专利名称：柯萨奇病毒b组1型基因疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防柯萨奇病毒感染的疫苗。
背景技术：
传统用于预防柯萨奇病毒B(CVB)感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗在其灭活过程中出现抗原性减弱及重要表位丢失，使机体不能产生足够的保护性免疫。减毒活疫苗接种后常常引起免疫抑制，减毒不充分可致临床病毒感染，且活病毒疫苗有回复突变产生致病表型的可能，而过分减毒又造成疫苗效价的降低，削弱其激发机体免疫的能力。新型CVB疫苗有亚单位疫苗和合成肽疫苗。亚单位疫苗安全、无毒、副作用小，但免疫原性差。近年来把病毒的亚单位成分通过DNA重组技术加以表达的疫苗，称为基因工程重组亚单位疫苗。基因工程疫苗已被应用于临床。该疫苗的制备包括基因的分子克隆、表达和蛋白纯化过程，其研制费用较高，技术难度较大且成功率低。常因诱发对载体自身的免疫反应而不能重复使用；活重组疫苗亦有回复突变、造成免疫低下、宿主患病甚至死亡的潜在危险。合成肽疫苗是根据需要有目的地方设计具有中和或保护性抗原的短肽作为疫苗。但由于合成肽是一种直链结构，缺乏天然的三维空间结构，功能不同于天然蛋白。另外合成的短肽分子很小，免疫原性较差。因此人们迫切希望找到新的安全有效的疫苗。90年代人们开展了针对CVB特异性免疫防治的研究工作，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及合成肽疫苗，通过动物实验接种，显示了一定的免疫保护作用。但由于CVB有6个血清型，核酸具有感染性，因此研制灭活疫苗、减毒活疫苗及亚单位疫苗十分困难。上述疫苗本身又有一定的缺陷，故一直未有CVB的疫苗上市，人们迫切希望找到一种安全有效的新疫苗。近几年发展起来的基因免疫(genetic immunization)技术为CVB疫苗的研制开辟了一条新途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一种柯萨奇病毒B组1型基因疫苗，即防治柯萨奇病毒B组1型心肌炎的基因疫苗。本发明的柯萨奇B1病毒(CVB1)基因疫苗是由CVB1编码主要中和抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4-CVB1VP1质粒。其主要优点为免疫应答完整、持久，同种异株交叉保护，联合免疫，制备简便，安全稳定，可重复使用。
基因免疫通过直接给动物接种抗原蛋白编码基因使动物获得对该抗原的免疫力，这种编码抗原蛋白的外源基因既是载体又是抗原的来源，并具有疫苗的功能，因此被称为基因疫苗或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。基因疫苗的出现为CVB感染的防治开辟了新的途径。基因疫苗又称核酸疫苗或DNA疫苗，由病原体抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒组成。抗原编码基因的表达产物必须是病原体的有效成分，才可引发保护性免疫。与传统疫苗相比，本发明的基因疫苗有下列优点(1)直接DNA接种，避免了传统疫苗抗原制备纯化等繁琐过程；(2)免疫应答完整持久，基因免疫时抗原多肽的递呈和自然感染时相似，以天然构象被免疫系统识别，克服了其它疫苗抗原表位改变的缺点；(3)基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一质粒嵌合多种目的基因，形成联合免疫；(4)基因疫苗制备简便，成本低，安全稳定，便于贮存和运输。
图1为pMD18-T质粒结构图谱；图2为pCEP4质粒结构图谱；图3为真核表达重组质粒pCEP4-VP1的构建图；图4为CVB1VP1基因逆转录PCR电泳结果图，其中AΦX174/Hae III，BCVB1VP1(0.83kb)；图5为pMD18-T-VP1的酶切鉴定结果图，其中ALamdaDNA/Ecor I+HindIII，BΦX174/Hae III，CpMD18-T-VP1/EcoRI，DpMD18-T-VP1/XbaI，EpMD18-T-VP1/XbaI+Kpn I；图6为PCR扩增鉴定pMD18-T-VP1，ALamda DNA/Ecor I+Hind III，BAmplification of CVB1VP1；图7为pMD18-T-VP1测序图谱；图8为pCEP4-VP1质粒PCR及酶切鉴定结果图，其中ALamda DNA/Ecor I+Hind III，BAmplification of VP1 from pCEP4-VP1，CpCEP4-VP1/Nhe I，DpCEP4-VP1/Nhe I+BamH I；图9为pCEP4-VP1测序图谱；图10为pCEP4-VP1转染HeLa细胞后免疫荧光检测结果图；图11为pCEP4转染HeLa细胞后免疫荧光检测结果图；图12为Western blot检测分析pCEP4-VP1在HeLa细胞的表达结果图，其中ApCEP4转染HeLa细胞，BpCEP4-VP1转染HeLa细胞；图13为小鼠免疫后CTL反应的检测结果图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式的CVB1基因疫苗是由CVB1编码主要中和抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4-CVB 1VP1质粒，CVB1VP1的基因序列参见基因序列表。
具体实施方式
二本实施方式对CVB1基因疫苗进行详细介绍。
一、材料1.1病毒、细胞CVB1病毒株、Vero细胞、HeLa细胞和P815细胞由中国预防医学科学院病毒所诊断二室提供，CVB1在Vero细胞传代，Vero细胞和HeLa细胞在含10％胎牛血清的Eagle′s MEM传代培养，P815细胞在RPMI1640培养基培养。
1.2载体、菌株实验采用的载体包括pMD18-T、pCEP4，pMD18-T和pCEP4的宿主菌株为JM109。pMD18-T为TaKaRa生物技术公司产品，大小为2.7kb，是一个高效TA克隆载体，适合PCR产物克隆，该载体含有LacZ基因，多克隆位点处于该基因中间，因此可以通过蓝白选择来初步筛选重组子。另外pMD18-T在多克隆位点两端具有M13forward Primer和M13reverse primer，便于对克隆片段进行测序(见图1)。pCEP4为Invitrogen公司产品，大小10.4kb，是真核表达载体，所含的CMV启动子是重组真核表达载体中最强的启动子，可高效表达外源基因。该质粒图谱见图2。
