专利名称：：变换和非变换的萤光素酶生物传感器的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物化学测定和试剂领域。更具体而言，本发明涉及经修饰的萤光素酶和关于其使用的方法。背景萤光素酶是催化底物(例如，萤光素)氧化的酶，伴随光的光子释放。萤光素酶已从众多物种包括鞘翅目节肢动物和许多海洋生物中分离。因为它是容易检测的，并且它的活性可以高精确度进行定量，所以萤光素酶已广泛用于研究基因表达和蛋白质定位。与需要最高达30分钟形成生色团的绿色荧光蛋白(GFP)不同，萤光素酶的产物可以在多肽链合成完成后立即进行检测(如果底物和氧也存在)。此外，不需要翻译后修饰用于酶活性，并且该酶不包含辅基、结合的辅因子或二硫键。萦光素酶是在许多物种和广泛多样的细胞中有用的报道物。外特征，即揭示系统的分子性质的分子。生物传感器(即，包含生物组分的传感器)一般借助于2步过程来起作用通过生物组分介导的信号产生，和通过电组分的信号传导和/或放大。信号产生一般通过结合、能量转移或催化来达到。由于这些化学过程的内在有效性和特异性，通过酶催化的信号产生可以是特别有用的。大多数催化反应产生少于用于ATP的两个分子的水解能量，或约70kJ/摩尔。然而，由萤光素酶引发的发光具有高得多的能含量。例如，由萤火虫萤光素酶(560nm)催化的反应发出214kJ/摩尔的能量。此外，萤光素酶在使化学能量转换成光子方面也是高度有效的，即它们具有高量子产率。萤光素14酶因此对于产生可检测的信号是非常有效的。萤光素酶生物传感器已得到描述。例如，Sala-Newby等人(1991)公开了北美萤火虫()萤光素酶cDNA进行修饰以产生环状AMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点。特别地，在第217位上的缬氨酸突变成精氨酸以产生位点RRFS(SEQIDNO:117),并且将七肽，即肯普肽(kemptide)，即猪丙酮酸激酶的磷酸化位点加入萤光素酶的N或C末端上。Sala-Newby等人阐述携带磷酸化位点的蛋白质就其比活性、pl、pH对发出的光的颜色的影响、和在ATP的存在下蛋白激酶A的催化亚基的效应进行表征。他们发现重组蛋白质中的唯——种(RRFS;SEQIDNO:117)显著不同于野生型萤光素酶，并且RRFS(SEQIDNO:117)突变体具有较低的比活性、较低的最适pH、在低pH下发出更绿的光，并且当磷酸化时，使其活性减少最高达80%。公开了后面的效应由磷酸酶逆转。Waud等人(1996)将蛋白激酶识别序列和蛋白酶位点工程化到北美萤火虫螢光素酶DNA内。营光素酶的两个结构域由Waud等人进行修饰；1个在氨基酸209和227之间并且另一个在C末端上，氨基酸537和550之间。Waud等人公开了残基209和227之间的氨基酸突变使生物发光活性减少至小于野生型重组体的1%,而在C末端上工程化肽序列导致野生型重组萤光素酶0.06%-120%的比活性。Waud等人还公开了给变体萤光素酶添加环状AMP依赖性蛋白激酶催化亚基，所述荧光素酶掺入激酶识别序列LRRASLG(SEQIDNO:1)，伴随在氨基酸位置543上的丝氨酸，导致减少30%的活性。碱性磷酸酶处理恢复活性。Waud等人进一步公开了具有位于氨基酸542和543之间的切割位点时，包含凝血酶识别序列LVPRES(SEQIDNO:2)的变体萤光素酶的生物发光活性，当在凝血酶的存在下进行温育时减少50%。Ozawa等人(2001)描述了基于合理设计的萤火虫萤光素酶片段的蛋白质剪接诱导互补的生物传感器。蛋白质剪接是通过其内含肽(内部蛋白质)从前体融合蛋白切开，将侧接外显肽(外部蛋白质)连接到邻接多肽内的翻译后蛋白质修饰。公开了来自集胞藻属物种(^"ec/zoc，tow.)PCC6803的N和C末端内含肽DnaE各自分别与萤光素酶的N和C末端片段融合。蛋白质-蛋白质相互作用触发DnaE内含肽的折叠，导致蛋白质剪接，且由此连接的萤光素酶的外显肽恢复其酶活性。Ozawa等人公开了已知的结合配偶体——磷酸化胰岛素受体底物1(IRS-1)与其PI3-激酶的靶N末端SH2结构域之间的相互作用，这是使用分裂萤光素酶在胰岛素的存在下监测的。Paulmurugan等人(2002)使用基于分裂萤火虫萤光素酶的测定，以使用互补策略和内含肽介导的重构策略监控在细胞培养物和小鼠中的2种蛋白质即MyoD和Id的相互作用。为了保留报道物活性，在互补策略中，融合蛋白需要蛋白质相互作用，即，经由蛋白质配偶体MyoD和Id的相互作用，而在重构策略中，经由内含肽介导的剪接形成的新的完整甲虫萤光素酶维持其活性，甚至在不存在蛋白质配偶体之间的持续相互作用的情况下也是如此。蛋白质片段互补测定公开于Michnick等人(美国专利号6,270,964、6,294,330和6,428,951)中。具体地，Michnick描述了基于分裂鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的测定，其中DHFR的N末端片段和DHFR的C末端片段各自与GCN4亮氨酸拉链序列融合。DHFR活性在表达2种融合蛋白的细胞中进行检测。Michnick等人还描述了另一种互补方法，其中将在氨基葡糖苷激酶(AK)基因中Sl核酸酶产生的缺失的嵌套组引入亮氨酸拉链构建体内，并且将所得到的构建体组引入细胞且就AK活性进行筛选。需要是的用作生物传感器，例如在检测细胞事件例如蛋白质-蛋白质相互作用、细胞内信号转导、或生理学转化中用作生物传感器，具有高度特异性和高信号灵敏度的改善的重组萤光素酶。发明概述本发明提供了改善的基因产物，例如，经修饰的萤光素酶例如经修饰的曱虫萦光素酶，例如萤火虫或叩头虫萤光素酶，珊瑚虫(anthozoan)萤光素酶例如海肾(i^m7/a)萤光素酶，或甲壳类动物萤光素酶，其在一种或多种目的分子的存在下具有一种或多种改变的活性，所述目的分子例如cAMP、cGMP、激酶、磷酸酶或钙。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶的氨基酸序列不同于相应未修饰的(天然的、野生型或亲本的，例如具有一个或多个取代的突变型萤光素酶)萤光素酶，这是由于在对修饰耐受，例如对插入、缺失、环状变换或其任何组合耐受的位点(残基)上或区域中的一种或多种修饰。在一个实施方案中，对修饰耐受的区域包括二级结构，例如在天然的、野生型萤光素酶上发现的P折叠或OC螺旋之间的表面环。一种或多种修饰可以相对于未修饰的萤光素酶的N或C末端是内部的，和/或可以在未修饰的萤光素酶的N和/或C末端上，例如萤光素酶序列的缺失和/或一个或多个氨基酸残基的插入，任选包括在修饰位点上的萤光素酶序列，从而产生经修饰的萤光素酶。在本发明范围内的缺失包括在对缺失耐受的萤光素酶序列的位点上或区域中的一个或多个氨基酸残基的缺失。修饰可以包括一个或多个离散的(分离的)异源氨基酸序列的环状变换和引入(插入)，所述异源氨基酸序列中的至少一个与目的分子直接或间接相互作用，且所述修饰任选可以包括一个或多个氨基酸的缺失，例如在对修饰耐受的位点上或区域中，包括未修饰的萤光素酶的N和/或C末端，只要所得到的经修饰的萤光素酶在与目的分子的相互作用前和/或后具有生物发光活性，例如生物发光活性在与目的分子一起温育后改变。在一个实施方案中，修饰可以是在经修饰的萤光素酶中经由相应未修饰的萤光素酶中的肽键连接的两个氨基酸之间肽键的缺乏，所述肽键与经修饰的萤光素酶中在相应未修饰的萤光素酶的N末端和C末端残基上或附近发现的残基之间的肽键结合，所述缺乏产生环状变换萤光素酶，其任选包括一个或多个分离的异源氨基酸序列，所述异源氨基酸序列中的至少一个与目的分子直接或间接相互作用。在一个实施方案中，与目的分子直接或间接相互作用的一个或多个异源氨基酸序列在环状变换萤光素酶中对应于相应未修饰的萤光素酶的N末端和/或C末端残基的序列上或附近。在另一个实施方案中，与目的分子直接或间接相互作用的一个或多个异源氨基酸序列在环状变换或非环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基上或附近。在一个实施方案中，在环状变换萤光素酶中与目的分子直接或间接相互作用的一个或多个异源氨基酸序列在对修饰耐受的位点上或区域中，其不在环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基上或附近，即异源序列对于N和C末端是内部的。