专利名称：打结丝线在丝状真菌繁殖上的应用及丝状真菌的繁殖方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体地说涉及丝线在丝状真菌繁殖上的应用， 以及丝状真菌利用丝线的繁殖方法。
技术背景难降解有机污染物在被微生物分解时速度很慢且不彻底，在环境中的残留 时间长，造成环境污染严重。研究发现白腐真菌能降解多种难降解有机污染物， 因而成为治理难降解污染物的有效途径。但是至今尚未能实现白腐真菌反应器 在非灭菌条件下的持续运行，其主要原因在于不能长期维持反应器中白腐真菌 的生物量。维持白腐真菌的生物量主要有两种方法 一是菌丝的无限生长；二是白腐 真菌的繁殖。尽管丝状真菌可以通过菌丝的生长而无限延伸，但这需要提供最 适宜的培养条件，这在废水污染物的处理中难以实现，例如自然界中的白腐 真菌一般生长在陆生环境；不能排除污染物对白腐真菌的干扰等，这就使得白 腐真菌在反应器中的生命是有限的。因此，要长期维持反应器中白腐真菌的生 物量就唯有通过繁殖的方法实现。白腐真菌的繁殖方式有两种 一是孢子繁殖；二是菌丝繁殖。白腐真菌在 液体培养条件下现在只能获得其休眠的厚垣孢子。而菌丝的繁殖就相对简单， 只需将菌丝打断即可(菌丝具有全能性)。采用菌丝球打断繁殖的方式可以实现 反应器中白腐真菌的更新，且不用添加新的菌丝(Brochert，M等，Biotechnology and bioengineering, 2001， 75(3)，313-321.))。因此，可以采用阶段性打断菌丝进 行繁殖生长来维持反应器中白腐真菌生物量。但采用自由悬浮培养白腐真菌时， 白腐真菌的生物活性不如固定的白腐真菌培养，即固定的白腐真菌比非固定的 白腐真菌活性强(LiaoW.-L.等，Water sci. tech. 1997,35 (8), 255-164; Ohmomo S.等，Agric. Boil. Chem. 1985, 49(9 )，2551-1555 )。因而添加适宜的载体可以提 高白腐真菌的活性。与采用自由悬浮培养的菌丝球打断进行白腐真菌繁殖相比，利用载体促进
白腐真菌生长，并采用一定手段将载体上附着的菌丝周期性打断，再利用打断 的菌丝进行繁殖来维持反应器中白腐真菌生物量，更有利于白腐真菌反应器的 持续运行。因此利用载体繁殖的方法需要合适的载体。这种载体必须符合两个 条件在液体环境下，用于繁殖的打断菌丝能很好地附着其上进行生长；附着 生长在载体上的菌丝能被有效地打断下来用于繁殖。目前对一些载体进行了研究，如聚氨酯泡沫(PUF) (Midgo I.等，Water research,2002 ，36， 1896-1901 )、钢丝网(Kapdan IK等，Enzyme Microb Technol， 2002; 30:195 -9.)，木块(Nillsson I.等，Enzyme and microbial technology, 2006， 38， 94-100.)等，但木块和聚氨酯泡沫(PUF)等载体在水中不易下沉，漂浮在 液体表面，而打断菌丝比重大于水，在液体环境下极容易下沉，因而不利于打 断菌丝的附着，因此不能在实际中应用。另外，在对附着菌丝打断时，发现钢 丝网等材料容易变形而不适合用于菌丝的打断；因此利用这种方法维持反应器 中丝状真菌生物量的关键就在于寻找新的符合要求的载体。发明内容本发明目的之一是针对丝状真菌反应器因生物量降低不能持续运行的问 题，提供了一种丝线作为载体的用途，即利用丝线作为载体促进丝状真菌生长 的方法，来维持反应器中丝状真菌的生物量。本发明的另一目的是提供了利用丝线作为载体繁殖丝状真菌的方法。本发明打结丝线在丝状真菌繁殖上的应用。