专利名称：鉴别基因功能的方法和组合物的制作方法
本申请要求提交于2003年9月30日的美国临时申请号60/507,437的优先权，该申请在此引入作为用于任何目的的参考。
1.0领域提供了产生和表征细胞中的插入突变的方法。还提供了稳定结合插入突变的细胞。
2.0背景许多人类治疗(有某些例外，包括，例如，直接靶向病原体的抗体)直接或间接地与基因组序列信息的有限集所编码的产物或元件相互作用。因此，科学考查转向对那些可能提出清楚的医疗介入途径的编码序列信息部分进行鉴别。许多治疗性产物通过调节生理起作用。在成千上万种生物化学和构建体相关的人类基因组编码产物中，科学团体仅清楚鉴别了这些产物中一部分的生理功能。出于多种原因，在某些情况下，小鼠成为代理表征(characterizing-by-proxy)人类生物序列生理意义的模式生物。作为一种哺乳动物，小鼠拥有许多人类的主要器官系统并经常利用直向同源产物(orthologous products)调节这些器官系统的功能。此外，在某些情况下，小鼠还允许其自身基因组的基因工程操作。
在某些情况下，小鼠胚胎干细胞(ES)技术提供了染色体工程的方法并，因此，提供了假定基因组(genomic hypotheses)的直接检测。
3.0概述在某些实施方案中，提供了产生一组单独表征的被插入突变的哺乳动物细胞克隆的方法。在某些实施方案中，该方法包括用逆转录基因诱捕构建体感染哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括选择稳定结合所述逆转录基因诱捕构建体的整合前病毒形式的哺乳动物细胞克隆。在某些实施方案中，该方法进一步包括体外鉴别所述逆转录基因诱捕构建体的整合前病毒形式附近的基因组DNA区域。
在某些实施方案中，用逆转录病毒基因诱捕构建体以小于5的感染复数(M.O.I)感染哺乳动物细胞。在某些实施方案中，感染复数小于1。在某些实施方案中，感染复数小于0.5。
在某些实施方案中，鉴别包含反向聚合酶链式反应(IPCR)。在某些实施方案中，反向聚合酶链式反应包含至少一种选自Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth的聚合酶。在某些实施方案中，通过测序来鉴别所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合前病毒形式附近的基因组DNA的至少50个碱基。在某些实施方案中，鉴别不涉及逆转录酶反应。
在某些实施方案中，选择了至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆的集群。在某些实施方案中，选择了至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆的集群，其包含至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆，每个克隆都在不同的基因中含有所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式。
在某些实施方案中，提供了一组单独表征的被插入突变的哺乳动物细胞克隆。
4.0附图简述
图1显示了反向聚合酶链式反应(IPCR)的示意图。
图2显示了VICTR48的示意图。“LTR”是逆转录病毒的长末端重复。“SA”是剪接受体位点。“NEO”是新霉素抗性基因。“PA”是多腺苷酸化位点。“SV40tpA”是SV40的三重多腺苷酸化序列。“PGK”是PGK启动子。“BTK”和“SD”是小鼠BTK基因第一外显子和剪接供体位点。剪接供体之后是BTK基因第一内含子的一部分。标出了限制性位点。限制性位点名称后面的星号(*)表示其是在构建体上的独特位点。
图3显示了来自数个被基因诱捕的ES细胞克隆的IPCR分析的示例产物，如实施例6.2所讨论。
图4显示了莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(LTR)的序列，缺少至少一部分的增强子区(SEQ ID NO5)。
图5显示了被修饰的LTR，其缺少至少一部分的增强子区还缺少LTR内的隐蔽剪接供体(SEQ ID NO6)。
图6A-C显示了VICTR 48的序列(SEQ ID NO7)。
5.0详细说明本文所用的本节标题仅用于组织目的而不能被解释为限制所述对象的内容。本申请引用的所有参考在此特别引入作为用于任何目的的参考。
在本申请中，除非特别声明，单数的使用包含了复数。在本申请中，除非特别声明，“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包含”，还有其它形式，如“包括”，的使用，不具限制意义。在多个实施方案中，可以用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养、转化和转染。在多个实施方案中，可依据制造商说明书或依据本领域内的常规成熟技术或依据本文所述技术进行酶促反应和纯化技术。在多个实施方案中，通常可以按照本领域内已知的常规方法，也可以按照本说明书各处引用和讨论的各种一般性的和较具体的参考文献所述，和/或按照本领域内技术人员所知的方法实施技术和程序。见，例如，Sambrook等.Molecular CloningALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989).
