包含重组序列基序的构建体在增强藓类中基因表达中的应用的制作方法

专利名称：：包含重组序列基序的构建体在增强藓类中基因表达中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在真核细胞内、具体为包括于藓类中的植物细胞(例如藓类原丝体细胞)内提高基因表达的方法和材料。现有技术在哺乳动物细胞培养中用于提高重组蛋白质表达的基因扩增是常用的策略(Herlitschka等人，(1996)ProteinExpr.Purif.8，358-364，Ringold等人，(1981)J.Mol.Appl.)。由于异源DNA的多拷贝整合能够触发的沉默事件，在植物中实现基因扩增策略是难以解决的(Asaad等人，(1993)PlantMolBiol.22，1067-1085)。最近，开发了植物中的基因扩增策略以克服这些局限性。从烟草核糖体DNA的非转录间隔区分离了顺式作用遗传因子aps。将所述间隔元件与目的报道基因融合，并引起目的异源基因拷贝数增加以及由此导致的异源蛋白质的更高的表达水平(Borisjuk等人，(2000)NatureBiotechnol.18，1303-1306)。Klimyuk等人描述了涉及通过反式剪接表达异源蛋白质的另一个策略(WO02/097080)。至今，关于转基因藓类植物中拷贝数与异源基因表达的相关性知之甚少。藓类在生产重组蛋白质中的用途是相当确定的技术(EP1206561，Gorr等人，2001，Naunyn-Schmiedeberg′sArch.Pharmacol.363Suppl.R85)。通常可以将1至约50拷贝的转化质粒中的任何一种整合到转化的藓类组织基因组中(Schaefer(2002)Annu.Rev.PlantBiol.53，477-501)。取决于使用的转化构建体的设计，可以发生同源重组(即定向整合事件)和/或异源重组(即随机或非定向整合事件)。因此，使用与藓类基因组DNA序列同源的DNA序列(即包含编码或非编码序列)用于转化，可以通过引入的或转化DNA向同源DNA基因组基因座中的整合引起一个或多个同源重组事件。使用与藓类基因组DNA序列缺乏任何可评估的同源性的DNA序列(即包含编码或非编码序列)用于转化，可以通过引入的DNA向基因组中的随机整合引起一个或多个异源重组事件。藓类是唯一已知的显示高频率同源重组的植物体系(Strepp等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，4368-4373；Schaefer(2002)Annu.Rev.PlantBiol.53，477-501)。藓类这一明显独特的性质已被用于基因的定向引入。然而，通过增加目的质粒拷贝数来扩增基因表达以产生每单位质量稳定转化的藓类组织中更高水平的蛋白质迄今尚未得到描述。令人惊讶的是，以至少两个含有至少一套重组序列的异源核酸序列转化(通常共转化)藓类组织细胞(原生质体)，在再生组织(例如藓类原丝体中含有的细胞)中会引起异源核酸构建体的整合拷贝数的增加，所述整合拷贝数的增加反过来与蛋白质表达水平的增加相关。因此本发明的目的是提供改进的在藓类组织所含细胞中产生目的蛋白质的方法。
发明内容根据本发明，提供了在藓类植物细胞中扩增基因表达的方法，其包括1)提供至少第一个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中该构建体在其5′末端以第一个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第一个相同方向的第二个重组序列为侧翼；2)提供至少第二个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中该构建体在其5′末端以所述第二个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第二个相同方向的所述第一个重组序列为侧翼；以及3)将至少所述第一个和所述第二个异源核酸构建体转化到藓类植物细胞中。技术人员将理解，一旦将所述至少两个异源构建体转化到藓类植物细胞(诸如藓类原生质体，例如允许后来再生为例如小立碗藓(Physcomitrellapatens)的藓类原丝体的小立碗藓原生质体)中，它们将经历重复多次的相互重组。一旦在藓类植物细胞中启动，该过程将增加整合的本发明的转化DNA构建体的拷贝数。因此，作为本发明的另一方面，提供了藓类原丝体(优选小立碗藓原丝体)，所述原丝体包含以至少两个本发明的互补构建体稳定转化、更优选共转化的细胞。最后，来自至少一个目的异源基因的目的异源蛋白质水平的显著增加超过了在藓类原丝体细胞中可测量的来自缺少本发明构建体特性的常规转化构建体的蛋白质水平。至少第一个和至少第二个重组序列形成使本发明的构建体可能彼此重组的互补组(complementaryset)。技术人员自然会理解，根据计划利用多少个相同或不同的目的核苷酸序列来产生蛋白质，可以采用在其中可能使用一个或多个重组序列互补组(例如1、2、3、4或5或更多组)的本发明的构建体。为方便起见，优选使用单个重组序列互补组。本发明的另一方面，提供了本发明的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第一个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；以及3)引入的第二个重组序列。本发明的另一方面，提供了本发明的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第二个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；以及3)引入的第一个重组序列。