所述的丝状真菌可以是白腐真菌。上述白腐真菌可以是黄孢原毛平革菌、云芝(rramefes v^s/co/w); 毛栓 菌(rramefes/n'm/)或糙皮侧耳(P/ewrartw oWwa)等之一种。 上述打结丝线是由线结固定，结两端的细线散开。 所述的细线由天然植物的纤维丝组成。 所述的天然植物可以是棉、麻、亚麻等。 上述打结丝线可以打结棉线。所述的打结棉线，由棉线结所固定，结两端的细线散开。上述打结棉线，其中在结的每一边有长度为60 240mm的细线10 60根。上述打结棉线，其重量为0.48 Ug;比表面积平均为0.9 4m2/gm2/g。上述打结棉线的制备方法，按照如下步骤进行
取一截棉线对折，在对折棉线的一端开始打结，每打一个结，在离所打的结距离60 240mm处剪断，然后将结两端缠绕的棉线丝解开，让组成棉线的细 线相互不缠绕;将打结后的棉线放入锅中煮沸30 60分钟，用去离子水清洗l 3次，连续煮沸2 5次，去掉棉线上的杂质，将煮过的打结棉线烘干，得打结 棉线(见图1)。本发明一种利用打结丝线繁殖丝状真菌的方法，包括如下步骤(1) 接种培养按照打结丝线个数/培养液(毫升)之间1: 1 10的比例 将打结丝线加入培养液中，并在112 12rC温度下灭菌20 30分钟；再接种 104 108个丝状真菌孢子，然后置于25 39°C 、 120 160rpm的摇床上培养2 7天，将打结丝线取出，并用去离子水清洗，得附着菌丝的打结丝线；(2) 菌丝打断按照打结丝线(个)/培养液(毫升)之间l:2 7的比例 将步骤(1)所得打结丝线加入到培养液中，然后在转速为1100 1600rpm条 件下机械搅拌3 9分钟，然后过滤去掉打结丝线，得到打断的菌丝溶液；(3) 菌丝繁殖将步骤(2)的打断的菌丝溶液用培养液稀释1 5倍，然 后按照打结丝线(个)/培养液(毫升)之比在1:1 10向菌丝溶液中投入新的 打结丝线，再置于25 39。C、 120 160rpm的摇床上培养2 7天，可得繁殖 后在打结丝线上附着的丝状真菌(见图2)。上述方法中所述的丝状真菌可以是白腐真菌。上述方法中所述的培养液是指最适于培养所述菌株的培养基，根据菌株不 同可以不同。所述的白腐真菌可以是黄孢原毛平革菌、云芝(rra附efes vera/co/or); 毛 栓菌(7ha7wetes/n'raw)或糙皮侧耳(尸/ewra^s oWraaO等。以打结棉线为例.其作为载体具有如下特点此载体重量较轻，每个打结棉线载体重量为0.48 1.1 g，易于流化；比表面积大，约为0.9 4m2/g m2/g， 为菌丝的附着生长提供巨大的空间；在液体培养条件下，组成此载体的细线在 液体中伸展，其上附着的菌丝相互间干扰少；打结棉线载体由主要成分为纤维 素的棉线丝构成，在液体环境下棉线丝可在液体中伸展开来，具有柔性且能在 机械搅拌条件下不变形，利于附着菌丝的打断；另外，打结棉线载体在水中能 下沉，以及棉线丝在水中能伸展而利于打断菌丝的附着。另外，打结棉线载体 还具有以下特点打结棉线载体在浸没培养条件下，结两端的棉线丝在液体中能展开，利于WRF对营养物和氧气的获取(菌丝分散)，并能使附着的白腐真菌在反应体系中占较大的空间；吸水后此载体能下沉，可通过控制反应器中的水力条件达到较理想的流化状态。本发明优点和有益效果(1)本发明打结丝线载体为丝状真菌反应器的持 续运行提供了一个途径，从而使丝状真菌在难條解有机污染物的工业应用中成 为可能；(2)本发明打结丝线载体在水中能下沉，并且其细线丝在水中能伸展， 有利于菌丝的附着；(3)本发明打结丝线的细线丝可在液体中伸展开来，具有. 柔性且能在机械搅拌条件下不变形，利于附着菌丝的打断；(4)本发明方法丝 状真菌的繁殖和生长量大，可满足工业上的需要；(5)本发明方法简单、成本 低，易于推广应用。