1.3引物、酶和试剂扩增CVB1VP1的引物是应用Oligo5.0软件自行设计的两段寡核苷酸，序列为Upperprimer5’-AGA TGC CAG TGG AAG AAT CG-3′，Lower primer5’-CGT CTA GAT TGT GGT AAT GTT TGA G-3′。上、下游引物的碱基组成分别为A＝7、G＝7、C＝3、T＝3和A＝5、G＝8、C＝2、T＝10，上游引物5’端加了一个起使密码子ATG，下游引物5’端加了一个Xba I位点，以备克隆和鉴定之用，终止密码子U(T)AG包含在XhaI识别位点的序列中。实验中使用的AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA分子量标准λ/EcoR I+Hind III、ΦX174/Hae III及蛋白分子量标准为Promega公司和TaKaRa公司产品。RNA提取试剂TRIzol Reagent为GIBCO/BRL公司产品。DNA片段凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction kit为QIAGEN公司产品。质粒大量提纯试剂为QIAGEN公司的QIAGEN PlasmidMaxi Kit。DNA转染试剂CLONfectin为CLONTECH公司产品。羊抗鼠IgG荧光标记抗体和羊抗鼠IgG酶标抗体购自QIAGEN公司。CVB1 IgM、IgG的ELISA检测试剂购自瀛天名生物技术公司。
1.4动物实验用动物为纯系BALB/C小鼠，实验时鼠龄为6～7W，重量18士2g，雌雄各半。
二、方法2.1CVB1 RNA的提取将TCID50为10-8的CVB1病毒接种Vero细胞，37℃培养，待病变为+++～++++时收获。将细胞反复冻融三次，取0.3ml置于1.5ml微量离心管中，加入1mlTPIzol Reagent，混匀，15～30℃放置5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15sec，室温放置3min。4℃℃12,000xg离心15min。取上层水相，加入0.5ml异丙醇，15～30℃10min。4℃12,000xg离心15min，去上清，加入1m175％乙醇清洗沉淀，4℃7,500xg离心5min，干燥沉淀，加ddH2O20μl重悬沉淀，-70℃保存。
2.2CVBIVPI的逆转录和PCR扩增2.2.1CVBlVPl逆转录取0.5ml微量离心管加入10×AMV RT buffer2μl、10mM dNTP 2μl、rRNasin 1μl、AMV逆转录酶1μl、50pM下游引物0.5μl、RNA模板10μl，无RNAase的去离子水3.5μl。42℃作用60min进行cDNA第一链合成，产物部分用于PCR，其余-20℃保存。
2.2.2CVBIVPl的PCR扩增取0.2ml微量离心管加入CVB1 RNA逆转录产物5μl、10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液5μl、25mMMgCl26μl、10mM dNTP3μl、20pM上游引物1μl、20pM下游引物1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、ddH2O28.5μl。94℃预处理5min，然后进行PCR循环(BIOMETRA PCR扩增仪)94℃30sec、55℃45sec、72℃1min，共30个循环，最后一次延伸时间延长8min。取5μl扩增产物上1％琼脂糖凝胶电泳，照相。其余-20C保存。
2.3pMD18-T-VP1的构建与鉴定2.3.1分离纯化VP1基因的PCR产物将PCR扩增产物40μl加至1％琼脂糖凝胶中，5V/cm电泳40min。纯化方法按照QIAquick Gel Extraction kit说明书进行在UV照射下将0.83kb片段用清洁刀片切下，称重，加入3倍体积的Buffer QG，50℃温育10min至凝胶完全融化，将QIAquick柱放在配套的2ml收集管上，将融化的凝胶加入柱内.10,000xg离心1min，加0.75mlBuffer PE至柱内，10,000xg离心1min。弃去残液，将柱放在套管上再离心1min，弃去残液，将柱放于1.5ml离心管上，加50μl ddH2O于柱中心，静置lmin，10,000xg离心1min，管内即为回收的PCR产物。
2.3.2连接pMD18-T和CVB1VP1在0.2ml离心管中加入纯化的CVBl VPlPCR产物4μl、pMD18-T 1μl、Ligationsolution 5μl。设立对照DNA连接实验于0.2ml离心管中加入Control DNA 1μl、pMD18-T 1μl、Ligation solution 5μl、ddH2O 3μl。两管于16℃反应2h。
2.3.3感受态细菌的制备和转化用灭菌的接种针刮拭甘油冻存的JM109细菌，快速划于Amp-的LB琼脂平板上37℃培养过夜。挑单菌落接种于100ml新鲜的Amp-LB培养基，37℃振摇至OD600为0.5时将培养液置于冰上预冷10min，于4℃1,600xg离心10min。细胞沉淀用10ml冰预冷的CaCl2溶液重悬，于4℃1,100xg离心5min。细胞沉淀用10ml冰预冷的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min，于4℃1,100xg离心5min。用2ml冰预冷的CaCl2溶液重悬细胞，分装冻存。取5μl连接产物加至100μl感受态JM109，冰浴30min，42℃50sec，冰浴2min，加入400μl LB培养基，37℃振摇45min。涂100μl IPTG(100μlM)和20μlX-gal(50mg/ml)于含氯苄青霉素(100μl/ml)的LB琼脂平板，37℃吸附30min。将菌液接种至平板，37℃培养18h～24h。转化实验同时设JM109感受态菌和线状pMD18-T转化对照。
2.3.4目的菌落的筛选从转化菌平板中任选20个白菌落，接种于5ml Amp-的LB培养基中，37℃振摇培养6h，取1ml菌粗提质粒，1％琼脂糖电泳检查重组子的大小，初步筛选符合大小的质粒。
2.3.5小量提取质粒取1.5ml经初步筛选认为含重组质粒的细菌菌液，4℃12000xg离心1min收集细胞，加入100μl冰浴预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH＝8.0、10mM EDTA，pH＝8.0、50mM葡萄糖)重悬细胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)，颠倒数次，再加150μl冰预冷的溶液III(5mol/l KAc60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，颠倒混匀，冰浴5min。4℃12000xg5min，将上清移至另一个微量离心管，加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置10min。4℃12000xg离心，去上清，75％乙醇洗涤三次，干燥后加50μl含20μg/μl RNase A的ddH2O重悬DNA。取10μl上样测定波长260nm和280nm时的吸光度，获得纯度和浓度。