在一个实施方案中，环状变换萤光素酶进行修饰以包括两个或更多异源氨基酸序列，所述异源氨基酸序列独立地在对应于相应未修饰的营光素酶的N末端和/或C末端残基的序列上或附近、在环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基上或附近、在对修饰耐受的位点上或区域中，所述位点或区域不在环状变换或非环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基上或附近，或其任何组合。在一个实施方案中，异源氨基酸序列各自与不同的目的分子直接或间接相互作用。在一个进一步的实施方案中，环状变换萤光素酶包括至少两个异源氨基酸序列，其在特定外源试剂的存在或不存在下彼此相互作用。两个异源氨基酸序列可以包含相同或不同序列。此外，经修饰的萤光素酶可以包括在对应未修饰的萤光素酶的N或C末端的1-约10或约30个残基，或两者之间的任何整数，例如15个残基的N和C末端上的缺失。依赖具体萤光素酶，缺失的长度可以是超过30个残基，酶可以用于冲全测可逆相互作用，例如两个或更多分子的结合，二减J建的形成或其他构象变化，条件例如pH、温度或溶剂疏水性的变化，或经由经修饰的萤光素酶的活性改变的不可逆相互作用，例如光强度、颜色或动力曲线的改变。经修饰的萤光素酶还可以用于检测导致经修饰的萤光素酶的结构修饰的相互作用。经修饰的萤光素酶还可以用于检测导致经修饰的萦光素酶的结构修饰的相互作用，例如经由激酶的磷酸化或经由蛋白酶的键断裂。如下所述，导致具有可检测活性的经修饰的叩头虫萤光素酶的框内插入在叩头虫萤光素酶的残基21、25、117、358、376、379、398、399、400、401、402、403、405、406、407、409或490上，即对修饰耐受的那些残基和/或那些氨基附近的区域。也如下所述，导致具有可检测活性的经修饰的萤火虫萤光素酶的框内插入在萤火虫萤光素酶的残基7、121、233、267、294、303、361、540或541上，即对修饰耐受的那些残基和/或那些氨基附近的区域。对修饰耐受的另外残基或区域也在本文中下文得到描述。因此，甲虫萤光素酶可以在残基上进行修饰，例如叩头虫萤光素酶的残基21、25、117、358、376、379、398、399、400、401、402、403、405、406、407、409或490,或对应叩头虫萤光素酶的残基15-30，例如残基21或25、残基112-122，例如残基117、残基352-362，例如残基358、残基371-384,例如残基379、残基393-414、或残基485-495的区域中，或在萤火虫萤光素酶的残基7、37、47、75、83、107、121、144、160、174、188、198、205、225、233、242、255、268、308、316、358、377、403、435、490或540上，或对应萦火虫萤光素酶的残基2-12、残基32-53,例如残基32-43或残基42-52、残基70-88，例如残基70-80或残基78-88、残基102-126，例如残基102-112或残基116-126、残基139-165、残基183-203、残基220-247,例如残基228-238、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495、或残基535-546的区域中。对应位置可以通过使用例如序列比对程序通过比对萤光素酶序列进行鉴定。萤光素酶中对修饰耐受的残基或区域可以用作位点，以环状变换萤光素酶，用于插入，或使营光素酶"分裂"成可以在蛋白质互补或蛋白质剪接测定中使用的两个分子。本发明进一步包括经修饰的珊瑚虫萤光素酶，其具有在对修饰耐受的位点上或区域中的至少一个修饰，所述位点或区域包括但不限于在对应海肾萤光素酶(GenbanklDAF025843)的残基2、30、31、42、45、46、68、69、90、91、92、110、111、150、151、168、169、193、207、208、223、224、251、259、274或311的残基上，或在对应海肾萤光素酶(GenbankIDAF025843)的残基2-12、残基26-36、残基37-47、残基64-74、残基86-97,例如残基90或91、残基96-116、残基147-157、残基218-234，例如残基223、234、228、229或230、或残基301-311的区域中。对应位置可以通过使用例如序列比对程序通过比对萤光素酶序列进行鉴定。萤光素酶中对修饰耐受的残基或区域可以用作位点，以环状变换萤光素酶，用于插入，或使营光素酶"分裂"成可以在蛋白质互补或蛋白质剪接测定中使用的两个分子。进一步包括的是经修饰的曱壳类动物萤光素酶，例如，桡足动物(copepod)萤光素酶，其具有在对修饰耐受的位点上或区域中的至少一个修饰，包括但不限于在对应曲萤(Gm^w'"J萤光素酶的残基43-53、残基63-73、残基79-89、残基95-105、残基105-115、残基109-119、残基121-131或残基157-168的区域中，例如参见图41,或对应成熟的刺奸(0//o;/2on^，萦光素酶的残基45-55或残基79-89的区域中。对应位置可以通过使用例如序列比对程序通过比对萤光素酶序列进行鉴定。萤光素酶中对修饰耐受的残基或区域可以用作位点，以环状变换萦光素酶，用于插入，或使萤光素酶"分裂"成可以在蛋白质互补或蛋白质剪接测定中使用的两个分子。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶具有可检测的活性，并且相对于相应未修饰的萤光素酶包括在对修饰耐受的位点上或区域中的19一个或多个氨基酸的插入，所述插入包括这样的氨基酸序列，其与目的分子直接相互作用，例如包括目的分子的识别序列的插入，或与目的分子间接相互作用，例如经由另一种分子而相互作用。在一个实施方案中，经^修饰的萤光素酶包含两个或更多，例如3、4、5、10、20、50、100、200、300个或更多，但小于约1000个，或两者之间的任何整数个氨基酸残基的插入。例如，IP3序列的插入可以包括约700个氨基酸残基。在一个实施方案中，具有插入的经修饰的安光素酶进一步包含萤光素酶序列的缺失，例如1个或更多，爿f旦小于约100个，例如小于50、40、30、20、10或5个，或两者之间的任何整数个残基的缺失。在一个实施方案中，本发明提供了进一步修饰以包括氨基酸序列的插入的环状变换萤光素酶，所述氨基酸序列与目的分子直接相互作用，例如包括目的分子的识别序列的插入，或与目的分子间接相互作用，例如经由另一种分子相互作用。例如，如下文所述，具有对修饰耐受的N和/或C末端以及内部残基或区域的萦光素酶在耐受残基或区域上和在不同的耐受残基或区域上进行环状变换，并且插入一个或多个异源氨基酸序列，所述异源氨基酸序列中的至少一个与目的分子直接或间接相互作用。所得到的经修饰的萤光素酶在目的分子的存在下显示具有可检测活性的改变。在一个实施方案中，具有cAMP或cGMP结合位点的环状变换曱虫萤光素酶、环状变换十足目甲壳类动物萤光素酶(例如刺虾萤光素酶)、或环状变换海肾萤光素酶在环状核苷酸例如cAMP或cGMP的存在下显示具有改变的萤光素酶活性。在本发明萤光素酶中有用的环状核苷酸结合位点可以具有G(E/Q/K)(L/K/S/I)(A/I/C/G)(L/I)X(P/V/T/R/E)R(A/T/H/S)(A/S)(V/T/S/N/W)(SEQIDNO:118)，其中X是2-6个氨基酸。在本发明环状变换萤光素酶中有用的cAMP结合位点(结构域)包括但不限于在由cAMP(Epac)直接激活的交换蛋白质中的cAMP结合位点(Bos等人，2003;并且参见例如，NCBI登记号AF115480)，包括Epac2B、Epac1和EpacIIA,环状核苦酸门控的离子通道例如超极化活化的环状核苷酸调节的通道(Zagotta等人，2003),神经病把酯酶(Dremier等人，2003)，PKA调节性II卩型亚基(参见例如NCBI登记号M124921),例如PKAII卩A和PKAII卩B,PKA调节性Ia型亚基，例如PKAIaA和PKAIaB、PKGIIA、PKGIIB,和分解代谢产物活化蛋白质。如本文所述，具有cAMP结合位点的非环状变换海肾萤光素酶和非环状变换十足目曱壳类动物萤光素酶在cAMP的存在下具有改变的萤光素酶活性。在本发明的环状变换萤光素酶中有用的cGMP结合位点包括但不限于cGMP依赖性蛋白激酶(GK)中的cGMP结合位点，例如，GKI,或磷酸二酯酶(PDEs)中的GAF调节区，例如PDE2或PDE5，腺普酸环化酶，或FnlA。