图1为本发明打结棉线示意图。图2为附着菌丝和未附着菌丝的打结棉线对比示意图。 1为附着菌丝的打结棉线形态； 2为未附着菌丝的打结棉线形态。
具体实施方式
实施例1 (1)打结棉线的制作取一截棉线对折，在对折棉线的一端打一个结，其目的在于使载体在利用 的过程中保持一定形状；在离所打的结80mm处剪断；将结两端缠绕的棉线丝 解开，让组成棉线的细线相互不缠绕。将载体放入锅中煮沸30分钟，用去离子 水清洗3次，连续煮沸3次，去掉棉线上的杂质，将煮过的打结棉线烘干，得 打结棉线(见图1)。(2)将300ml的Bo皿arme培养基(Bonnarme培养基配方:葡萄糖lO g/L,酒 石酸氨0.8g/L， KH2P042g/L ， MgSO40.5g/L， CaCl20.1g/L，酵母浸粉0.2g/L， 20mmol/L醋酸:醋酸钠缓冲液(pH = 4.4)， 70ml微量元素(含MgS04 0.21 g/L ; MnS04 0.035 g/L， NaCl 0.070 g/L， FeS04 7H20 0.007 g/L， CoCl2 0.007 g/L， ZnS04 7H20 0.007 g/L， CuS04 0.007 g/L， A1K(S04)2 12H20 0.0007 g/L， H3B03 0.0007 g/L， Na2Mo04.2H20 0.0007 g/L， Nitrilotriacetate : 0.105 g/L);接 种前无菌过滤加入VB1溶液,使其浓度为O.OOl g/L)和用去离子水冲洗过的附着
生长有黄孢原毛平革菌的打结棉线载体60个加入到2升的烧杯中，然后在转速为: 1400rpm.的条件下机械搅拌6min。接着去掉载体，将所得的打断的菌丝溶液定 容到600ml，再分别取100ml菌丝溶液，加入到装有20个新的未附着菌丝的打结 棉线载体的三角瓶中，共有3瓶，最后将三角瓶放于37t:， 160rpm的摇床上进行 培养培养5天。对附着的生物量进行测定(测定方法将附菌的载体的重量减去 相应未附菌载体的重量所得的差为附着生长菌丝的生物量)。结果培养5天每个 载体的附着生长的生物量(干重)达0.0169g。说明该载体不仅能通过机械搅拌将 附着的白腐真菌菌丝打断下来，从打结棉线载体上打断下来的白腐真菌菌丝能 很好地附着在打结棉线载体上进行生长。 实施例2打结棉线载体促进丝状真菌繁殖生长的试验在100ml Bonnarme培养基中分别投加打结棉线载体O个、40个、60个、 80个，在12rC条件下，灭菌30分钟；然后接种黄孢原毛平革菌孢子，每毫升 接种104个孢子，然后置于37'C， 160rpm的摇床上培养5天；将生长菌丝的打 结棉线载体取出，接着用去离子水清洗，并在105t:下干燥，然后测其附着生 长的菌丝的生物量(测量方法将附菌的载体的重量减去相应未附菌载体的重 量所得的差为附着生长菌丝的生物量)。结果不投加载体培养的菌丝的平均生物 量为0.2899g，而投加载体40个、60个、80个的附着生长的菌丝生物量分别为 0.4947g、 0.5139g和0.5557g。说明打结棉线载体可以促进菌丝的生长，显著提 高了菌丝的生物量。实施例3打结棉线载体促进白腐真菌锰过氧化物酶的生成试验向100ml Bonnarme培养基中设不投加打结棉线和投加打结棉线载体80个两 种处理，在12rC条件下，灭菌30分钟；然后接种黄孢原毛平革菌孢子(每毫升 104个孢子)再在37。C， 160rpm的摇床上培养；从第2天开始每天对锰过氧化物酶进行检测(采用Paszczynski方法-Paszczynski A， Crawford R L， Huynh V B.Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium: purification. Methods in Enzymology， 1988，161(2):264-270.定义氧化lmmol/min Mn2+为Mn3+所需的酶量 为l个酶活力单位)；结果在不投加载体的培养中锰过氧化物酶在第4天开始出 现酶活，且最高酶活可达535U/L;而投加80个载体的培养中在第2天开始出现