2.3.6酶切鉴定在3个0.5ml离心管中各加入5μl提取的质粒，用XbaI、EcoRI、XbaI+KpnI消化4h，若质粒可被XbaI酶切成为3.5kb一个片段，被EcoR I酶切成为2.7kb和0.8kb两个片段，被XbaI+KpnI酶切成为3.1kb和0.4kb两个片段则可初步认为VP1基因是反向插入pMD 18-T。如果被XbaI酶切后成为2.7kb和0.8kb两个片段，被EcoR I酶切成为3.4kb和0.1kb两个片段则可初步认为CVB1VP1基因插入方向为正向。
2.3.7PCR鉴定取0.2ml微量离心管加入下述成份小量质粒提取物0.5μl、10×Tap DNA聚合酶反应缓冲液5μl、25mM MgCl26μl、10mMdNTP3μl、20pM上游引物1μl、20pM下游引物1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、ddH2O 33μl。PCR反应条件同“2.2CVB1VP1的逆转录和PCR扩增”。
2.3.8测序将酶切和PCR初步验证为CVB1 VP1反向插入的重组质粒pMD18-T-VP1小量精提，使其A260/A280值介于1.8至1.9间，测序由两端进行，测序仪为ABI PRISM 377XL DNA Sequencer。测序引物为通用引物M13forward primer和M13reverseprimer。测序号为LHB1446。
2.4pCEP4-VP1的构建与鉴定2.4.1连接取2μg pMD18-T-VP1和2μg pCEP4分别同时用BamH I和HindIII两个酶切消化，体系如下2μg PMD18-T-VP1/2μg pCEP4，5μl TaKaRa内切酶缓冲液K，20U BamH I，20U Hind III，加ddH2O至50μl，37℃过夜。将酶切产物上1％琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel Extraction kit回收酶切后0.83kb的pMD18-T-VP1/BamH I+Hind III和10.4kb的pCEP4/BanmH I+Hind III。取pMD18-T-VP1/BamH I+Hind III3μl和pCEP4/BamH I+Hind III2μl加至0.2ml微量离心管中，加入10xT4连接酶反应缓冲液1μl、T4DNA连接酶1.5U、ddH2O2.5μl。4℃反应16h。
2.4.2转化将连接产物取5μl加至100μl感受态JM109，冰浴30min，42℃50sec，冰浴2min，加入400μlLB培养基，37℃振摇45min，接种至含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养18h～24h。转化实验同时设pCEP4未切质粒转化、pCEP4/BamHI+HindIII转化和JM109感受态菌对照。
2.4.3筛选挑选菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养6h，取1ml菌粗提质粒，1％琼脂糖电泳检查重组子大小，选择可能的菌落提纯质粒。
2.4.5鉴定分别取5μl提取的质粒，用Nhe I、Nhe I+BamH I酶切，判断重组子大小及目的基因插入的正确性。取0.5μl质粒，按“2.3pMD18-T-VP1的构建与鉴定”中的方法和条件进行PCR，检测目的基因插入与否。精提初步验证正确的质粒，使其A260/A280值介于1.8至1.9间，测序号为TaKaRaLHB 1772。由于pCEP4本身没有测序可用的通用引物，因此用软件Oligo5.0分析并自行设计一对测序引物。引物序列为F5-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3’和R5’-GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC-3’。
2.5CVB1VP1基因在HeLa细胞的表达2.5.1大量提纯制备pCEP4-CVP1和pCEP4QIAGEN Plasmid Maxi Kit大量提取纯化pCEP4-vPI和pCEP4。挑含有目的质粒的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养8h。将上述培养液1/500稀释，接种于100ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养12～16h。收获菌液于4℃6,000xg离心15min。用10ml Buffer P1(50mM Tris-HCl，pH＝8.0、10mMEDTA、100μg/ml RNase A)重悬细胞。加入10ml Buffer P2(0.2N NaOH、1％SDS)，轻柔而充分地颠倒混匀4～6次，室温放置5min。加10ml冰预冷的Buffer P3(3.0mol/lKAc 60ml，pH＝5.5)，轻柔而充分地颠倒混匀4～6次，冰浴20min。于4℃20,000xg离心30min，取上清，于4℃20,000xg再离心15min。将上清加入到被Buffer QBT(750mMNaCl、50mM MOPS，pH＝7.0、15％Isopronanol、0.15％Triton X-100)平衡好的QIAGEN-tip500柱内，在重力作用下上清液进入到树脂内。用30mlBuffer Qc(1.OM NaCl、50mM MOPS，pH＝7.0、15％Isopropanol)洗柱两次。用15mlBuffer QF(1.25M NaCl、50mM Tris-Cl，pH＝8.5、15％lsopropanol)洗脱DNA。加10.5ml室温异丙醇至洗脱的DNA中，混匀于4℃15,000xg离心30min，小心去除上清。用5ml70％乙醇洗沉淀，于4℃15,000xg离心10min，小心去除上清。干操沉淀，以0.5ml pH＝8.0的TE溶解DNA，保存于-20C，用于侧序、细胞转染或动物接种。