因此两个构建体含有定位于其中不同位点的相似的互补重组序列，所述互补重组序列使得或允许构建体在藓类原丝体(例如小立碗藓原丝体)中含有的转化的藓类原丝体细胞中彼此原位重组。本发明的构建体优选为线性形式。可以使用这类构建体以至少两个单独的转化事件转化藓类原生质体，其中第一个转化事件与第二个转化事件在时间上分离，或可以将本发明的构建体共转化到后来允许或能够再生为藓类原丝体的藓类原生质体中。转化事件优选包括以至少两个如上所述之本发明的构建体共转化藓类原生质体。在本发明的构建体中利用的重组序列可以是选自任何生物的任何序列，例如植物基因组DNA，例如小立碗藓基因组DNA、cDNA、内含子或外显子区或非编码区或其任何组合。用作重组序列的合适的基因组DNA可以包含来自外显子或内含子或二者杂交体的DNA。优选由内含子DNA或非编码区DNA形成重组序列。如在此所讨论的，两个侧翼重组序列的方向优选为相同方向，例如在两个转化构建体二者中都为5′至3′方向或为3′至5′方向，尽管重组序列在两个构建体中的实际位置如上文所提及的各不相同。技术人员自然会理解，本发明的异源构建体将在使二者之间能够发生重组事件的合适的位置和方向包含重组序列。本发明的构建体的重组核苷酸序列可以是任何长度，前提是其能够引起或允许重组事件发生。在本发明的构建体中采用的重组序列的合适长度在25-1000个核苷酸长度或更长；25-650个核苷酸长度；50-650个核苷酸长度；100-400个核苷酸长度；或200-400个核苷酸长度(例如约200+/-50个核苷酸长度)的范围内。技术人员将理解，本发明构建体的重组序列的长度可以根据设计而变化。作为本发明的另一方面，提供了含有本发明的构建体的藓类细胞、含有所述藓类细胞的藓类原丝体和/或含有本发明的构建体的藓类植物，具体为藓类原丝体细胞、包含含有本发明的构建体的原丝体细胞的藓类原丝体和/或含有本发明的构建体的藓类植物小立碗藓。现在将更详细地对本发明的具体方面进行讨论。定义下文广泛使用术语“异源的”指使用基因工程(即人为干涉)将讨论中的基因/核苷酸序列引入藓类原生质体。异源基因可能增加来自内源等价基因(即通常执行相同或相似功能的基因)的目的蛋白质的表达，或者该插入序列可能对于内源基因或其它序列是额外的。对细胞异源的核酸可以非天然存在于该类型、变种或物种的藓类原生质体中。因此异源核酸可以包含置于藓类原生质体(例如来自小立碗藓的原生质体)背景中的特定类型生物(例如哺乳动物物种，例如人类、绵羊、牛、马或猪物种)的或衍生自该生物的编码序列。另一种可能是关于将被置于藓类原生质体中的核酸序列的，该核酸序列或类似物天然存在于所述藓类原生质体中，但是其中核酸序列与该细胞或该植物的类型或物种或变种的细胞中非天然存在的核酸连接和/或邻近，例如与一个或多个控制表达的调节序列(例如启动子序列)可操作地连接。除非文中另外要求，“基因”指编码翻译为肽、多肽或蛋白质的遗传信息的任何核酸。将“载体”定义为尤其包括可以或不可以自我传递或活动、且可以转化原核或真核宿主并存在于染色体外的、双链或单链线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体(例如具有复制起点的自主复制质粒)。具体地包括穿梭载体，所述穿梭载体指能够天然地或经过设计在两种不同的宿主生物中复制的DNA载体，所述宿主生物选自放线菌及有关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、藓类、哺乳动物、酵母或真菌)细胞。“表达载体”指这样的载体，在所述载体中，核酸处于合适的启动子或其它例如微生物细胞或藓类原生质体的宿主细胞中的转录调节元件的控制下、并与其可操作地连接。该载体可以是在多种宿主中行使功能的双功能表达载体。在基因组或亚基因组DNA的情况下，所述DNA可以含有其自身的启动子或其它调节元件，且在cDNA的情况下，所述cDNA可以处于合适的启动子或其它宿主细胞中的表达调节元件的控制下。“启动子”是一段核苷酸序列，可以由此起始在下游(即在双链DNA有义链的3′方向)可操作地连接的DNA的转录。“可操作地连接的”指作为相同核酸分子的部分连接、为从启动子起始的转录合适地定位并定向。本领域技术人员充分理解应用于启动子的术语“诱导型的”。处于诱导型启动子控制下的表达对施加的刺激的反应基本上是“接通”或增加的。刺激的性质在启动子之间变化。在缺乏合适刺激时，一些诱导型启动子引起很少或不可检测水平的表达(或没有表达)。在缺乏刺激时，其它诱导型启动子引起可检测的组成性表达。无论缺乏刺激时的表达水平如何，在正确刺激的存在下，任何诱导型启动子的表达都增加。本发明也包括使用任何这些序列的变体。变体蛋白质与上文讨论的全部或部分序列具有同源性或相同。一般而言，无论怎样在此使用该术语，变体都可以是(i)有关蛋白质的天然存在的同源变体，(ii)人工产生的同源变体(衍生物)，技术人员可以根据此公开内容(例如通过定点或随机诱变或通过直接合成)制备所述同源变体。编码变体多肽的变体核酸优选从原始核酸直接或间接产生(例如经过一个或多个扩增或复制步骤)。对核酸序列的改变可以通过核酸中一个或多个核苷酸的一个或多个添加、插入、缺失或置换来产生衍生物，从而导致所编码的多肽中添加、插入、缺失或置换一个或多个氨基酸。为了改变所编码的多肽的活性(例如特异性)或稳定性，所需突变可以是随机或定点诱变。可以通过保守变异进行改变，即一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，或一个极性残基取代另一个，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺。也包括具有非保守置换的变体。在决定肽构象或活性的关键区域内，这类改变可能为多肽赋予有利的特性，例如改变的稳定性或特异性。在变体的情况下，优选通过使用FASTA和FASTP(见Pearson和Lipman，1988.MethodsinEnzymology18363-98)进行的序列比较建立相似性或同源性。