在一个实施方案中，包含本发明萤光素酶的环状核苷酸结合结构域进一步包括亚细胞定位信号，其用于检测环状核苷酸的亚细胞定位和/或浓度。如下文所述，制备具有代表至少4种不同结构折叠类别的各种序列的插入的萤光素酶生物传感器。特别地，折叠类别之一通过不同的小分子相互作用来参与众多酶的调节。此外，变构结构域插入本发明萤光素酶内可以用于检测构象变化例如磷酸化或蛋白酶切割，所述变构结构域即在结合另一种分子后改变结构构象的结构域。因此，在一个实施方案中，本发明经修饰的萤光素酶包含这样的氨基酸序列，其相对于相应的萤光素酶的氨基酸序列，例如未修饰的野生型萤光素酶是环状变换的，得到环状变换萤光素酶中的新N和C末端，其中至少一个在对修饰耐受的位点上或区域中，并且通过引入异源氨基酸序列工程化为具有功能性，所述异源氨基酸序列与例如环状核苦酸直接或间接相互作用。在另一个实施方案中，环状变换营光素酶包括其他修饰，包括但不限于环状变换萤光素酶的N或C末端内部的插入和/或缺失，例如在相应未修饰的萤光素酶的N和C末端上或附近的另一个插入和/或缺失，例如在对应N末端的残基1-约10或约30，或两者之间的任何整数的残基上，和/或对应于相应未修饰的萤光素酶的C末端的最后1个残基或约最后30个，例如最后15个，或1-30两者之间的任何整数的残基上。在一个实施方案中，在不存在目的分子的情况下，本发明经修饰的萦光素酶的活性小于相应未修饰的萤光素酶的活性，例如经修饰的萤光素酶的报道物活性为相应未修饰的萤光素酶活性的约0.001%、0.01%、0.1°/。、1%、10%、20%、50%、70%或更多，但小于100%,所述经修饰的萤光素酶的活性任选是可检测的。在另一个实施方案中，在不存在目的分子的情况下，本发明经修饰的萤光素酶的活性与相应21未修饰的萤光素酶的活性基本上相同或更大，例如本发明经修饰的萤光素酶的报道物活性是相应未修饰的安光素酶活性的约1.5倍，例如至少2、3或5倍或更多。在目的分子的存在下，本发明经修饰的萤光素酶的活性是可检测地改变的。例如，相对于在不存在目的分子的情况下经修饰的萤光素酶的活性，在目的分子的存在下经修饰的萤光素酶的活性的可检测改变是至少0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%或100%，和最高达2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多的改变。因此，与经修饰的营光素酶而不是相应未修饰的萤光素酶中存在的修饰相互作用的目的分子的物理接近，会改变，例如减少、消除或增加经修饰的营光素酶的活性。例如，经修饰的甲虫、珊瑚虫安光素酶或十足目甲壳类动物可以是具有cAMP结合位点的环状变换甲虫、珊瑚虫或十足目甲壳类动物萤光素酶。相对于在不存在cAMP的情况下经修饰的萤光素酶的发光信号，或在cAMP存在或不存在的条件下相应未修饰的甲虫、珊瑚虫或十足目甲壳类动物萦光素酶的发光信号，在cAMP的存在下此种经修饰的萤光素酶的发光信号可以是减少、消除或增加的。因此，本发明经修饰的萤光素酶可以用作生物传感器。本发明还提供了分离的核酸分子(多核苷酸)，其包含编码本发明经修饰的萤光素酶的核酸序列。进一步提供的是包含编码融合蛋白的核酸序列的分离的核酸分子，所述融合蛋白包含经修饰的萤光素酶和在经修饰的萤光素酶的N末端(N末端融合配偶体)和/或C末端(C末端融合配偶体)上的一个或多个氨基酸残基。因此，如本文所使用的，"融合蛋白"是包括在本发明经修饰的萤光素酶的N末端和/或C末端上的一个或多个氨基酸的多肽。优选地，相对于相应经修饰的萤光素酶，融合蛋白中的一个或多个融合配偶体的存在不显著改变融合蛋白的可才全测活性。N或C末端融合配偶体可以是用于純化的序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)或聚His序列，希望改变经修饰的萤光素酶的性质的序列，例如蛋白质去稳定序列，蛋白质或核酸相互作用序列(例如，结合序列)，亚细胞定位序列，或具有可与融合蛋白中的萤光素酶的一种或多种性质可区分的性质的序列。在一个实施方案中，融合蛋白包含经修饰的萤光素酶和融合配偶体，所述融合配偶体是不同于营光素酶的报道蛋白质，所述报道蛋白质作为分子内对照是有用的，例如荧光蛋白质或另一种萤光素酶。在另一个实施方案中，本发明包括包含编码融合蛋白的核酸序列的载体，所述融合蛋白包含本发明经修饰的萤光素酶和编码报道蛋白质的核酸片段，所述报道蛋白质不同于经修饰的萤光素酶中的萤光素酶。任选地，至少编码营光素酶、并且优选编码经修饰的萤光素酶或包含经修饰的萤光素酶的融合蛋白的优化的核酸序列，例如人密码子优化序列在本发明核酸分子中使用，因为那些优化序列可以增加萤光素酶的信号的强度。核酸序列的优化是本领域已知的，参见例如WO02/16944。本发明还包括表达本发明的经修饰的萤光素酶或融合蛋白的稳定细胞系，以及包含编码本发明的经修饰的萤光素酶或融合蛋白的核酸分子的表达盒，和在宿主细胞中能够表达本发明核酸分子的载体(例如，质粒、病毒、或缺陷病毒颗粒)。优选地，表达盒包含与核酸序列可操作地连接的启动子，例如组成型或调节型启动子。在一个实施方案中，表达盒包含诱导型启动子。还提供的是包含本发明表达盒或载体的宿主细胞，例如原核细胞或真核细胞例如植物或脊推动物细胞，例如哺乳动物细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、牛、马、羊或啮齿类动物(例如，兔、大鼠、雪貂或小鼠)细胞，和包含本发明核酸分子、表达盒、载体、宿主细胞或经修饰的萤光素酶或融合蛋白的试剂盒。本发明经修饰的萤光素酶可以这样的应用中使用，即其中未修饰的萤光素酶不能例如作为功能性报道物以测量或检测各种条件或目的分子，例如经由插入激素受体结合位点例如雌激素结合结构域、4丐结合结构域的类固醇，经由插入蛋白酶识别位点的蛋白酶，或经由插入环状核苦酸结合位点的环状核苷酸。例如，编码包含cAMP结合位点的插入的经修饰的萤光素酶的载体，或包含cAMP结合位点的插入的经修饰的萤光素酶与样品混合，所述样品例如细胞、细胞裂解物、体外转录/翻译混合物、或上清液，并且样品中的经修饰的萤光素酶的活性如下进行检测或测定，例如任选在一个或多个时间点上，并任选相对于相应未修饰的安光素酶，或相对于与cAMP具有减少的相互作用的类似修饰的萤光素酶(例如通过突变成特定氨基酸进一步修饰以减少与cAMP的结合亲和力)，或相对于不含cAMP或具有不同量cAMP的对照样品。样品中例如随时间和/或相对于对照(例如具有指定量cAMP的细胞)的发光活性的改变，表明样品中cAMP的存在或量，或相对于实验条件的cAMP量的改变。在一个实施方案中，使细胞与包含启动子例如调节型或组成型启动子的载体、和编码本发明经修饰的萤光素酶的核酸序列接触，所述经修饰的营光素酶包含与环状核苷酸相互作用的插入。在一个实施方案中，转染细胞在其中启动子诱导经修饰的萤光素酶的瞬时表达的条件下进行培养，并且测定发光的存在或量。在另一个实施方案中，将包含与环状核苷酸相互作用的插入的本发明经修饰的萤光素酶和怀疑具有环状核苷酸的样品混合。随后测定发光的量。本发明因此提供了检测环状核苷酸的量的方法。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶是经修饰的珊瑚虫萤光素酶，例如经修饰的海肾萤光素酶。在一个实施方案中，经修饰的珊瑚虫萤光素酶是环状变换珊瑚虫萤光素酶，例如环状变换海肾萤光素酶。在另一个实施方案中，经修饰的珊瑚虫萤光素酶不是环状变换的。经修饰的珊瑚虫萤光素酶具有一个或多个异源氨基酸序列，包括与目的分子直接或间接相互作用的至少一个异源氨基酸序列。在一个实施方案中，氨基酸序列是在与目的分子相互作用期间或之后经历构象变化的氨基酸序列，所述构象变化随后改变萤光素酶的活性，例如，具有此种氨基酸序列的经修饰的海肾萤光素酶对于检测变构相互作用有用。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶是经修饰的十足目曱壳类动物萤光素酶，例如经修饰的刺虾萤光素酶。在一个实施方案中，经修饰的十足目甲壳类动物萦光素酶是环状变换十足目曱壳类动物萤光素酶，例如环状变换刺奸萤光素酶。在另一个实施方案中，经修饰的十足目甲壳类动物萤光素酶不是环状变换的。经修饰的十足目曱壳类动物萤光素酶具有一个或多个异源氨基酸序列，包括与目的分子直接或间接相互作用的至少一个异源氨基酸序列。