2.5.2pCEP4-VP1和pCEP4转染HeLa细胞在六孔培养板培养HeLa细胞。在转染前一天将每孔加1-4×105细胞，5％CO237℃培养过夜18h～24h，待细胞长至60％～90％成层时进行转染。温育Hepes Buffer Saline(HBS，20mMHepes、150mMNaCl，pH＝7.4)至45-55℃，用HBS稀释Clonfection至终浓度为1μg/μl，立即混匀置于冰上。将pCEP4和pCEP4-VP1各取3μg分别加100μl无血清培养基，取3μg Clonfectin分别溶于两管100μl无血清培养基，将质粒加到Clonfectin管中，混合，室温放置20min，使DNA/Clonfectin复合物形成。两管内各加1.8ml无血清培养基。除去待转染细胞的培养液，加入2ml含DNA/Clonfectin复合物的培养基，轻微晃动细胞板使DNA/Clonfectin复合物均匀混在细胞上。5％CO237℃培养4h。去除含转染液的培养液，加入1×PBS 1ml洗一次。加2ml新鲜的含10％胎牛血清(FCS)的Eagle’s MEM，5％CO237℃培养细胞48h。
2.5.3免疫荧光检测用冷丙酮固定玻片上的细胞，包括pCEP4转染的HeLa细胞、pCEP4-VP1转染的HeLa细胞、未转染质粒的HeLa细胞对照。固定30min，干燥。用0.05M PBS(pH＝7.2)1∶5稀释的含CVB1-IgG血清0.05ml滴加至细胞上，37℃30min，水洗10min。加经0.05M PBS 1∶5稀释的0.05ml羊抗小鼠IgG荧光标记抗体，37℃作用30min，水洗10min，PBS洗5min。凉干。荧光显微镜下观察。
2.5.4Western blot检侧收获转染后的HeLa细胞，4℃12,000oxg离心1min，弃去上清。将适量沉淀重悬于5μl水中，加入5μl 2xSDS凝胶上样缓冲液(50imM Tris-HCl，pH＝6.8、100mMDTT、2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油)，混匀于100℃加热10min。各样品取20μl加样于12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。一份用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色。另一份将SDS聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白泳带转移至硝酸纤维素膜(Bio Rad)上，200mA转移1小时。以0.2％的丽春红染色确定蛋白己转到膜上，并根据蛋白标准(Sigma中分子量蛋白标准)用圆珠笔标记目的条带的位置。用TTBS(TBS/0.4％Tween-20)洗涤二次，加5％脱脂奶室温封闭2小时。TTBS洗三次，加入抗CVB 1抗体于室温摇动孵育3小时。TTBS洗三次，加入酶标抗小鼠1gG抗体，于室温摇动孵育2小时。TTBS洗三次，加入显色液(30mg二氨基联苯胺，2.5ml Tris-HCl，pH＝7.4，加水定容至50ml，使用前加30μl 30％H2O2)至出现清晰的条带为止，弃去显色液，用水洗膜二次。
2.6动物接种将鼠龄为6～7W、18±2g、雌雄各半的BALB/C小鼠随机分成pCEP4-VP1接种组、pCEP4接种组、灭活的CVB1病毒接种组和生理盐水对照组，每组10只动物。将纯度为1.85(A260/A280)的DNA样品用水稀释至1mg/ml，每毫升DNA样品加入30.8μl5M NaCl使NaCl终浓度为0.9％。每只鼠腹腔注射盐酸路氯胺酮2mg，待数分钟后小鼠四肢松弛开始接种。对pCEP4-VP1接种组和pCEP4接种组小鼠，于双侧大腿内侧股四头肌处各注射0.1mlDNA样品。正常对照组在股四头肌处接种等量的生理盐水。CVB1病毒接种组小鼠用56℃30min灭活的CVB1病毒(10-8TCID50)腹腔接种，每只0.2ml。四周后进行第二次接种，作为加强免疫，接种量和接种方法同前。第一次接种前、第一次接种后一周、加强免疫前、加强免疫后三周断尾采血，分离血清，-70℃保存用于IgM、lgG检测。
2.7体液免疫检测2.7.1CVB1-IgM ELIsA试验将2滴标本稀释液滴到包被孔中(阴阳对照孔不加)。将被检血清用生理盐水20倍稀释，取10μl稀释后血清加至包被孔，混匀，设立阴、阳性对照孔，37℃作用40min。洗涤液洗3次，甩干。加入1∶50稀释的酶标抗体0.1ml，37℃作用20min。洗涤液洗5次，甩干。加入底物A和底物B各0.05ml。室温放置显色。待阳性对照显兰色后加入终止液，观察被检孔结果，然后用酶标仪于波长45Onm处测定OD值，与空白对照孔校正。计算P/N值，P/N＝被检血清OD值/阴性对照孔OD值，P/N≥2.1时为阳性，P/N＜2.1为阴性。
2.7.2CVB1-IgGELISA试验将包被板条用洗涤液洗三次，甩干，将被检标本用标本稀释液1∶100稀释后每孔加100μl，阴阳性对照液100μl各加一孔。混匀，37℃作用40min。洗涤液洗3次，甩干。加入1∶50稀释的酶标抗体0.1ml，37℃作用20min。洗涤液洗三次，甩干。加入底物A和底物B各0.05ml。室温放置显色。待阳性对照显蓝色后加入终止液，观察结果。用酶标仪于波长450nm处测定OD值，与空白对照孔校正。计算P/N值，P/N＝被检血清OD值/阴性对照孔OD值，P≥2.1时为阳性，P/N＜2.1为阴性。
2.8细胞免疫检测效应毒性T淋巴细施(CTL)反应的检侧效应细胞的制备第二次加强免疫后三周处死小鼠，于无菌条件下取脾，常规分离脾细胞。简言之，在200目不锈钢网筛上研碎鼠脾，将脾细胞置于无血清的RPMI 1640培养液中，收集至试管中，2,000xg离心10min，弃去上清。加5ml0.83％NH4Cl低渗液破坏红细胞，离心去上清，加5ml含10％胎牛血清的RPMI 1640重悬后吸至细胞培养瓶内，37℃贴壁1.5小时，去除贴壁细胞。小心吸取上清过无菌尼龙毛柱，分离得到T细胞。将T细胞重悬于T细胞培养基(TCM，含RPMI 1640，2mM谷胺酰胺，1％青霉素，1％链霉素，20mM HEPES，5×10-5M β-疏基乙醇)。用TCM调T细胞数为1×107/ml。取1ml加入加孔培养板，每孔加0.3ml灭活的CVB1(10-8TCID50)病毒再刺激。于37℃5％CO2培养5天制备效应细胞。
靶细胞的制备用10moi CVB1病毒感染P815细胞过夜，无血清RPMI 1640洗三次，加入100μCiNa251CrO4，于37℃5％CO2培养1.5小时，再用无血清RPMI1640洗三次，调节细胞浓度至1×105/ml，作为靶细胞。将效应细胞和靶细胞分别以100∶1、50∶1、25∶1共同37℃5％CO2培养6小时，同时做自然释放和最大释放对照。离心后吸取上清100μl，装入小塑料管，于γ计数仪读取CPM值。