使用默认矩阵，优选如下设置参数Gapopen(缺口中第一个残基的罚分)蛋白质为-12/DNA为-16Gapext(缺口中额外残基的罚分)蛋白质为-2/DNA为-4KTUP字长蛋白质为2/DNA为6。同源性可以处于核苷酸序列和/或所编码的氨基酸序列水平。核酸和/或氨基酸序列优选具有至少约75％或80％的同一性，最优选至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。也可以使用探针方法学(probingmethodology)评定同源性(Sambrook等人，1989)。计算实现具有特定序列同源性的核酸分子之间杂交所需的严格性条件的一个通式是Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/双链体中碱基数。作为对上述通式的说明，使用[Na+]＝及50-％甲酰胺，以42％的GC含量和200个碱基的平均探针大小，Tm为57℃。同源性每降低1％，DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度将观察到序列同一性高于约75％的靶。在藓类植物中的用途如下所述，在其多个方面，一般将本发明用于藓类原生质体，其中使用编码目的蛋白质的核酸。在藓类原生质体中有效的稳定启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)。其它实例公开于Lindsey和Jones(1989)PlantBiotechnologyinAgriculture@Pub.OUPress，MiltonKeynes，UK的第120页中。可以选择启动子以含有一个或多个赋予表达的发育和/或组织特异性调节控制的序列基序或元件。诱导型的植物启动子包括Caddick等人，(1998)NatureBiotechnology16177-180中的乙醇诱导的启动子。预期将发送转录终止信号的终止子作为转录单元末端的DNA序列。这些元件是含有多腺苷酸化信号的3′非翻译序列，所述序列作用引起向初级转录物的3′末端添加多腺苷酸序列。对于在植物细胞中的表达，胭脂氨酸合酶转录终止子(A.Depicker等人，1982，J.ofMol.&AppliedGen.1561-573)序列可以起转录终止信号的作用，CaMV35S终止子也可以(Tpfer等人，(1987)NAR15，5890)。如果需要，选择性遗传标记也可以包含于另外的常规构建体(例如环形质粒)中或另外的共转化到本发明的藓类细胞中的线性化DNA构建体中，所述遗传标记例如赋予诸如抗生素或除草剂(例如卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、绿黄隆、氨甲蝶呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉和草甘膦)抗性这类选择性表型的那些。本发明也提供这样的方法，其包括将这类含有适当异源序列的构建体引入藓类植物细胞和/或通过应用合适的刺激(例如有效的外源性诱导物)诱导本发明的构建体在藓类植物细胞内表达。合适的藓类植物细胞包括藓类原生质体以及原丝体(例如来自小立碗藓的原丝体)中含有的细胞。可以使用任何合适的技术将核酸引入藓类原生质体中，例如在此所述的PEG介导的DNA摄取、粒子或微粒轰击(US5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、显微注射(WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966，Green等人，(1987)PlantTissueandCellCulture，AcademicPress)、电穿孔(EP290395、WO8706614GelvinDebeyser)、其它直接摄取DNA的形式(DE4005152、WO9012096、US4684611)、脂质体介导的DNA摄取(例如Freeman等人，PlantCellPhysiol.291353(1984))或涡旋方法(vortexingmethod)(例如Kindle，PNASU.S.A.871228(1990d)。在Oard，1991，Biotech.Adv.91-11中综述了转化植物细胞的物理方法。优选电穿孔、PEG介导的DNA摄取和直接DNA摄取。尤其优选如此处实例中所公开的改良的PEG介导的DNA摄取程序。通过其转化某些藓类物种的效率和以选择的具体方法学实施本发明的人员的经历和偏爱确定转化技术的具体选择。对技术人员而言显而易见的是，将核酸引入藓类原生质体的转化体系的具体选择对本发明并非必要。然而，优选使用如此所述的PEG介导的DNA转化体系。因此本发明的各个方面提供了转化藓类原生质体的方法，其涉及将如此所述的基于异源核酸的本发明的构建体引入藓类原生质体和原生质体再生为原丝体组织，以及引起或允许表达来自本发明的构建体的蛋白质。因此，技术人员可以预期通过使用本发明的构建体和方法提高靶向细胞溶胶或其它细胞区室的蛋白质的表达。优选将以本发明的方法产生的重组蛋白质分泌到稳定转化的原丝体组织的培养基中。因此，通过采用至少两种如此描述的本发明的构建体，可以产生具有高拷贝数靶基因的生产品系(productionlines)，这反过来导致在合适的生物反应器中在培养期间的高蛋白质产量。要增强的基因的选择目的基因包括那些编码其自身为天然药物(例如药物或兽医产物)的蛋白质的基因。异源核酸尤其可以编码细菌、真菌、植物或动物起源的基因。产生的多肽可以用于产生能够纯化后用于别处的多肽。这类蛋白质包括，但是不限于成视网膜细胞瘤蛋白、p53、制管张素和苗条蛋白。同样，也可以使用本发明的方法产生哺乳动物调节蛋白。