在一个实施方案中，氨基酸序列是在与目的分子相互作用期间或之后经历构象变化的氨基酸序列，所述构象变化依次改变萤光素酶的活性，例如，具有此种氨基酸序列的经修饰的刺奸萤光素酶对于检测变构相互作用有用。与本发明经修饰的珊瑚虫萤光素酶或经修饰的十足目甲壳类动物萤光素酶融合的示例性目的氨基酸序列包括但不限于肠激酶位点，蛋白酶切割位点，例如关于胱天蛋白酶的位点，例如胱天蛋白酶3切割位点、胱天蛋白酶8切割位点、PSA,或病毒蛋白酶例如鼻病毒蛋白酶切割位点、SARS蛋白酶切割位点、或TEV蛋白酶切割位点(NLYFQG;SEQIDNO:119)，环状核苷酸结合位点，激素结合位点，钓结合结构域例如由EGTA和CaCl2调节的钾调蛋白，或具有与彼此相互作用且任选由外源试剂调节的序列的双重融合物，例如FKBP和FRB,其中雷帕霉素诱导结合并且FK506促进结合的解离；来自PKA-R的结构域和来自PKA-C的结构域，其可以由cAMP调节；来自SH2的结构域和能够磷酸化的结构域，其可以由例如酪氨酸激酶或磷酸酶调节；来自14-3-3t的结构域和能够磷酸化的结构域，其可以由例如cAMP-PKA调节；来自WW的结构域和能够^^粦酸化的结构域，其能够由例如Ser-Thr激酶调节；来自二氢叶酸还原酶(DHFR)的结构域，其能够由氨甲蝶呤(MTX)或BisMTX调节；来自促旋酶B(GyrB)的结构域，其可以由香豆霉素或新生霉素调节；或具有来自相同结构域的序列的双重融合物。因此，在一个实施方案中，环状变换珊瑚虫萤光素酶或经修饰的十足目甲壳类动物萤光素酶进行修饰以包括两个或更多异源序列，所述异源序列独立地在对应于相应未修饰的萦光素酶的N末端和/或C末端残基的序列上或附近、在环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基上或附近、在对修饰耐受的位点上或区域中，所述位点或区域不在环状变换萤光素酶的N末端和/或C末端残基的序列上或附近，或其任何组合，其中两个异源氨基酸序列可以与不同目的分子相互作用。进一步提供的是鉴定直接或间接调节目的分子的一种或多种试剂的方法。在一个实施方案中，本发明提供了检测或测定细胞中的目的分子活性的方法。该方法包括提供包含细胞与具有核酸序列的载体的发光反应混合物，所述核酸序列包含经修饰的萤光素酶，例如经修饰的甲虫萤光素酶的可读框。经修饰的萤光素酶相对于相应未修饰的萤光素酶具有插入，所述插入在愛光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中。相对于相应未修饰的萤光素酶，插入包括与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列。混合物在约20-约47°C，例如约37。C-约45。C。混合物中的发光随后进行检测或测定，从而检测或测定细胞中的分子的存在、量或活性。如下文所述，在添加测试试剂前，使发光反25应混合物与编码安光素酶的细胞一起在生理温度和/或条件，例如约37T和/或约5%C02下温育一段时间，能提供更快速的反应和更大的动态范围，所述萤光素酶是cAMP的生物传感器。还提供的是本发明生物传感器用于在细胞或多细胞生物例如活哺乳动物中成像的用途。附图简述图1.在叩头虫萤光素酶(氨基酸序列对应SEQIDNO:3)中的Tn5插入(粗体的)的位置。图2.亲本(未修饰的)萤火虫萤光素酶的氨基酸序列(luc+)(SEQIDNO:210)。图3.使用环状变换营光素酶的发光cAMP结合测定的示意图。图4.PKA调节性II卩型亚基(RII卩B)。大鼠RII卩B氨基酸264-412(PDB1CX4)的X射线晶体结构。RIipB呈现为红色带；cAMP呈现为球和棒。大鼠(氨基酸264-412)与人RII|3B(氨基酸266-414)之间的一级序列相似性为96.6%(程序Megallign,DNAStar)。图5A.环状变换萤火虫萤光素酶(CPM-FFLuc)表达质粒。HSV-TK或T7启动子分别用于在哺乳动物细胞或裂解物中表达环状变换萤火虫萤光素酶。萤火虫安光素酶的氨基酸544和4由富含Gly/Ser的4两个氨基酸的肽(SEQIDNO:196)连接。图5B.与RII卩B的CPM-FFLuc融合物(CPM画FFLuc/RII卩B)的表达质粒。限制酶的独特组合允许编码RIipB的DNA在框内连接，以产生具有各种X/Y肽接头长度的编码CPM-FFLuc/RIIPB融合蛋白的质粒(GSTG对应SEQIDNO:122;GSSG对应SEQIDNO:197;GSSGGSGGSG对应SEQIDNO:198,GSGGSGGSSG对应SEQIDNO:199;GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG对应SEQIDNO:200;和GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:201)。图5C.修饰用于大肠杆菌(五.co/O表达的EpacDNA序列(SEQIDNO:15)。图5D.表达CPM-hRL与RII卩B的融合物(CPM-hRL/RIIJ3B)的环状变换海肾萤光素酶(CPM-hRL)表达质粒和构建体。限制酶的独特组合允许编码RII(3B的DNA在框内连接，以产生具有各种X/Y肽接26头长度的编码CPM-hRL/RIipB融合蛋白的质粒(GSTG对应SEQIDNO:122;GSSG对应SEQIDNO:197;GSSGGSGGSG对应SEQIDNO:198;GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:201)。富含Gly/Ser的4两个氨基酸的肽对应SEQIDNO:196。图6.具有cAMP结合位点的环状变换曱虫萤光素酶的体外转录/翻译产物的SDS-PAGE分析。具有(X=4,Y=4)、(X=10,Y=10)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白的表达。图7.具有(X=4,Y=4)、(X=10,Y=10)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的功能表征。图8A.使用具有(X=4,Y=4)、(X=10，Y=10)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的剂量反应实验。图8B.具有(X=10,Y=10)个氨基酸残基的X/Y接头长度的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的选择性。图9.来自与具有(X=10,Y=10)的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器的反应的同质cAMP测定数据。图10A-B.关于包含cAMP结合位点的环状变换海肾萤光素酶的RLU活性的比專支。图11A-B.使用2种不同的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP生物传感器在福司柯林处理的HEK293细胞的裂解物中cAMP浓度的测量。图11C.在用DNA瞬时转染的HEK293细胞中随时间的RLU,所述DNA编码具有(X=10,Y=10)的X/Y接头长度的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP萤光素酶生物传感器。图12.具有集合[2x(x=0-5)，2y(y=0-5)]中的氨基酸残基数的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP生物传感器的功能表征。在100pMcAMP的存在和不存在下的萤光素酶活性。接头组合(10,2)和(10,6)未显示。图13.具有集合[2x(x=0-5),2y(y=0-5)]中的氨基酸残基数的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器的功能表征。在100pMcAMP的存在下的萤光素酶活性中的诱导倍数。接头组合(10，2)和(10,6)未显示。图14.具有集合[IO,-2n(n=l國7)]、[10,2n(n=l画5)]和[IO+2n(n=1-5),O]中的氨基酸残基数的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIipBcAMP传感器的功能表征。