按以下公式计算杀伤率 三、结果3.1CVB1 VP1的逆转录和PCR扩增取10μl RT-PCR扩增产物上样至1％琼脂糖凝胶，5V/cm，电泳45min。结果见图4。在0.83kb处可见条明亮的核酸区带，与理论预期值教。在泳道中无其他非特异阔增区带可见。
3.2pMD18-T-VP1的构建与鉴定3.2.1连接与转化CVB 1VP1片段与pMD18-T连接产物转化JM109后获得约100个菌落，其中蓝菌落约40个，白菌落约60个。Control DNA和pMD18-T连接产物转化JM109后获得约120个菌落，其中蓝菌落约40个，白菌落约80个，表明感受态细菌的效率和连接条件的控制较好。JM109菌平板和线状pMD18-T转化平板均无细菌生长，说明pMD18-T-VP1转化子带有重组质粒。
3.2.2筛选菌落与酶切从转化菌平板中任选20个白菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，培养后粗提质粒，进行1％琼脂糖电泳筛选，发现重组质粒大小均在3.5kb左右。提纯其中第4号菌落质粒，用EcoRI、XbaI、Xba I+Kpn I消化发现该质粒可被EcoR I酶切成为2.7kb和0.8kb两个片段，被Xba I酶切成为3.5kb一个片段，被Xba I+Kpn I酶切成为3.1kb和0.4kb两个片段，初步说明VP1基因是反向插入pMD18-T，见图5。
3.2.3PCR以4号菌落提取的质粒为模板，按照上述方法进行PCR，pMD18-T-VP1可扩增出一条明亮的0.83kb片段，结果正确，见图6。
3.2.4测序将4号菌落提纯的质粒进行测序。测序报告显示，每个反应至少可以清晰地读出550个以上的碱基峰值(近600个)，说明小量提纯获得的pMD18-T-VP1在纯度上能满足测序的要求。从两端测序，中间有约250个碱基重叠。将所测序列(下排)与Genbank中lizuka，N报告的序列(上排)比较如下；AGATGCCAGTGGAAGAATCG和CTCAAACATTACCACAATCTAGACG是CVB1 VP1扩增所用的上下游引物。CVB1 VP1基因共834bp，编码278个氮基酸。从上面的序列比较看出本实验所用CVB1 VP1基因与lizuka所报道序列存在4处碱基差异，分别为第239bp(A→T，lizuka在前，以下同〕、272bp(T→C)、373bp(G→C)和417bp(A→C)，均影响到氨基酸的编码，分别为第80氨基酸(Asn→Thr)、第91氨基酸(Val→Ala)、第125氨基酸(Glu→Gln)和第139氨基酸(Gln→His)。另外有一段碱基序列位置差异，即301bp～318bp，lizuka的序列为CTGAGGAGGAAACTAGAG，编码的氨基酸序列为LRRKLE(LLeu、RArg、KLys、EGlu)；本实验序列为AGG AGG AAA CTA GAG CTG，编码的氨基酸序列为RRKLEL。为进一步验证该结果，又挑选一个VP1正向插入的3号菌落测序，结果其第272bp与lizuka的一致，其它序列均与4菌落一致。提示4号菌落第272bp可能是由于PCR扩增时错配或测序错读造成的，而本实脸用CVB1的VP1基因与lizuka所报道序列的其它差异是确实存在的。
3.3pCEP4-VP1的构建与鉴定3.3.1连接、转化、筛选pCEP4-VP1转化JM109经过夜培养后可见约100个菌落，而pCEP4未切质粒转化JM105平板长满菌落，pCEP4/BamH I+Hind III转化和JM109感受态菌对照均无菌落生长，说明转化结果良好。任意选择pCEP4-VP1转化菌落5个粗提质粒，电泳观察重组质粒大小约11kb，与理论预期值一致。进一步提纯质粒经酶切、PCR和测序鉴定。
3.3.2鉴定pCEP4-VP1被Nhe I酶切成为一条11.23kb的条带，被NheI+BamH I酶切成为一条10.4kb的条带和一条0.83kb的条带。实验结果与预期理论值一致。对该质粒进行PCR，可扩增出一条明显的0.83kb条带，结果正确，见图8。pCEP-VP1的测序亦由两端进行，结果如下。AGATGCCAGTGGAAGAATCG和CTCAAACTTACCACAATCTAGA是VP1的扩增引物。
是PMD18-T的一部分，其中第50bp的T即为与PCR产物连接的“T″。该结果VP1序列与来自4号菌落pMD18-T-VP1的序列完全一致，证明VP1被成功地连接到了pCEP4上。测序图谱见图9。
3.4CVB1VP1基因在HeLa细胞的表达3.4.1免疫荧光检测pCEP4-VP1、pCEP4转染HeLa细胞后经含CVB1IgG血清作用，再加荧光标记的第二抗体羊抗小鼠IgG作用后，于荧光显微镜下观察。可见pCEP4-VP1转染的HeLa细胞内有荧光标记，pCEP4转染的HeLa细胞、未转染质粒的细胞内无荧光标记(图10)。
3.4.2Western blot检测Western blo结果显示pCEP4-VP1转染的HeLa细胞电泳后转膜，可于泳道中的33KDa处检测到一条明显的条带，而pCEP4转染的HeLa细胞经电泳转膜后在33KD处无明显条带。结果见图11。
3.5体液免疫检测3.5.1CVB1-IgM ELISA试验实验结果见表1。第一次免疫前小鼠采血，检测不到IgM。第一次免疫后一周、第一次免疫后4周(即加强免疫前)、加强免疫后三周采血进行ELISA检测，从表1可以看出，第一次免疫后一周，pCEP4-VP1接种组与灭活CVB1接种组的P/N值均大于2.1，其A450值与生理盐水对照组比有显著差异(P＜0.01)。而pCEP4接种组P/N值小于2.1，其A450值与生理盐水对照组比无显著差异(P＞0.05)。结果说明pCEP4-VP1和灭活的CVB1接种小鼠可诱导小鼠产生抗CVB1的IgM，而单纯pCEP4质粒接种则不能产生该抗体。第一次免疫后4周、加强免疫后三周各组P/N值均小于2.1，各组A450值间无显著差异。各组A450值间差异用t检验，结果列于表1中。
表1ELISA检测小鼠免疫后CVB1IgM水平
*P＜0.01，与pCEP4对比；ΔP＜0.05，与pCEP4对比。
3.5.2CVB1-IgG ELISA试验第一次免疫前检测不到IgG。第一次免疫后一周、第一次免疫后4周(即加强免疫前)、加强免疫后三周采血进行ELISA检测，从表2可以看出，pCEP4-VP1接种组仅于加强免疫后三周可检测到IgG抗体，而灭活的CVB1接种组在加强免疫前和加强免疫后三周均可检测到IgG抗体，且其水平高于pCEP4-VP1接种组。pCEP4接种组在任何时间点均检测不到1gG。各组A450值间差异用t检验。结果列于表2中。
表2ELISA检测小鼠免疫后CVB1-IgG水平