其它目的序列包括蛋白质、激素(例如促卵泡激素)、生长因子、细胞因子、血清清蛋白、血红蛋白、胶原蛋白、奇甜蛋白、奇甜蛋白样蛋白质、表皮生长因子例如VEGF、异源二聚体、抗体、免疫球蛋白、融合抗体和单链抗体。靶基因的表达一般而言，可以通过本领域使用的任何适当的方法表达异源核酸，或者可以将其如下进行转录或表达(i)“裸”DNA的表达，所述“裸”DNA例如含有与本发明的构建体中的异源序列可操作地连接的启动子，(ii)表达载体(例如复制载体)的表达。一般而言，本领域技术人员完全可以为重组基因表达构建载体并设计方案。可以选择或构建含有合适的调节序列(包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因及其它合适的序列)的合适载体。更多细节见例如MolecularCloningaLaboratoryManual第二版，Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress或CurrentProtocolsinMolecularBiology第二版，Ausubel等编，JohnWiley&Sons，1992。如上文所讨论的，本发明显示，优选以高水平引入优选高细胞密度的藓类原生质体(例如小立碗藓)的本发明的构建体增加的表达产生了转录的mRNA，所述构建体整合入基因组中。因此本发明的一方面是能够产生mRNA的转化的藓类原生质体的公开用途，所述mRNA编码由引入的本发明的核酸构建体转录产生的靶蛋白质，其中核酸构建体被引入生物细胞内，包含与启动子可操作地连接的靶核酸序列。“引入的核酸”因此将包括作为DNA序列以本发明的构建体形式提供的异源核酸序列，其中相对于通常与稳定转基因表达该DNA序列正常有关的蛋白质生产水平，所述异源核酸序列能引起以升高的水平表达细胞外蛋白质。在本发明的一个方面，异源核酸序列可以编码由信号和/或转运肽组成的蛋白质，所述信号和/或转运肽与所选蛋白质或多肽序列偶联。报道分子可以是任何可检测的蛋白质，例如标记基因，常用于本领域的例如GUS、GFP、萤光素酶等。报道分子优选为非侵入性标记，例如GFP或萤光素酶。本领域技术人员自然会认识到在本发明的该或每个构建体中可以使用一个以上异源核酸序列，尽管在每种情况下优选单个序列。可以通过如此所述的PEG介导的DNA摄取方法将多个载体(每个含有一个或多个编码所选异源蛋白质的核苷酸序列)引入藓类原生质体。这对于生产例如酶的例如多个亚基是有用的。在本发明的另一个实施方案中，通过影响整合到基因组中的不同编码核酸序列的化学计量，可以得到高水平的由多亚基组成的完全且正确组装的蛋白质。正确组装的由多亚基组成的蛋白质的量在蛋白质水平取决于亚基的化学计量。对于必须通过信号肽靶向不同区室(例如靶向分泌途径)的亚基的情况，化学计量不仅受来自例如启动子和转录信号的表达的影响，而且受靶向信号及靶向信号的处理(例如信号肽的正确切割)的影响。在本发明的该方面，使用非等摩尔量的编码不同亚基的核酸序列，可能适合于多聚体蛋白质(例如免疫球蛋白)。因此可以通过提供经过适当设计、使不同亚基能够正确组装的本发明的构建体得到编码核酸的非等摩尔量，从而导致产生二聚体或多聚体蛋白质的多个亚基的合适化学计量。如下面的实施例中所述，以此方式引入时，使用本发明的方法表达异源序列，可以在整个表达期间产生非常高水平的靶多肽，根据采用的精确的方法和材料，所述表达期通常为数日。通过使用如此所述的本发明的方法，可以实现从稳定整合的本发明的构建体高水平产生异源多肽，所述构建体来自再生转化、优选共转化的原丝体。由于可能需要其补充本公开内容，所以在此讨论的所有参考文献都全文引用作为参考。现在将关于下列非限制性附图和实施例对本发明进行进一步进行描述。对于本领域技术人员而言，本发明的其它实施方案将根据这些而出现。实施例方法和材料植物材料使用小立碗藓(Hedw.)B.S.G.(Reski等人，1994)野生型株。这是由H.L.K.Whitehouse在GransdenWood，Huntingdonshire英国收集、由Engel繁殖的16/14株的传代培养物(1968)。载体的构建pRT101VEGFC3的构建将不含前导序列的人类血管内皮生长因子121(VEGF121)cDNA作为NdeI-SalI片段从pCYTEXP-VEGF121(GBF，Braunschweig，德国)切除。通过克列诺反应将该片段平端化，并于SmaI限制位点引入pRT101(Tpfer等人，1987)以形成质粒pRT101VEGFC3。在所述构建体中，将VEGF121cDNA的负前导序列置于CaMV35S启动子下游及CaMV终止子之后(Gorr，1999)。pRT101TPVEGFC3的构建将VEGF信号肽序列(用于分泌的分选信号)克隆到pRT101VEGFC3中。使用含有XhoI限制位点的5′引物MoB323(5′-ATACTCGAGGAAGATGAACTTTTCTGCCTGTCTTGG-3′，SEQIDNO1)和含有NcoI限制位点的3′引物MoB349(5′-CTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCAC-3′，SEQIDNO2)从质粒pRT101P21(Gorr，1999)扩增信号肽cDNA。将扩增的DNA用XhoI和NcoI消化并连接到pRT101VEGFC3(经过XhoI/NcoI消化的)中产生pRT1o1TPVEGFC3。产生的质粒含有在框内处于CaMV35S启动子控制下的VEGF信号肽和VEGF121的编码序列。