酶活，最高酶活达到1197U/L。说明打结棉线载体不仅能促进白腐真菌提前生 产锰过氧化物酶，还能极大地提高锰过氧化物酶的生产量；也间接说明了打结 棉线载体对白腐真菌繁殖和生长的促进作用。
权利要求
1、打结丝线在丝状真菌繁殖上的应用。
2、 按照权利要求1所述的打结丝线，其特征在于由线结固定，结两端的细 线散开。
3、 按照权利要求1或2所述的打结丝线，其特征在于组成所述的打结丝线 的纤维来自棉、麻或亚麻。
4、 按照权利要求3所述的打结丝线，其特征在于是打结棉线。
5、 按照权利要求4所述的打结丝线，其特征在于所述的打结棉线由棉线结 所固定，结两端的细线散开。
6、 按照权利要求5所述的打结丝线，其特征在于所述的打结棉线在结的每 一边有长度为60 240mm的细线10 60根。
7、 按照权利要求6所述的打结丝线，其特征在于所述的丝状真菌是白腐 真菌。
8、 按照权利要求7所述的打结丝线，其特征在于所述的白腐真菌是黄孢原 毛平革菌、云芝(!Trametes ve/^7'co/or); 毛栓菌(Tra附efes 或糙皮侦!j耳(尸/ewra^s ostrea )等之~"禾中。
9、 利用权利要求1 8任一所述的打结丝线繁殖丝状真菌的方法，包括如 下步骤(1) 接种培养按照打结丝线个数/培养液(毫升)之间1: 1 10的比例将打结丝线加入培养液中，并在112 12rC温度下灭菌20 30分钟；再接种 104 108个丝状真菌孢子，然后置于25 39°C 、 120 160rpm的摇床上培养2 7天，然后打结棉线取出，并用去离子水清洗，得附着菌丝的打结丝线；(2) 菌丝打断按照打结丝线(个)/培养液(毫升)之间l:2 7的比例 将步骤(1)所得打结丝线加入到培养液中，然后在转速为1100 1600rpm条件 下机械搅拌3 9分钟，然后过滤去掉打结棉线，得到打断的菌丝溶液；(3) 菌丝繁殖将步骤(2)的打断的菌丝溶液用培养液稀释1 5倍，然 后按照打结丝线(个)/培养液(毫升)之比在1:1 10向菌丝溶液中投入新的 打结丝线，再置于25 39t:、 120 160rpm的摇床上培养2 7天，可得繁殖 后在打结丝线上附着的丝状真菌。
10、 按照权利要求9所述的方法，其特征在于所述的丝状真菌是白腐真菌。
全文摘要
本发明公开了打结丝线在丝状真菌繁殖上用途，以及利用打结丝线作为载体繁殖丝状真菌的方法。本发明主要是利用打结丝线在水中能下沉，并且其细线丝在水中能伸展，从而有利于菌丝的附着；同时打结丝线的细线丝可在液体中伸展开来，具有柔性且能在机械搅拌条件下不变形，有利于附着菌丝的打断的特点，以打结丝线作为载体，利用机械搅拌的方法将附着在打结丝线上的菌丝进行周期性的打断，进而繁殖丝状真菌的方法。本发明打结丝线材料易取，效果好。本发明方法丝状真菌的繁殖和生长量大，可满足工业上的需要；此外，本发明方法简单、成本低，易于推广应用。
文档编号C12N1/14GK101165164SQ200710175548
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日
发明者成 周, 文湘华 申请人:清华大学