*P＜0.01，与pCEP4对比；ΔP＜0.01，与pCEP4-VP1对比。
3.5细胞免疫检测特异性细胞毒性T淋巴细施(CTL)反应的检测从图12可见pCEP4-VP1接种小鼠可诱导较强的CTL反应，其杀伤率明显高于对照组。而pCEP4组、灭活CVB1组几乎无杀伤效应，说明pCEP4-VP1做为DNA疫苗可诱导特异性CTL反应。
序列表一、pCEP4-CVB1VP1的DNA序列TCTAGAGTCG ACCGGTCATG GCTGCGCCCC GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCCT 60GACGGGCTTG TCTGCTCCCG GCATCCGCTT ACAGACAAGC TGTGACCGTC TCCGGGAGCT 120GCATGTGTCA GAGGTTTTCA CCGTCATCAC CGAAACGCGC GAGGCAGCCG GATCATAATC 180AGCCATACCA CATTTGTAGA GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCCAC CTCCCCCTGA 240ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG 300GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA AGCATTTTTT TCACTGCATT 360CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATCA TGTCTGGATC CTCTAGAGAT 420TCBTCTAGAT TGTGGTAATG TTTGAGCGCG TTGTGGCGAC TCCTGTTGGG TTGAAATTAA 480CATTCTTTTG CTTCTCATAT TGACATAGCC TCGGCGGTCT GGGCACCCAC GCCTTCACAT 540GTTTGGGTTT AAAATATATT CTAACTGTAC TTTTGATCGG GCCTTGGCCT GCCTCATTTA 600CGTGCCGCAT GTACAGCGTA CCCATGTTGT TCAGGGTATT AATGCCGTAA ACCCCATTCC 660TAGAGAACTG TGTGCATCCA TCATAAAAGC AGCTATAAGC ATTTCCAATA CTGATGAAGG 720GAATAGACAT CCTCGGTGGG GCATTCCCCT CTGTCCAAAA GACGCTGGGG TTTGTGGATG 780TTTGCCAGGC GTAGTCTGTA ACCTTGGTAG GTACCGGCCC GCCTGGAGGC ACATACATTA 840TCTGGTGGGT TTGTACAGGT GCGTCTACAC TGGTAGCGGT ACTGGGCTGC TGGGCACTTG 900TTATCACAAA TGTCAATTCC AGATCGAACC TTAAGTAAGT GAACAGCTCT AGTTTCCTCC 960TCAACTGCGC AACCTGCCTG GTGTTGATAG CCCACTCTGC GTAGCCCTTC TCAGAATTAT1020TAGTGTAGGT GGCGTAATAC ACACAAGCAG ATCGGCACAA GAAATTTTCA ATGGAAGATT1080CCGACCTTGA GTGGTAATTC TTCACGTGTC TAGTTTGCAT GGTGTCACTG GGTACGACTT1140GAGAGGTATG ACCAGTCTCC GCAGCAGTGA GGGCGGGGAT GGATTCTGAA TTCGTAGGCT1200TTGAGCTGAC CGTATCAGCC ACGCGCACCA TGGCGCGTTC CACCGATTCT TCCACTGGCA1260TCTAATCGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGCTAGCAGC TGGTACCCAG CTTCTAGAGA1320TCTGACGGTT CACTAAACGA GCTCTGCTTA TATAGACCTC CCACCGTACA CGCCTACCGC1380CCATTTGCGT CAACGGGGCG GGGTTATTAC GACATTTTGG AAAGTCCCGT TGATTTTGGT1440GCCAAAACAA ACTCCCATTG ACGTCAATGG GGTGGAGACT TGGAAATCCC CGTGAGTCAA1500ACCGCTATCC ACGCCCATTG GTGTACTGCC AAAACCGCAT CACCATGGTA ATAGCCATGA1560CTAATACGTA GATGTACTGC CAAGTAGGAA AGTCCCGTAA GGTCATGTAC TGGGCATAAT1620GCCAGGCGGG CCATTTACCG TCATTGACGT CAATAGGGGG CGGACTTGGC ATATGATACA1680CTTGATGTAC TGCCAAGTGG GCAGTTTACC GTAAATACTC CACCCATTGA CGTCAATGGA1740AAGTCCCTAT TGGCGTTACT ATGGGAACAT ACGTCATTAT TGACGTCAAT GGGCGGGGGT1800CGTTGGGCGG TCAGCCAGGC GGGCCATTTA CCGTAAGTTA TGTAACGCGG AACTCCATAT1860ATGGGCTATG AACTAATGAC CCCGTAATTG ATTACTATTA ATAACTAGTC AATAATCAAT1920GTCAACATGG CGGTCATATT GGACATGAGC CAATATAAAT GTACATATTA TGATATAGAT1980ACAACGTATG CAATGGCCAA TAGCCAATAT TGATTTATGC TATATAACCA ATGACTAATA2040TGGCTAATTG CCAATATTTA TTCAATGTAT AGATCTTCCA TACCTACCAG TTCTGCGCCT2100GCAGCAATGC AACAACGTTG CCCGGATCTG CGATGATAAG CTGTCAAACA TGAGAATTGG2160TCGACTAGCT TGGCACGCCA GAAATCCGCG CGGTGGTTTT TGGGGGTCGG GGGTGTTTGG2220