将5′第一个重组序列克隆到pRT99中的程序使用上游引物Rec1_SalI_SacII(5′-GAGGTCGACCCGCGGAAATGTTCAGAG-3′，SEQIDNO4)和下游引物Rec1_SmaI(5′-CTCCCCGGGTCCAGTGTTTCACTC-3′，SEQIDNO5)，通过Pfu校正PCR(Promega，德国)从小立碗藓基因组DNA扩增小立碗藓α1，3-岩藻糖基转移酶基因第五个内含子的250bp的5′序列(5′-GCGGAAATGTTCAGAGTTAAGCGAAATCACAACTAAAAGAGATTGGAAGCAGAAGAATTTTTGAGCAGCTGTTCTTAATTCACGCAACGACAACGCTATTAACTGTATGTGTAGACGATGCACTTTCGTACTGAAGGGATCTAAATTTATTATATCCCTTCATAACTAGAGGCAAGGCGGAAATCACAAAACTATTGGTACCTACGTACTACAGCCTCCAGGATCAAACATAAGAGTGAAACACTGGACC-3′，SEQIDNO3)。将得到的扩增产物用SalI和SmaI限制酶切后，将其克隆到载体pRT99(Tpfer等人，1988)(经过SalI和SmaI消化的)中。得到的质粒pRT99Rec1含有5′第一个重组序列。将3′第二个重组序列克隆到pRT99Rec1中的程序使用上游引物Rec11_SmaaI(5′-GAGCCCGGGACCCAAGCGTAAGAAG-3′，SEQIDNO7)和下游引物Rec11_SacII_SsTII(5′-TCTGAGCTCCCGCGGACAATCATTTGTGTTTC-3′，SEQIDNO8)，通过Pfu校正PCR(Promega，德国)从小立碗藓基因组DNA扩增小立碗藓α1，3-岩藻糖基转移酶基因第五个内含子的208bp的3′序列(5′-GGGACCCAAGCGTAAGAAGTCTTATGAAAAAGTTACCTCACAGATTAAAACTAAACATAGGAAAATACCAATGCACTCCAATGTGTCAATGAGATTAACGCTTGACTAACATGAAAATATAAATATTCACCGAATGAAAGAAATTAGAAAACAGGACCTGTAGATTGTAAGAGATAGATTCTTGAGTTAGAAACACAAATGATTGTCC-3′，SEQIDNO6)。将得到的扩增产物用SmaI和SstI限制酶切后，将其克隆到载体pRT99Rec1(经过SmaI和SstI消化的)中。得到的质粒pRT99Rec11含有5′第一个和3′第二个重组序列。pRT99TPVEGFRec1的构建将含有CaMV35S启动子、TPVEGF121和CaMV35S终止子的表达盒作为PstI片段从pRT101TPVEGFC3切除。通过克列诺反应将该片段平端化并引入到经过SmaI消化并去磷酸化的质粒pRT99Rec11中产生质粒pRT99TPVEGFRec1。将5′第二个量组序列克隆到pRT99中的程序使用上游引物Rec2_SalI_SacII(5′-GAGGTCGACCCGCGGACCCAAGCGTAAGAAG-3′，SEQIDNO9)和下游引物Rec2_SmaI(5′-TCTCCCGGGACAATCATTTGTGTTTC-3′，SEQIDNO10)，通过Pfu校正PCR(Promega，德国)从小立碗藓基因组DNA扩增小立碗藓α1，3-岩藻糖基转移酶基因第五个内含子的208bp的3′序列(5′-GGGACCCAAGCGTAAGAAGTCTTATGAAAAAGTTACCTCACAGATTAAAACTAAACATAGGAAAATACCAATGCACTCCAATGTGTCAATGAGATTAACGCTTGACTAACATGAAAATATAAATATTCACCGAATGAAAGAAATTAGAAAACAGGACCTGTAGATTGTAAGAGATAGATTCTTGAGTTAGAAACACAAATGATTGTCC-3′，SEQIDNO6)。将得到的扩增产物用SalI和SmaI限制酶切后，将其克隆到载体pRT99(Tpfer等人，1988)(经过SalI和SmaI消化的)中。得到的质粒pRT99Rec2含有5′第二个重组序列。将3′第一个重组序列克隆到pRT99Rec2中的程序使用上游引物Rec22_SmaI(5′-GAGCCCGGGAAATGTTCAGAGTTAAGCG-3′，SEQIDNO11)和下游引物Rec22_SacII_SstI(5′-TCTGAGCTCCCGCGGTCCAGTGTTTCACTCTTATG-3′，SEQIDNO12)，通过Pfu校正PCR(Promega，德国)从小立碗藓基因组DNA扩增小立碗藓α1，3-岩藻糖基转移酶基因第5个内含子的250bp的5′序列(5′-GCGGAAATGTTCAGAGTTAAGCGAAATCACAACTAAAAGAGATTGGAAGCAGAAGAATTTTTGAGCAGCTGTTCTTAATTCACGCAACGACAACGCTATTAACTGTATGTGTAGACGATGCACTTTCGTACTGAAGGGATCTAAATTTATTATATCCCTTCATAACTAGAGGCAAGGCGGAAATCACAAAACTATTGGTACCTACGTACTACAGCCTCCAGGATCAAACATAAGAGTGAAACACTGGACC-3′，SEQIDNO3)。将得到的扩增产物用SmaI和SstI限制酶切后，将其克隆到载体pRT99Rec2(经过SmaI及SstI消化)中。得到的质粒pRT99Rec22含有5′第二个和3′第一个重组序列。pRT99TPVEGFRec2的构建将含有CaMV35S启动子、TPVEGF121和CaMV35S终止子的表达盒作为PstI片段从pRT101TPVEGFC3切除。通过克列诺反应将该片段平端化，并引入到经过SmaI消化并去磷酸化的质粒pRT99Rec22产生质粒pRT99TPVEGFRec2。用SacII或SalI和SstI限制酶切pRT99TPVEGFRec1和Rec2引起含有重组序列以及目的异源核酸序列的第一个和第二个异源核酸序列的线性化，其中目的异源核酸序列含有与其可操作地连接的启动子。使用线性化的异源核酸序列转化藓类细胞。