在某些实施方案中，提供了在哺乳动物生物学意义上鉴别遗传编码的生物序列(包括，但不限于，蛋白质、多肽、氨基酸序列，多核苷酸和核苷酸序列)的生理作用的方法。在某些实施方案中，提供了培养和处理真核细胞的方法以产生具有确定的基因组插入/突变的遗传改造的真核细胞克隆。本方法所用的真核细胞，在多个实施方案中，包括但不限于昆虫细胞(包括但不限于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞)，线虫(C.elegans)细胞，啮齿类动物细胞(包括但不限于小鼠细胞、大鼠细胞和仓鼠细胞)，鸡细胞，灵长类细胞，(包括但不限于猴细胞和人细胞)。在某些实施方案中，用非特异性插入突变对细胞进行遗传改造。在某些实施方案中，提供了培养和处理小鼠ES细胞的方法以产生具有确定的基因组插入/突变的遗传改造的ES细胞克隆。
在某些实施案方中，方法不包括某些昂贵的和/或费时的处理步骤。在某些实施方案中，方法可以适用于突变的真核细胞，包括但不限于，突变的小鼠ES细胞的工业化生产。
某些实施方案涉及培养、产生和鉴别突变的真核细胞，包括但不限于小鼠ES细胞的方法。在某些实施方案中，突变的真核细胞可以被用于产生能进行插入的突变等位基因的种系传递的生物。在某些实施方案中，突变的小鼠ES细胞被用于产生能进行插入的突变等位基因的种系传递的小鼠。
在某些实施方案中，基因诱捕是使用DNA作为诱变剂的随机插入诱变方法。在某些实施方案中，DNA最初被作为逆转录病毒引入，其在细胞内被逆转录以生成起诱变剂作用的DNA前病毒。在某些实施方案中，DNA的一部分编码可选择标记。在某些实施方案中，基因诱捕构建体整合入一个基因的内含子或外显子中。在某些实施方案中，基因诱捕构建体被设计为优选整合入内含子和/或外显子中。在多个实施方案中，整合入内含子或外显子后，细胞的剪接器将构建体编码序列剪接成一个或多个共转录在相同mRNA上的内源序列。在某些实施方案中，基因诱捕构建体包含编码可选择标记的序列。在某些实施方案中，剪接受体序列处于编码可选择标记的序列之前。在某些实施方案中，启动子不处于编码可选择标记的序列之前。在某些实施方案中，细胞的剪接器将内源序列从被诱捕的基因剪接到编码可选择标记的序列的5’端。在某些实施方案中，可选择标记只在编码可选择标记的基因诱捕构建体整合入内含子时才被表达。在某些实施方案中，可选择标记只在编码可选择标记的基因诱捕构建体整合入外显子时才被表达。在某些实施方案中，例如，当可选择标记基因编码抗生素抗性时，可以在培养物中选择以表达可选择标记的方式将基因诱捕构建体整合到它们基因组内的细胞。
示范性的真核细胞插入突变述于，例如，Friedrich和Soriano，1991，Genes Dev.5(9)1513-23；Friedrich和Soriano，1993，Methods Enzymol.1993；225681-701；PCT
发明者G·汉森, A·阿武因, B·赞布罗维奇, C·J·弗里德勒, W·P·登普西 申请人:莱克康遗传公司