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1GGCCCAGTGG AAGAATCGGT GGAACGCGCC ATGGTGCGCG TGGCTGATAC1ATGCCAGTGG AAGAATCGGT GGAACGCGCC ATGGTGCGCG TGGCTGATAC51 GGTCAGCTCA AAGCCTACGA ATTCAGAATC CATCCCCGCC CTCACTGCTG51 GGTCAGCTCA AAGCCTACGA ATTCAGAATC CATCCCCGCC CTCACTGCTG101 CGGAGACTGG TCATACCTCT CAAGTCGTAC CCAGTGACAC CATGCAAACT101 CGGAGACTGG TCATACCTCT CAAGTCGTAC CCAGTGACAC CATGCAAACT151 AGACACGTGA AGAATTACCA CTCAAGGTCG GAATCTTCCA TTGAAAATTT151 AGACACGTGA AGAATTACCA CTCAAGGTCG GAATCTTCCA TTGAAAATTT201 CTTGTGCCGA TCTGCTTGTG TGTATTACGC CACCTACA T AATAATTCTG201 CTTGTGCCGA TCTGCTTGTG TGTATTACGC CACCTACA T AATAATTCTG251 AGAAGGGCTA CGCAGAGTGG GTTATCAACA CCAGGCAGGT TGCGCAGTTG251 AGAAGGGCTA CGCAGAGTGG GCTATCAACA CCAGGCAGGT TGCGCAGTTG301 CTGAGGAGGA AACTAGAGTT CACTTACTTA AGGTTCGATC TGGAATTGAC301 AGGAGGAAAC TAGAGCTGTT CACTTACTTA AGGTTCGATC TGGAATTGAC351 ATTTGTGATA ACAAGTGCCC AG AGCCCAG TACOGCTACC AGTGTAGACG351 ATTTGTGATA ACAAGTGCCC AG AGCCCAG TACCGCTACC AGTGTAGACG401 CACCTGTACA AACCCAACAG ATAATGTATG TGCCTCCAGG CGGGCCGGTA401 CACCTGTACA AACCCA CAG ATAATGTATG TGCCTCCAGG CGGGCCGGTA451 CCTACCAAGG TTACAGACTA CGCCTGGCAA ACATCCACAA ACCCCAGCGT451 CCTACCAAGG TTACAGACTA CGCCTGGCAA ACATCCACAA ACCCCAGCGT501 CTTTTGGACA GAGGGGAATG CCCCACCGAG GATGTCTATT CCCTTCATCA501 CTTTTGGACA GAGGGGAATG CCCCACCGAG GATGTCTATT CCCTTCATCA551 GTATTGGAAA TGCTTATAGC TGCTTTTATG ATGGATGGAC ACAGTTCTCT551 GTATTGGAAA TGCTTATAGC TGCTTTTATG ATGGATGGAC ACAGTTCTCT601 AGGAATGGGG TTTACGGCAT TAATACCCTG AACAACATGG GTACGCTGTA601 AGGAATGGGG TTTACGGCAT TAATACCCTG AACAACATGG GTACGCTGTA651 CATGCGGCAC GTAAATGAGG CAGGCCAAGG CCCGATCAAA AGTACAGTTA651 CATGCGGCAC GTAAATGAGG CAGGCCAAGG CCCGATCAAA AGTACAGTTA701 GAATATATTT TAAACCCAAA CATGTGAAGG CGTGGGTGCC CAGACCGCCG701 GAATATATTT TAAACGCAAA CATGTGAAGG CGTGGGTGCC CAGACCGCOG751 AGGCTATGTC AATATGAGAA GCAAAAGAAT GTTAATTTCA ACCCAACAGG75l AGGCTATGTC AATATGAGAA GCAAAAGAAT GTTAATTTCA ACCCAACAGG801 AGTCACCACA ACGCGCTCAA ACATTACCAC AACC801 AGTCACCACA ACGCGCTCAA ACATTACCAC AATCTAGACG AATCTCTAGAXba I Xba I85l GGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTCGTA ATCATGGTCA TAGCTBamH I Kpn I三、pCEP4-VP1的DNA序列
KpnINhe Himd III1AAGCTGGGTA CCAGCTGCTA GCAAGGTT 51 AGATGCCAGT GGAAGAATCG GTGGAACGCG CCATGGTGCG CGTGGCTGAT101 ACGGTCAGCT CAAAGCCTAC GAATTCAGAA TCCATCCCCG CCCTCACTGC151 TGCGGAGACT GGTCATACCT CTCAAGTCGT ACCCAGTGAC ACCATGCAAA201 CTAGACACGT GAAGAATTAC CACTCAAGGT CGGAATCTTC CATTGAAAAT251 TTCTTGTGCC GATCTGCTTG TGTGTATTAC GCCACCTACA CTAATAATTC301 TGAGAAGGGC TACGCAGAGT GGGCTATCAA CACCAGGCAG GTTGCGCAGT351 TGAGGAGGAA ACTAGAGCTG TTCACTTACT TAAGGTTCGA TCTGGAATTG401 ACATTTGTGA TAACAAGTGC CCAGCAGCCC AGTACCGCTA CCAGTGTAGA451 CGCACCTGTA CAAACCCACC AGATAATGTA TGTGCCTCCA GGCGGGCCGG501 TACCTACCAA GGTTACAGAC TACGCCTGGC AAACATCCAC AAACCCCAGC551 GTCTTTTGGA CAGAGGGGAA TGCCCCACCG AGGATGTCTA TTCCCTTCAT601 CAGTATTGGA AATGCTTATA GCTGCTTTTA TGATGGATGG ACACAGTTCT651 CTAGGAATGG GGTTTACGGC ATTAATACCC TGAACAACAT GGGTACGCTG701 TACATGCGGC ACGTAAATGA GGCAGGCCAA GGCCCGATCA AAAGTACAGT751 TAGAATATAT TTTAAACCCA AACATGTGAA GGCGTGGGTG CCCAGACCGC801 CGAGGCTATG TCAATATGAG AAGCAAAAGA ATGTTAATTT CAACCCAACA851 GGAGTCGCCA CAACGCGCTC AAACATTACC ACAATCTAGA CGAATCTCTA901 GAGGATCCAG ACAT XbaI XbaIBamH I