标准培养条件将植物在简单无机液体改良Knop培养基(plaininorganicliquidmodifiedKnopmedium)(1000mg/lCa(NO3)2×4H2O250mg/lKCl，250mg/lKH2PO4，250mg/lMgSO4×7H2O及12.5mg/lFeSO4×7H2O；pH5.8(Reski和Abel1985))中于无菌条件下纯性培养。使植物在含有200ml培养基的500ml锥形瓶中生长，并在设定为120rpm的CertomatR摇床(B.BraunBiotechInternational，德国)上振荡烧瓶。生长室中的条件为25+/-3℃以及168小时的光照黑暗方案。由两个提供35μmols-1m-2的荧光管(OsramL58W/25)从上方照射烧瓶。通过使用Ultra-Turrax匀浆器(IKA，Staufen，德国)解体、并接种到两个新的含有100ml新鲜Knop培养基的500ml锥形瓶中，将培养物每周传代培养一次。原生质体的分离为了最佳原生质体分离的藓类组织预培养。可以在不同条件下预培养藓类(尤其是小立碗藓)以获得最佳原生质体产量I.Rother等人在Ca(NO3)2含量降低(10％)的Knop培养基中将藓类组织培养7天。解体后3或4天过滤培养物并转移到Ca(NO3)2含量降低(10％)的新鲜Knop培养基中。II.可以用5mM的酒石酸铵补充预培养培养基或者改变pH至4.5(在未控制pH值的液体培养物中，改良的Knop培养基可以达到平均pH5.8)来替代降低Ca(NO3)2。组织解体后3或4天过滤培养物并转移到新鲜改良Knop培养基中(补充5mM酒石酸铵或改变到pH4.5)。III.Hohe和Reski(2002)最优化了半连续生物反应器中的培养条件以获得高产量的原生质体。通过用460mg/l酒石酸铵补充改良的Knop培养基(Reski和Abel1985)或在调定点4.5的受控pH值下(在未控制pH值的生物反应器培养物中，改良的Knop培养基可以达到平均pH5.8)，获得高产量的分离的原生质体。对于小立碗藓已描述了分离原生质体(Grimsley等人，1977；Schaefer等人，1991；Rother等人，1994；Zeidler等人，1999；Hohe和Reski，2002，ProtocolSchaefer2001)和转化(Schaefer等人，1991；Reutter和Reski1996，ProtocolSchaefer2001)的不同方案。对于在此介绍的工作，使用前述方法的修改/组合过滤后将藓类原丝体在0.5M甘露糖醇中预温育。30分钟后，向悬浮液中加入4％的崩溃酶(Sigma，Deisenhofen，德国)。崩溃酶溶解于0.5M甘露糖醇(pH5.6-5.8)中，于3600rpm离心10分钟，并通过穿过0.22μm滤器(MillexGP，MilliporeCorporation，美国)灭菌。将含有1％崩溃酶(终浓度)的悬浮液于室温(RT)在暗中温育并温和搅拌(温育2小时后得到原生质体的最佳产量)(ProtocolSchaefer2001)。将该悬浮液通过孔径100μm和50μm的筛(Wilson，CLF，德国)。将悬浮液在无菌离心管中离心并于室温以55g(加速度3；于3减速；Multifuge3S-R，Kendro，德国)沉淀原生质体10分钟(ProtocolSchaefer2001)。将原生质体温和地重悬于W5培养基(125mMCaCl2×2H2O；137mMNaCl；5.5mM葡萄糖；10mMKCl；pH5.6；660-680mOsm；过滤灭菌的)中。将该悬浮液于室温以55g(加速度3；于3减速；Multifuge3S-R，Kendro，德国)再次离心10分钟。将原生质体温和地重悬于W5培养基中(Rother等人，1994)。将小体积的悬浮液转移到Fuchs-Rosenthal-chamber中用于计数原生质体。转化方案将原生质体于冰上在黑暗中温育30分钟用于转化。随后，于室温以55g(加速度3；于3减速；Multifuge3S-R，Kendro)离心10分钟以沉淀原生质体。将原生质体以1.2×106个原生质体/ml的浓度重悬于3M培养基(15mMCaCl2×2H2O；0.1％MES；0.48M甘露糖醇；pH5.6；540mOsm；经过过滤灭菌的，Schaefer等人，1991)中(Reutter和Reski1996)。将250μl该原生质体悬浮液分配到新的无菌离心管中，加入50μl两种构建体pRT99TPVEGFRec1和pRT99VEGFRec2及含有选择标记的载体的DNA溶液(溶于H2O中的经过柱纯化的DNA(Qiagen，Hilden，德国)；10-100μl；每构建体含有30μg的DNA量；10μg含有选择标记的载体)，最后加入250μlPEG溶液(40％PEG4000；0.4M甘露糖醇；0.1MCa(NO3)2；高压灭菌后pH6)。立刻温和混合该悬浮液，然后于室温温育6分钟，间或温和混合。通过添加1、2、3和4ml3M培养基逐步稀释该悬浮液。将该悬浮液于20℃以55g(加速度3；于3减速；Multifuge3S-R，Kendro)离心10分钟。于3ml再生培养基中重悬沉淀。如Strepp等人(1998)所述实施选择程序。DNA分析按照Strepp等人(1998)所述实施稳定转化的植物的DNA分析。通过DNA印迹分析以及与含有一个拷贝该异源DNA的稳定转化的植物比较，实施拷贝数的估计。测定重组VEGF121的定量通过ELISA(R&DSystems，Wiesbaden，德国)定量由稳定转化的藓类植物表达的重组VEGF121。根据厂商说明书执行ELISA。可将样品稀释以用于定量。结果对于稳定转化的植物，整合的构建体的高拷贝数的估计与重组蛋白质的高产量相关。