基因对繁殖性状有很大的影响。杂合的雌鼠表现为在其最初妊娠期间缺乏泌乳能力，这是由于乳腺的发育受到抑制；纯合雌鼠则表现为不育，而且还表现出多种不正常的生殖现象，包括受精率的降低、植入前胚胎发育受阻等(Ormandy C J，CamusA，Barra J.Null mutation of the prolactin receptor gene produces multiplereproductive defects in the mouse.Genes and Development，1997，11167-178)。
Linville等研究了PRLR基因对猪第一胎窝产仔数和排卵数的影响，结果表明PRLR基因频率分布在不同品系猪中不同(P＜0.005)，在524头猪中的等位基因频率为A＝0.33、B＝0.67，低频率等位基因A与较高的排卵数、较高的总产仔数、较高的活产仔数、较低的木乃伊有关(Linville R C，Pomp D，Johnson R K，et al.Candidategene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine.J.Anim.Sci.，2001，7960-67)。
绵羊的产羔数是一个遗传力很低的数量性状，难以用常规的育种技术来改良产羔数性状。标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)能够通过影响选择的时间、选择的强度以及准确性而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效，而找到与这些数量性状基因座相连锁的分子遗传标记，则是实现标记辅助选择的先决条件。
发明创造内容本发明的目的是提供一种利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法。
本发明所提供的利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列组成的一对引物对待测绵羊的DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位碱基为T还是C，第174位碱基为T还是G。
所述单核苷酸多态性检测的方法可为DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等方法。
为得到更好的检测结果，所述单核苷酸多态性检测的方法优选为先对所述PCR扩增产物进行单链构象多态性检测，然后进行DNA测序。
以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物得到的PCR扩增产物长度为176bp，具有SEQ ID №3的核苷酸序列。如果自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位碱基为T，第174位碱基为T，其纯合体的基因型为AA；自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位碱基为C，第174位碱基为G，其纯合体的基因型为BB；杂合体的基因型为AB。
所述绵羊包括小尾寒羊，多赛特羊，萨福克羊和多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代；优选为小尾寒羊。
本发明以高繁殖力绵羊品种(如小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(如多赛特羊、萨福克羊等)为实验材料，对PRLR基因进行单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)检测，比较PRLR基因在不同绵羊品种中的多态性，并对其具有SSCP多态性的DNA片段进行测序比较分析，结果表明自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位碱基存在T→C的碱基突变，第174位碱基存在T→G的碱基突变。
本发明的研究结果表明PRLR基因座AB基因型和BB基因型小尾寒羊窝平均产羔数分别比AA基因型多0.52只(P＜0.05)和0.64只(P＜0.05)，PRLR基因座B等位基因与小尾寒羊高产羔数呈显著正相关。
本发明的研究结果表明PRLR基因可能是控制绵羊多胎性能的一个主效基因或与之存在紧密的遗传连锁，为绵羊高繁殖力的标记辅助选择和育种提供了理论和实践基础，能够大大缩短育种周期，提高育种效率，并且将给绵羊生产者带来可观的经济效益。
图1为小尾寒羊的PRLR基因PCR扩增产物的SSCP分析电泳图谱图2为小尾寒羊PRLR基因的第84位和第174位AA和BB基因型的序列比较具体实施方式
实施例1、PRLR基因的单核苷酸多态性检测实验材料具有第1胎和第2胎产羔数记录、没有亲缘关系的157只山东小尾寒羊母羊血样(10ml/只)采自山东嘉祥种羊场；多赛特羊48只母羊、萨福克羊50只母羊、多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代64只母羊，血样均采自北京市兴绿原农牧发展有限责任公司种羊场(北京市顺义区杨镇)。所采血样均为10ml/只，用ACD抗凝，-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE，4℃保存。
主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司。
1、引物设计和PCR扩增根据发表的绵羊PRLR基因部分序列(GenBank登录号AF042358)，针对内含子II设计1对特异性引物，扩增片段大小为176bp。分别以小尾寒羊、多赛特羊、萨福克羊、多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代母羊的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列为上游引物5′-TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3′(SEQ ID №1)；下游引物5′-GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3′(SEQ ID №2)；PCR扩增体系为25μL10×PCR缓冲液2.5μL，引物50ng，dNTP终浓度为200μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，Mg2+浓度2.0mmol/L，模板100ng。反应条件94℃预变性5min；94℃变性1min，68℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。利用引物扩增绵羊基因组DNA，所得PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到176bp特异性条带，可直接进行SSCP分析。
2、SSCP分析取步骤1中制备的PCR产物2μL置于PCR管中，加5μL变性缓冲液(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH 8.0)、10％甘油)，离心混匀，98℃变性10min，迅速冰浴10min。样品在10％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。电泳结束后，进行银染显带。用美国Alpha Innotech公司的凝胶成像系统拍照。
其中，小尾寒羊的SSCP检测结果如图1所示。图1中，泳道9，10为AA基因型；泳道1-6，8为AB基因型；泳道7为BB基因型。