权利要求
1.柯萨奇病毒B组1型基因疫苗，其特征在于它是由CVB1编码主要中和抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4-CVB1VP1质粒。
2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒B组1型基因疫苗，其特征在于pCEP4-CVB1VP1的DNA序列为TCTAGAGTCGACCGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCCGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCCACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCTCTAGAGATTCGTCTAGATTGTGGTAATGTTTGAGCGCGTTGTGGCGACTCCTGTTGGGTTGAAATTAACATTCTTTTGCTTCTCATATTGACATAGCCTCGGCGGTCTGGGCACCCACGCCTTCACATGTTTGGGTTTAAAATATATTCTAACTGTACTTTTGATCGGGCCTTGGCCTGCCTCATTTACGTGCCGCATGTACAGCGTACCCATGTTGTTCAGGGTATTAATGCCGTAAACCCCATTCCTAGAGAACTGTGTCCATCCATCATAAAAGCAGCTATAAGCATTTCCAATACTGATGAAGGGAATAGACATCCTCGGTGGGGCATTCCCCTCTGTCCAAAAGACGCTGGGGTTTGTGGATGTTTGCCAGGCGTAGTCTGTAACCTTGGTAGGTACCGGCCCGCCTGGAGGCACATACATTATCTGGTGGGTTTGTACAGGTGCGTCTACACTGGTAGCGGTACTGGGCTGCTGGGCACTTGTTATCACAAATGTCAATTCCAGATCGAACCTTAAGTAAGTGAACAGCTCTAGTTTCCTCCTCAACTGCGCAACCTGCCTGGTGTTGATAGCCCACTCTGCGTAGCCCTTCTCAGAATTATTAGTGTAGGTGGCGTAATACACACAAGCAGATCGGCACAAGAAATTTTCAATGGAAGATTCCGACCTTGAGTGGTAATTCTTCACGTGTCTAGTTTGCATGGTGTCACTGGGTACGACTTGAGAGGTATGACCAGTCTCCGCAGCAGTGAGGGCGGGGATGGATTCTGAATTCGTAGGCTTTGAGCTGACCGTATCAGCCACGCGCACCATGGCGCGTTCCACCGATTCTTCCACTGGCATCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCTAGCAGCTGGTACCCAGCTTCTAGAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAACGGGGCGGGGTTATTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGGTGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGGACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACATGGCGGTCATATTGGACATGAGCCAATATAAATGTACATATTATGATATAGATACAACGTATGCAATGGCCAATAGCCAATATTGATTTATGCTATATAACCAATGACTAATATGGCTAATTGCAACTATTGATTCAATGTATAGATCTTCCATACCTACCAGTTCTGCGCCTGCAGCAATGCAACAACGTTGCCCGGATCTGCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGTCGACTAGCTTGGCACGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCGCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCCCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGGATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA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全文摘要
柯萨奇病毒B组1型基因疫苗，它涉及一种预防柯萨奇病毒感染的疫苗。针对现有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，本发明提供一种CVB1病毒基因疫苗，它是一种由CVB1编码主要中和抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4－CVB1VP1质粒。与传统疫苗相比，本发明的基因疫苗有下列优点直接DNA接种，避免了传统疫苗抗原制备纯化等繁琐过程；免疫应答完整持久，基因免疫时抗原多肽的递呈和自然感染时相似，以天然构象被免疫系统识别，克服了其它疫苗抗原表位改变的缺点；基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一质粒嵌合多种目的基因，形成联合免疫；基因疫苗制备简便，成本低，安全稳定，便于贮存和运输。
文档编号C12N15/11GK1772305SQ20051001047
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月25日 优先权日2005年10月25日
发明者田野, 钟照华, 赵铁强, 王言, 肖建敏, 孟繁超 申请人:哈尔滨医科大学