参考文献EngelPP(1968)TheinductionofbiochemicalandmorphologicalmutantsinthemossPhyscomitrellapatens.AmJBot55，438-446.GorrG(1999)BiotechnologischeNutzungvonPhyscomitrellapatens(Hedw.)B.S.G..Dissertation，UniversittHamburg.GrimsleyNH，AshtonNWandCoveDJ(1977)Theproductionofsomatichybridsbyprotoplastfusioninthemoss，Physcomitrellapatens.MolGenGenet154，97-100.HoheA，ReskiR(2002)OptimisationofabioreactorcultureofthemossPhyscomitrellapatensformassproductionofprotoplasts.PlantSci163，69-74.ReskiR，AbelWO(1985)Inductionofbuddingonchloronemataandcaulonemataofthemoss，Physcomitrellapatens，usingisopentenyladenine.Planta165，354-358.ReskiR，FaustM，WangX-H，WeheM，AbelWO(1994)GenomeanalysisofthemossPhyscomitrellapatens(Hedw.)B.S.G..MolGenGenet244，352-359.RotherS，HadelerB，OrsiniJM，AbelWOandReskiR(1994)Fateofamutantmacrochloroplastinsomatichybrids.JPlantPhysiol143，72-77.ReutterKandReskiR(1996)Productionofaheterologousproteininbioreactorculturesoffullydifferentiatedmossplants.PlantTissueCultureandBiotechnology2，142-147.SchaeferD，ZrydJ-P，KnightCDandCoveDJ(1991)StabletransformationofthemossPhyscomitrellapatens.MolGenGenet226，418-424.SchaeferDG(2001)PrinciplesandprotocolsforthemossPhyscomitrellapatens.http//www.unil.ch/lpc/docs/PPprotocols2001.pdfStreppR，Scholz，S，Kruse，S，SpethVandReski，R(1998)PlantnucleargeneknockoutrevealsaroleinplastiddivisionforthehomologueofthebacterialcelldivisionproteinFtsZ，anancestraltubulin.ProcNatlAcadSciUSA95，4368-4373.TpferR，MatzeitV，GronenbornB，SchellJandSteinbissH-H(1987)Asetofplantexpressionvectorsfortranscriptionalandtranslationalfusions.NAR15，5890.Tpfer，R，Schell，JandSteinbiss，H-H(1988)Versatilecloningvectorsfortransientgeneexpressionanddirectgenetransferinplantcells.NAR16，8725.序列表<110>greenovationBiotechGmbH<120>包含重组序列基序的构建体在增强藓类中基因表达中的应用<130>1061<140>03017343.9<141>2003-07-31<160>12<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物MoB323<400>1atactcgaggaagatgaacttttctgcctgtcttgg36<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物MoB349<400>2ctgccatgggtgcagcctgggaccac26<210>3<211>250<212>DNA<213>小立碗藓(Physcomitrellapatens)<220><221>内含子<222>(1)..(250)<223>α1，3-岩藻糖基转移酶基因第5个内含子的5’序列<400>3gcggaaatgttcagagttaagcgaaatcacaactaaaagagattggaagcagaagaattt60ttgagcagctgttcttaattcacgcaacgacaacgctattaactgtatgtgtagacgatg120cactttcgtactgaagggatctaaatttattatatcccttcataactagaggcaaggcgg180aaatcacaaaactattggtacctacgtactacagcctccaggatcaaacataagagtgaa240acactggacc250<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述上游引物Rec1_SalI_SacII<400>4gaggtcgacccgcggaaatgttcagag27<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述下游引物Rec1_SmaI<400>5ctccccgggtccagtgtttcactc24<210>6<211>208<212>DNA<213>小立碗藓(Physcomitrellapatens)<220><221>内含子<222>(1)..