在100pMcAMP的存在和不存在下的萤光素酶活性。图15.具有集合[IO,-2n(n=1-7)]、[10,2n(n=l陽5)]和[IO+2n(n=1-5),O]中的氨基酸残基数的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器的功能表征。在100pMcAMP的存在下的萤光素酶活性中的诱导倍数。图16A-B.使用具有(X=4,Y=4)和(X=10,Y=4)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-叩头虫Luc/RII卩BcAMP传感器和相应的CPM-FF萤光素酶的剂量反应实验的比较。图17A-B.使用具有(X=4,Y=4)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIaBcAMP传感器和相应的CPM-FFLuc/RIipB的剂量反应实验的比较。图18A-B.使用具有(X=4,Y=4)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-耐热Luc/RII卩BcAMP传感器和相应的CPM-FF萤光素酶的剂量反应实验的比较。图19.使用(X=4,Y=20)的X/Y接头长度的CPM-hRL/RII卩BcAMP生物传感器监控HEK293细胞中的cAMP浓度的变化。图20.CPM-FFLuc(SEQIDNO:16)的序列。图21.CPM-FFLucGAF构建体的示意图。GSTG对应SEQIDNO:122;GSSG对应SEQIDNO:197;GSSGGSGGSG对应SEQIDNO:198;GSGGSGGSSG对应SEQIDNO:199;GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG对应SEQIDNO:200;GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:201;和42RT对照肽对应SEQIDNO:196。图22.在cGMP的存在和不存在下各种CPM-FFLucGAF构建体的RLU。图23.对于CPM-FFLucGAF构建体伴随增加浓度的cGMP或cAMP的诱导倍数。图24.CPM-FFLuc钙生物传感器的示意图。GSTG对应SEQID28NO:122;GSSG对应SEQIDNO:197;GSSGGSGGSG对应SEQIDNO:198,GSGGSGGSSG对应SEQIDNO:199;GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG对应SEQIDNO:200;和GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:201;42RT对照肽对应SEQIDNO:196;LEGSGGGG对应SEQIDNO:202;和GGGGSGPW对应SEQIDNO:203。图25.在CaCl2或EDTA和EGTA的存在下各种CPM-FFLuc钓生物传感器的RLU。图26.萦火虫萦光素酶的修饰的另外位点。图27.CPM-FFLuccAMP生物传感器在各个位点上的体外RLU和诱导倍数。图28.CPM-FFLuccAMP生物传感器在各个位点上的体外RLU和诱导倍数。图29.具有在非环状变换的海肾萤光素酶中的RIipB的插入的构建体。图30.图29中所示的构建体的RLU和诱导倍数。图31.具有在非环状变换的海肾萤光素酶中的RI印B和各种接头长度的构建体。图32.图31中所示的构建体的RLU和诱导倍数。图33.具有在环状变换的海肾荣光素酶中的RIaB的构建体。图34.图33中的构建体的RLU和诱导倍数。图35.体外活性测试。构建体pBFB287用于91个位点。使用TnTT7偶联的兔网织红细胞裂解产物系统(CoupledRabbitReticulocyteLysateSystem)表达后，使8.5[iLTNT反应与补充有1.7[iL1mMcAMP原液或dH20的8.5300mMHEPES/200mM硫脲(pH约7.5)混合；允许反应在室温下温育约10分钟。将5每种样品一式三份地加入96孔板孔中，并且使用lOOjxL海肾萤光素酶测定试剂在Glomax光度计上测量发光。图36.体外活性测试。构建体201325.44.H6用于91个位点。使用TnTT7偶联的麦芽提取物系统表达后，使5^LTNT反应补充1.51mMcAMP原液或dH20;允许反应在室温下温育约10分钟。随后将15这种混合物加入75ulIX海肾裂解緩冲液中，并且将20)iL每种样品一式三份地加入96孔板孔中，并且使用100nL海肾萤光素酶测定试剂在Glomax光度计上测量91和223种构建体的发光。对于229种构建体，cAMP诱导如图35中所述进行测量。图37.CPMRLuccAMP生物传感器的瞬时转染数据。图38A.使用CPMFFLuccAMP生物传感器的GPCR的单步测定的示意图。图38B.在CPMFFLuccAMP测定中RLU对增加的福司柯林浓度作图。图39.来自使用CPMFFLuccAMP生物传感器筛选化合物文库的数据。图40.使用CPMFFLuccAMP生物传感器的具体化合物的剂量反应。图41.示例性桡足动物萤光素酶的氨基酸序列(SEQIDNO:204;GenbankIDAAG54095)。图42.CPM-FFLuc/RII卩cAMP生物传感器在室温和37°C下随时间的相对反应的比4交。图43A-B.在各种激动剂(A)或拮抗剂(B)的存在下在室温和37。C下CRE报道物和CPM-FFLuc/RII卩cAMP生物传感器的RLU。图44.用稳定转染了CPM-FFLuc/RIip且暴露于不同量的多巴胺的细胞在37。C下随时间的诱导倍数。图45.在37。C下RLU对logM多巴胺作图。图46.在37。C下关于各种激动剂的效力排序。图47.在37。C下关于各种拮抗剂的效力排序。图48.使用HEK293/CPM-FFLuc/RII卩的卩2-肾上腺素能受体的激动剂的效力排序。稳定表达CPM-FFLuc/RIIB的HEK293细胞用内源性卩2-肾上腺素能受体的激动剂进行刺激。发光在室温下温育26分钟后进行测量。图49.使用HEK293的卩2-肾上腺素能受体的激动剂的效力排序。稳定表达CPM-FFLuc/RIIB的HEK293细胞在0.033异丙肾上腺素的存在下与拮抗剂一起温育。发光在室温下温育31分钟后进行测量。图50.使用各种激动剂的生物发光GPCR测定的比较。图51.使用各种拮抗剂的生物发光GPCR测定的比较。图52.使用CPMRLuc/RII卩BcAMP生物传感器对cAMP的细胞内改变的检测。A)使用不同启动子的检测的比较。B)福司柯林诱导。C)SK38393诱导。D)多巴胺诱导。图53.在具有CPMRLuc/RI印BcAMP生物传感器的细胞中的cAMP的细月包内改变的冲企测。图54.具有RII卩B和各种接头长度的FLuc构建体的RLU。图55.刺蚱萤光素酶及其融合构建体的核酸序列(SEQIDNOs:205、206、207、208、209)。图56.在体外蛋白质互补测定(PCA)中刺奸萤光素酶融合物的RLU。在本底扣除后测定诱导倍数。图57.刺奸萤光素酶(OpLuc)融合物的SDS-PAGE分析。泳道1)全长OpLuc;泳道2)共表达的50-FRB和FKBP-51;泳道3)50-FRB;泳道4)FKBP-51;和泳道5)无DNA对照。图58.在体外PCA中刺虫下萤光素酶融合物的RLU。在本底扣除后测定诱导倍数。图59.刺奸萤光素酶融合物的SDS-PAGE分析。泳道1)全长OpLuc;泳道2)共表达的84-FRB和FKBP-85;泳道3)84-FRB;泳道4)FKBP-85;和泳道5)无DNA对照。图60.在基于细胞的PCA中刺虾萤光素酶融合物的RLU。N=3。ss二分裂位点。在本底扣除后测定诱导倍数。图61.在体外PCA中刺奸萤光素酶环状变换样融合物的RLU。在本底扣除后测定诱导倍数。图62.刺虾萤光素酶环状变换样融合物的SDS-PAGE分析。泳道1)全长OpLuc;泳道2)共表达的51-FKBP和FRB-50;泳道3)共表达的85-FKBP和FRB-84;泳道4)FRB-50;泳道5)FRB-84;泳道5)51-FKBP;泳道7)85-FKBP;和泳道8)无DNA对照。84-FRB;泳道4)FKBP-85;和泳道5)无DNA对照。图63.基于CP刺虾萤光素酶的载体。图64.