3、不同基因型的纯合子个体的克隆测序为了确定点突变在序列中的位置，将AA、BB两种纯合基因型个体的PCR产物进行克隆测序。结果表明PCR产物长度为176bp，BB型和AA型相比，仅自序列表中序列3的5′端第84位碱基存在T→C的碱基突变，第174位碱基存在T→G的碱基突变(图2)。参考GenBank中绵羊PRLR基因第二内含子序列，将AA型定为野生型，BB型定为突变型。该突变没有导致氨基酸的改变，属于沉默突变。
实施例2、检测小尾寒羊窝平均产羔数与PRLR基因单核苷酸多态性的关系配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较小尾寒羊窝平均产羔数在标记基因型之间的差异yijkl＝μ+HYSi+Pj+Gk+eijkl其中yijkl为窝平均产羔数的记录值；μ为群体平均值；HYSi为第i个场年季的固定效应；Pj为第j个胎次的固定效应；Gk为第k种标记基因型的固定效应；eijkl为随机残差效应。用SAS(6.12版本)的GLM(General Linear Model)过程完成。
1、不同绵羊群体PRLR基因型频率和基因频率按照实施例1的方法对小尾寒羊、多赛特羊、萨福克羊、多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代母羊进行了PRLR基因型检测，计算了不同绵羊群体的基因型频率和基因频率，统计结果如表1所示。
表1.PRLR基因的PCR-SSCP在4个绵羊群体中的基因频率和基因型频率群体 样本数基因频率基因型频率A B AA AB BB小尾寒羊157 0.7898 0.2102 0.6178(97) 0.3440(54) 0.0382(6)多赛特羊48 0.6146 0.3854 0.3542(17) 0.5208(25) 0.1250(6)萨福克羊50 0.920.080.84(42)0.16(8) 0(0)杂一代羊64 0.6484 0.3516 0.4844(31) 0.3281(21) 0.1875(12)注括号内的数字表示不同基因型的个体数。
表1表明在4个绵羊群体的PRLR基因内含子2中都检测到了碱基突变。在小尾寒羊、多赛特羊、多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代母羊中都检测到野生纯合基因型(AA)、突变杂合基因型(AB)和突变纯合基因型(BB)，而在萨福克羊中没有检测到突变纯合型(BB)，只检测到2种基因型(AA、AB)。
2、不同绵羊群体PRLR基因型分布差异检验不同绵羊群体PRLR基因型分布差异检验结果如表2所示，表明小尾寒羊和萨福克羊之间PRLR基因型分布差异显著(P＜0.05)，小尾寒羊和多赛特羊之间PRLR基因型分布差异极显著(P＜0.01)，小尾寒羊和杂一代羊之间PRLR基因型分布差异极显著(P＜0.001)；多赛特羊和萨福克羊之间PRLR基因型分布差异极显著(P＜0.001)，多赛特羊和杂一代羊之间PRLR基因型分布差异不显著(P＞0.05)；萨福克羊和杂一代羊之间PRLR基因型分布差异极显著(P＜0.001)。
表2. 4个绵羊群体PRLR基因型分布差异检验多赛特羊萨福克羊 杂一代羊小尾寒羊12.31** 8.98* 13.87***多赛特羊25.32*** 4.23萨福克羊 18.04***注df＝(2-1)(3-1)＝2，x2(df＝2，0.05)＝5.99，x2(df＝2，0.01)＝9.21，x2(df＝2，0.001)＝13.82，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0013、PRLR基因不同基因型的小尾寒羊窝平均产羔数的最小二乘平均值及标准误不同PRLR基因型的小尾寒羊窝平均产羔数的最小二乘平均值及标准误如表3所示，表明BB基因型小尾寒羊窝平均产羔数比AA基因型多0.64只(P＜0.05)，AB基因型小尾寒羊窝平均产羔数比AA基因型多0.52只(P＜0.05)，B等位基因对A等位基因的显性度为0.625。说明B等位基因与小尾寒羊高产羔数呈显著正相关。推测PRLR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一个主效基因或与之存在紧密的遗传连锁。
表3.不同PRLR基因型的小尾寒羊窝平均产羔数的最小二乘平均值及标准误基因型 样本数 最小二乘平均值及标准误AA 972.01b±0.18AB 542.53a±0.21BB 6 2.65a±0.29a 0.32d 0.20D 0.625注同一性状具有不同字母肩标的平均值间差异显著(P＜0.05)。
D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(BB+AA)/2
序列表<160>3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tgtcagtaag cgtcagagggc 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggctggtgga aggtcactct t21<210>3<211>176<212>DNA<213>绵羊(0vis aries)<220>
<221>misc-feature
<222>(84)<223>n＝t或c<220>
<221>misc-feature<222>(174)<223>n＝t或g<400>3tgtcagtaag cgtcagaggg caatgaaaga aagccaagaa aacaccagca cacaggaatg 60cttgttaggt ttatcagatc tgtncataag ccctgtcata aacattttat acaaataatc 120agttgagaaa gtgggtgaat atttgatgaa tacaaaagag tgaccttcca ccancc 17权利要求
1.一种利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列组成的一对引物对待测绵羊的DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID№3的5′端第84位碱基为T还是C，第174位碱基为T还是G。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述单核苷酸多态性检测的方法为DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述单核苷酸多态性检测的方法为先对所述PCR扩增产物进行单链构象多态性检测，然后进行DNA测序。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述绵羊包括小尾寒羊，多赛特羊，萨福克羊和多赛特公羊与小尾寒羊母羊杂一代。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述绵羊为小尾寒羊。
全文摘要
本发明公开了一种利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法。本发明所提供的利用单核苷酸多态性预测绵羊窝平均产羔数的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列组成的一对引物对待测绵羊的DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID№3的5′端第84位碱基为T还是C，第174位碱基为T还是G。本发明的研究结果表明PRLR基因可能是控制绵羊多胎性能的一个主效基因或与之存在紧密的遗传连锁，为绵羊高繁殖力的标记辅助选择和育种提供了理论和实践基础，能够大大缩短育种周期，提高育种效率，并且将给绵羊生产者带来可观的经济效益。
文档编号C12Q1/68GK1749416SQ20041007443
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者储明星, 牟玉莲, 孙少华 申请人:中国农业科学院畜牧研究所