(208)<223>α1，3-岩藻糖基转移酶基因的3’序列<400>6gggacccaagcgtaagaagtcttatgaaaaagttacctcacagattaaaactaaacatag60gaaaataccaatgcactccaatgtgtcaatgagattaacgcttgactaacatgaaaatat120aaatattcaccgaatgaaagaaattagaaaacaggacctgtagattgtaagagatagatt180cttgagttagaaacacaaatgattgtcc208<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述上游引物Rec11_SmaI<400>7gagcccgggacccaagcgtaagaag25<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述下游引物Rec11_SacII_SsTII<400>8tctgagctcccgcggacaatcatttgtgtttc32<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述上游引物Rec2_SalI_SacII<400>9gaggtcgacccgcggacccaagcgtaagaag31<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述下游引物Rec2_SmaI<400>10tctcccgggacaatcatttgtgtttc26<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述上游引物Rec22_SmaI<400>11gagcccgggaaatgttcagagttaagcg28<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述下游引物Rec22_SacII_SstI<400>12tctgagctcccgcggtccagtgtttcactcttatg3权利要求1.在藓类植物细胞中扩增基因表达的方法，其包括1)提供至少第一个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述构建体在其5′末端以第一个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第一个相同方向的第二个重组序列为侧翼；2)提供至少第二个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述构建体在其5′末端以所述第二个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第二个相同方向的所述第一个重组序列为侧翼；和3)将至少所述第一个和所述第二个异源核酸构建体转化到藓类植物细胞中。2.根据权利要求1的方法，其中将所述至少第一个构建体和所述至少第二个构建体共转化到藓类原生质体中。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述第一个构建体和所述第二个构建体含有至少一套互补重组序列。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组序列衍生自或选自基因组DNA、cDNA、内含子、非编码区或外显子或其任何组合。5.根据权利要求4的方法，其中所述重组序列选自内含子或非编码区。6.根据权利要求4或权利要求5的方法，其中所述重组序列的长度为25至1000个核苷酸。7.根据权利要求6的方法，其中所述重组序列的长度为50-650个核苷酸。8.根据权利要求7的方法，其中所述重组序列的长度为100-400个核苷酸。9.本发明的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第一个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；和3)引入的第二个重组序列。10.本发明的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第二个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；和3)引入的第一个重组序列。11.根据权利要求9和权利要求10的DNA构建体，其中步骤1)和步骤3)的重组序列分别彼此互补并朝向相同的方向。12.根据权利要求9至11中任一项的DNA构建体，其中所述构建体为线性DNA构建体。13.藓类细胞，所述藓类细胞由至少两个根据权利要求9至12中任一项的互补DNA构建体转化。14.根据权利要求13的藓类细胞，所述藓类细胞是藓类原生质体或藓类原丝体细胞。15.根据权利要求14的藓类细胞，所述藓类细胞来自小立碗藓。16.藓类原丝体组织，所述藓类原丝体组织包含由至少两个根据权利要求9至12中任一项的构建体转化的细胞。17.藓类原丝体细胞在从其生产蛋白质中的用途，所述藓类原丝体细胞由根据权利要求9至12中任一项的DNA构建体转化。18.根据权利要求17的来自或选自小立碗藓的藓类原丝体细胞的用途，所述藓类原丝体细胞由至少两个携带至少一套互补重组序列的DNA构建体转化。全文摘要本发明涉及通过利用构建体提高藓类中基因表达的方法，所述构建体包含由重组序列嵌入的异源序列。文档编号C12N15/82GK1860234SQ200480028294公开日2006年11月8日申请日期2004年7月29日优先权日2003年7月31日发明者G·戈尔申请人:格林诺瓦森生物技术股份有限公司