使用基于RIipBCP刺奸萤光素酶的载体的结果。左边的柱指出完整的萤光素酶(对照)的活性。从左边开始的第两个柱对应具有4aa接头的构建体。从左边开始的第3个柱具有4aa接头的-"-。从左边开始的第4个柱具有20aa接头的-"-。图65.丝氨酸/苏氨酸激酶/磷酸酶构建体。在该表中具体鉴定的肽序列是EIYGEFGSSG(SEQIDNO:267)、EIYGEFGSSGGSGGSG(SEQIDNO:268)、EIYGEFGSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:269)、GSSG(SEQIDNO:270)、GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEFGSSG(SEQIDNO:271)、GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEFGSGGSGGSSG(SEQIDNO:272)、GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEFGSGGSGGSGGGSGGSGGSSG(SEQIDNO:273)、GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEFGSGSGGSGGSSG(SEQIDNO:274)、GSTG(SEQIDNO:275)、GSSGGSGGSG(SEQIDNO:276)、GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277)、GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:278)、GSSGRKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG(SEQIDNO:279)、GGSGGSGSSGRKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG(SEQIDNO:280)、GSGGSGGSGG(SEQIDNO:281)、GSSGGSGGSGGGSGGSGSSGRKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG(SEQIDNO:282)、RKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG(SEQIDNO:283)、GGSSGRKRDRLGTLGIGGSSG(SEQIDNO:284)、GGSSGRKRDRLGTLGIGSSGSGGSGG(SEQIDNO:285)、GGSSGRKRDRLGTLGIGSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:287)、GSSGGSGGSGGGSGGSG(SEQIDNO:288)、GGSSGRKRDRLGTLGIGSSGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:IDNO:290)、GSGGSGGSSG(SEQIDNO:291)、GSSGGSGGSGGGSGGSGGSGRKRDRXGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG(SEQIDNO:292)、GSGG(SEQIDNO:293)、和GGSGGGGSGG(SEQIDNO:294)。图66.体外Flue丝氨酸/苏氨酸激酶测定。图67.A-DDDDDDDDDDDD。^表性核酸序歹'j。发明详述定义如本文所使用的，术语"核酸分子"、"多核苷酸"、或"核酸序列"32指核酸、DNA或RNA,其包含多肽或蛋白质前体生产所必须的编码序列。编码的多肽可以是全长多肽、其片段(小于全长)、或全长多肽或其片段与另一种多肽的融合物，产生融合多肽。如本文所使用的，"核酸"是共价连接的核苷酸序列，其中1个核苷酸的戊糖的3'位置通过磷酸二酯基团与下一个核苦酸的戊糖的5'位置连接，并且其中核普酸残基(碱基)在特定序列，即核苷酸的线性顺序中进行连接。如本文所使用的，"多核苷酸"是包含长度超过约100个核普酸的序列的核酸。如本文所使用的，"寡核普酸"或"引物"是短多核香酸或多核苷酸的部分。寡核香酸一般包含约2-约100个碱基的序列。单词"寡核苷酸(oligo)"有时代替单词"寡核苷酸(oligonucleotide)，，使用。核酸分子被说成具有"5'-末端"(5'端)和"3-末端"(3'端)，因为核酸磷酸二酯键出现在取代单核苦酸的戊糖环的5'碳和3'碳上。在其上新键将是5'碳的多核苷酸的末端是其5'末端核苷酸。在其上新键将是3'碳的多核苷酸的末端是其3'末端核苦酸。如本文所使用的，末端核苷酸是在3'-或5'-末端的末端位置上的核苷酸。DNA分子被说成具有"5'末端"和"3末端"，因为单核苷酸以以下方式反应以形成寡核苷酸即使得1个单核苷酸戊糖环的5'磷酸在一个方向上经由磷酸二酯键与其邻居的3'氧连接。因此，如果寡核普酸的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则寡核苷酸的末端称为"5'末端"，如果它的3'氧未与随后的单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则称为"3'末端"。如本文所使用的，核酸序列即使对于较大的寡核苷酸或多核普酸是内部的，也可以;故说成具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元件称为"下游"或3'元件的"上游"或5'。这个术语反映转录沿着DNA链以5'至3'的方式进行。一般地，指导连接的基因(例如，可读框或编码区)的转录的启动子和增强子元件一般位于编码区的5'或上游。然而，即使当位于启动子元件和编码区的3'时，增强子元件也可以发挥其效应。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3'或下游。如本文所使用的，术语"密码子"是由3个核普酸的序列組成的基本遗传编码单位，其指定被掺入多肽链内的特定氨基酸、或起始或终止信号。术语"编码区"当就结构基因而言使用时，指由于mRNA分子的翻译而编码在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。一般地，编码区在5'侧由编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体"ATG"并且在3'侧由终止密码子(例如，TAA、TAG、TGA)为边界。在某些情况下，编码区也已知由核苷酸三联体"TTG"起始。术语"基因"指包含编码序列并任选包含对于由DNA序列生产多肽所必须的控制序列的DNA序列。如本文所使用的，术语"异源"核酸序列或蛋白质指相对于参照序列具有不同来源，例如源于外来物种的序列，或如果来自相同物种，那么它可以由原始形式显著修饰。核酸已知包含不同类型的突变。"点"突变指在核苷酸序列中在来自野生型序列的单个碱基位置上的改变。突变还可以指一个或多个碱基的插入或缺失，从而使得核酸序列不同于参照，例如野生型序列。如本文所使用的，术语"杂交"指互补序列与靶核酸的退火，即包含互补序列的两个核酸聚合物(多核苷酸)通过碱基配对而退火的能力。术语"退火的"和"杂交的，，自始至终可互换使用，并且意欲包含互补序列和靶核酸之间的任何特定和可重现的相互作用，包括仅具有部分互补性的区域的结合。在天然核酸中通常未发现的某些碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。核酸
技术领域：
的技术人员可考虑众多变量，凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如互补序列的长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率。核酸双链体的稳定性通过解链温度或"Tm，，进行测量。在指定条件下的特定核酸双链体的Tm是平均一半碱基对解离的温度。术语"重组DNA分子"意指包含在自然界中通常未发现在一起的至少两个核苦酸序列的杂交DNA序列。术语"载体"用于指这样的核酸分子，即DNA片段可以插入或克隆到其内且可以用于将DNA区段转移到细胞内且能够在细胞中复制。载体可以来源于质粒、噬菌体、病毒、粘粒等。如本文所使用的，术语"重组载体"和"表达载体"指这样的DNA或RNA序列，其包含所需编码序列和对于可操作地连接的编码序列在特定宿主生物中表达所必须的合适DNA或RNA序列。原核表达载体包括启动子、核糖体结合位点、用于在宿主细胞中自主复制的复制起34点并且可能地包括其他序列，例如任选的操纵子序列、任选的限制酶位点。启动子定义为指导RNA聚合物与DNA结合且起始RNA合成的DNA序列。真核表达载体包括启动子、任选地包括聚腺苷酸化信号并任选地包括增强子序列。具有编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的多核苷酸意指包含基因的编码区的核酸序列，或换言之核酸序列编码基因产物。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链(即，有义链)或双链的。需要时，合适的控制元件例如增强子/启动子、剪接接合部、聚腺苷酸化信号等可以置于与基因的编码区紧密接近，以允许初级RNA转录物的适当的转录起始和/或正确加工。可替代地，编码区。其他调节元件包括但不限于转录因子结合位点、剪接信号、聚腺普酸化信号、终止信号和增强子元件。真核生物中的转录控制信号包含"启动子"和"增强子"元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，其与涉及转录的细胞蛋白质特异性相互作用。启动子和增强子元件已从各种真核生物来源中分离，所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞中的基因。启动子和增强子元件也已从病毒中分离，并且类似的控制元件例如启动子也在原核生物中发现。特定启动子和增强子的选择依赖用于表达目的蛋白质的细胞类型。某些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他的在有限的细胞类型子集中有用。例如，SV40早期基因增强子在来自许多哺乳动物物种的广泛多样的细胞类型中非常有活性，并且已广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质。在广泛范围的哺乳动物细胞类型中有活性的启动子/增强子元件的两个其他例子是来自劳斯肉瘤病毒和人巨细胞病毒的人延伸因子1基因和长末端重复序列的那些。术语"启动子/增强子"指包含能够提供启动子和增强子功能(即，由如上所述的启动子元件和增强子元件提供的功能)的序列的DNA区段。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是"内源的，，或"外源的"或"异源的"。"内源的"增强子/启动子是在基因组中与给定基因天然连接的那种。"外源的"或"异源的"增强子/启动子是借助于遗传操作(即，分子生物学技术)与基因并列放置的增强子/启动子，从而使得基因的转录由连接的增强子/启动子指导。在表达载体上"剪接信号"的存在通常导致重组转录物在真核宿主细胞中更高的表达水平。剪接信号介导来自一级RNA转录物的内含子的去除且由剪接供体和受体位点组成。通常使用的剪接供体和受体位点是来自SV40的16SRNA的剪接接合处。重组DNA序列在真核生物细胞中的有效表达需要指导所得到的转录物的有效终止和聚腺苦酸化的信号的表达。转录终止序列一般在聚腺苷酸化信号的下游发现并且长度为数百个核苷酸。如本文所使用的，术语"聚(A)位点"或"聚(A)序列"表示指导新生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化的DNA序列。重组转录物的有效聚腺普酸化是希望的，因为缺乏聚(A)尾的转录物是不稳定且快速降解的。在表达载体中使用的聚(A)信号可以是"异源的"或"内源的"。内源的聚(A)信号是在基因组中给定基因的编码区的3'末端上天然发现的那种。异源的聚(A)信号是已从一种基因中分离且置于另一种基因3'的那种。通常使用的异源聚(A)信号是SV40聚(A)信号。SV40聚(A)信号包含在237bpSamHIABc/1限制片段上且指导终止和聚腺苷酸化。真核表达载体还可以包含"病毒复制子"或"病毒复制起点"。病毒复制子是允许载体在表达合适的复制因子的宿主细胞中染色体外复制的病毒DNA序列。包含SV40或多瘤病毒复制起点的载体在表达合适的病毒T抗原的细胞中复制至高拷贝数(最高达104个拷贝/细胞)。相比之下，包含来自牛乳头瘤病毒或EB病毒的复制子的载体以低拷贝数(约100个拷贝/细胞)染色体外复制。术语"体外，，指人工环境并且指在人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞裂解物。术语"体内"指天然环境(例如，动物或细胞)并且指在天然环境内发生的过程或反应。术语"表达系统"指用于测定(例如，检测)目的基因表达的任何测定或系统。分子生物学领域中的技术人员应当理解可以使用广泛多样的表达系统中的任何一种。广泛范围的合适的哺乳动物细胞可从广泛多样的来源(例如，美国典型培养物保藏中心，Rockland，MD)获得。转化或转染方法和表达媒介物的选择将依赖所选择的宿主系统。转化和转染方法是本领域众所周知的。表达系统包括体外基因表达测定，其中目的基因(例如，报道基因)与调节序列连接，并且基因的表达在用抑制或诱导基因表达的试剂处理后进行监控。基因表达的检测可以通过任何合适的方式，包括但不限于表达的mRNA或蛋白质(例如，报道基因的可检测产物)的检测，或通过表达目的基因的细胞表型中的可检测变化。表达系统还可以包含其中检测切割事件或其他核酸或细胞变化的测定。如本文所使用的，术语"野生型"指具有从天然存在的来源分离的那种基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最经常观察到的且因此任意指定为基因的"野生型"形式的那种。相比之下，术语"突变体"指当与野生型基因或基因产物比较时，显示序列和/或功能性质中的修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。应当指出可以分离天然存在的突变体；这些通过当与野生型基因或基因产物比较时具有改变的特征的事实进行鉴定。术语"分离的"当就核酸而言使用时，如在"分离的寡核苷酸"或"分离的多核苷酸"中使用时，指被鉴定且与其来源中与之通常締合关的至少一种污染物分开的核酸序列。因此，分离的核酸以不同于它在自然界中发现的形式或设置存在。相比之下，非分离的核酸(例如，DNA和RNA)以它们在自然界中存在的状态发现。例如，给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上接近于邻近基因发现；RNA序列(例如，编码特定蛋白质的特定mRNA序列)在细胞中作为与编码许多蛋白质的众多其他mRNAs的混合物发现。然而，分离的核酸包括例如在通常表达所述核酸的细胞中的该核酸，其中核酸在不同于天然细胞的染色体位置中，或原本由与自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列侧接。分离的核酸或寡核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸或寡核苷酸将用于表达蛋白质时，寡核苷酸最低限度包含有义或编码链(即，寡核苷酸可以是单链的)，但可以包含有义和反义链(即，寡核普酸可以是双链的)。"肽"、"蛋白质"和"多肽"意指任何氨基酸链，与长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)无关。本发明核酸分子还可以编码天然存在的蛋白质或其多肽片段的变体，其具有与它所来源的天然存在的(天然或野生型)蛋白质的氨基酸序列至少85%、90%、95%或99%等同的氨基酸序列。术语"融合多肽"或"融合蛋白"指包含在N和/或C末端上与一种或多种异源序列(例如，非萤光素酶多肽)连接的参照蛋白质(例如，萤光素酶)的嵌合蛋白质。在某些实施方案中，37本发明经修饰的多肽、融合多肽或全长多肽的部分可以保留相应全长功能性(非嵌合)多肽的至少某些活性。在其他实施方案中，相对于相应全长功能性多肽，在不存在外源试剂或目的分子的情况下，本发明经修饰的多肽、融合多肽或全长功能性多肽的部分可以缺乏活性。在其他实施方案中，相对于相应全长功能性多肽，在外源试剂的存在下，本发明经修饰的多肽、融合多肽或全长功能性多肽的部分可以保留至少某些活性，或具有基本上相同的活性，或可替代地缺乏活性。多肽分子被说成具有"氨基末端"(N末端)和"羧基末端"(C末端)，因为肽键存在于第一个氨基酸残基的主链氨基和第二个氨基酸残基的主链羧基之间。术语"N末端"和"C末端"就多肽序列而言分别指包括多肽的N末端和C末端区域的部分的多肽区域。包括多肽的N末端区域的部分的序列包括主要来自多肽链的N末端一半的氨基酸，但不限于此种序列。例如，N末端序列可以包括多肽序列的内部部分，包括来自多肽的N末端和C末端一半的碱基。这同样应用于C末端区域。N末端和C末端区域可以但无需分别包括限定多肽的最终N末端和C末端的氨基酸。如本文所使用的，术语"重組蛋白质"或"重组多肽"指由重组DNA分子表达的蛋白质分子。相比之下，术语"天然蛋白质"在本文中用于指从天然存在的(即，非重組)来源分离的蛋白质。分子生物学技术可以用于生产与天然形式的蛋白质比较具有相同性质的重组形式的蛋白质。如本文所使用的，术语"细胞"、"细胞系"、"宿主细胞"可互换使用，并且所有此种命名包括这些命名的后代或潜在后代。"转化细胞"意指本发明核酸分子已引入其内(或其祖先内)的细胞。任选地，本发明核酸分子可以引入合适的细胞系内，以便制备能够生产由基因编码的蛋白质或多肽的稳定转染的细胞系。用于构建此种细胞系的载体、细胞和方法是本领域众所周知的。单词"转化体"或"转化细胞"包括来源于原始转化细胞的原代转化细胞，与转移数目无关。由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量方面可能不是精确相同的。然而，当在原始转化细胞中筛选时，具有相同功能性的突变后代包括在转化体的定义中。术语"同源性"指两个或更多序列之间的互补性程度。可以存在38部分同源性或完全同源性(即，同一性)。同源性通常使用序列分析软件(例如,GeneticsComputerGroup.UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter.1710UniversityAvenue.Madison,WI53705的序列分析软件包)进行测量。此种软件通过对各种取代、缺失、插入和其他修饰指定同源性程度来匹配相似序列。保守取代一般包括在下列组内的取代甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。术语"分离的"就多肽而言使用时，如在"分离的蛋白质"或"分离的多肽"使用时中，指被鉴定且与其来源中与之通常締合的至少一种污染物分开的多肽。因此，分离的多肽以不同于它在自然界中发现的形式或设置存在。相比之下，非分离的多肽(例如，蛋白质和酶)以它们在自然界中存在的状态发现。术语"纯化的"或"纯化"意指从目的组分例如蛋白质或核酸去除某些污染物的任何过程的结果。纯化组分的百分比由此在样品中增力口。如本文所使用的，"纯的"意指目的种类是存在的占优势种类(即，在摩尔基础上，它比组合物中的任何其他单个种类更丰富)，并且优选地基本上纯化的级分是其中目的种类包含存在的所有大分子种类的至少约50%(在摩尔基础上)的组合物。一般地，"基本上纯的"组合物将包含组合物中存在的所有大分子种类的超过约80%,更优选超过约85%、约90%、约95%和约99%。最优选地，目的种类纯化至基本同质(污染物种类通过常规检测方法在组合物中无法检测到)，其中组合物基本上由单个大分子种类组成。如本文所使用的，术语"可操作地连接"指核酸序列以这样的方式连接即，使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指编码氨基酸的序列以这样的方式连接即使得产生功能性(例如，酶促活性的，能够与结合配偶体结合，能够抑制等)蛋白质或多肽。如本文所使用的，术语"聚组氨酸束"或(His标记)指包含2-10个组氨酸残基的分子，例如5-10个残基的聚组氨酸束。聚组氨酸束允许共价连接的分子在固定的金属例如镍、锌、钴或铜、螯合柱上或通过与另一种分子(例如与His标记反应的抗体)的相互作用的亲和纯化。"蛋白质去稳定序列"包括但不限于，PEST序列，例如来自细胞周期蛋白，例如有丝分裂细胞周期蛋白、尿嘧啶通透酶或ODC的PEST序列、来自短效蛋白质例如ODC、早期反应蛋白质例如细胞因子、淋巴因子、原癌基因例如c-myc或c-fos、MyoD、HMGCoA还原酶，或S-腺苷酰曱硫氨酸脱羧酶的C末端区域的序列、CL序列、细胞周期蛋白破坏盒、或N-降解决定子。如本文所使用的，"标记基因"或"报道基因"是对表达该基因的胞区分的基因。此种基因可以编码可选或可筛选标记，这依赖于标记是否赋予可以通过化学方法，即通过使用选择剂(例如，除草剂、抗生素等)'选择，的性状，或它是否只是可以通过观察或测试，即通过'筛选，鉴定的"报道物"性状。本公开内容的元件通过使用特定标记基因详细例示。当然，合适的标记基因或报道基因的许多例子是本领域已知的，并且可以在本发明的实践中使用。因此，应当理解下述讨论是示例性的而不是详尽的。根据本文公开的技术和本领域已知的一般重组技术，本发明使得能够改变任何基因。示例性报道蛋白质由包含经修饰的报道基因的核酸分子编码，包括但不限于weo基因、卩-gal基因、gz^基因、cW基因、g/7f基因、/^g基因、/^D基因、We基因、mpw基因、6w基因、腈水解酶基因、吡喃半乳糖苷基因、木糖苷酶基因、胸苷激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)或乙酰乙酸(acetoacid)合酶基因(AAS)、氨甲蝶呤抗性基因、茅草枯脱囟素酶基因、赋予对5-甲基色氨酸的抗性的突变邻氨基苯曱酸合酶基因(WO97/26366)、R-基因座基因、卩-内酰胺酶基因、"氾基因、a-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因、萤光素酶(/wc)基因(例如，海肾(i^m'〃a^mybm^)萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因、或叩头虫萤光素酶(尸yra;/zorws//agzo//^/7a/amws)基因)、7JC母发光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、或绿色荧光蛋白基因的修饰。本文鉴定的所有氨基酸残基为天然L-构型。与标准多肽命名一致，关于氨基酸残基的缩写显示于下列对应表中。对应表1-字母3-字母氨基酸YTyrL-酪氨酸GGlyL-甘氨酸FPheL-苯丙氨酸MMetL-曱硫氨酸AAlaL-丙氨酸SSerL-丝氨酸IHeL-异亮氨酸LeuL-亮氨酸TThrL-苏氨酸VValL-缬氨酸PProL-脯氨酸KLysL-赖氨酸HHisL-组氨酸QGinL-谷氨酰胺EGluL-谷氨酸WTrpL-色氨酸RArgL-精氨酸DAspL-天冬氨酸NAsnL-天冬酰胺CCysL-半胱氨酸I.鉴定对修饰耐受的萤光素酶残基或区域的方法众多方法可用于鉴定萤光素酶基因中这样的位点和/或区域，其可以进行修饰例如破坏，而当转录和翻译时仍产生希望的，例如可容易检测的基因产物。例如，扩增反应可以用于在萤光素酶基因中去除和/或插入一个或多个氨基酸残基的核苷酸。可替代地，转座子可以用于制备插入突变的文库。转座子是在原核生物和真核生物的基因组中发现的移动DNA序列。转座子标记长期以来已被认为是用于随机分配引物结合位点，产生基因"敲除"，且将物理标记或遗传标记引入大的靶DNAs内的有力研究工具。用于制备本发明经修饰的萤光素酶的报道基因中的插入是这样的，即是在萤光素酶的编码区中的内部的框内插入。一种经常使用的转座系统是从革兰氏阴性菌中分离的Tn5系统。Tn5转座酶是已克隆且纯化至高比活性，且无需宿主细胞因子而进行转座的小的、单个亚基酶。此外，在靶DNA内的Tn5转座子插入是高度随机的，并且通过简单过程进行。Tn5转座酶将转座包含在其短的19个碱基对嵌合端(MosaicEnd,ME)Tn5转座酶识别序列之间的任何DNA序列。GPS-M诱变系统使用TnsABC^转座酶以将基于Tn7的转座子随机插入DNA乾内。革巴DNA可以是质粒、粘粒、BAC或纯化的染色体DNA。如果插入位点在翻译的基因区段内，那么这通常将导致无效(功能丧失)突变。存在插入的最小位点优先性，因此任何可读框的破坏都是可能的。由于靶免疫，在体内约190kb的距离上仅存在1个插入/DNA分子。因此，体外反应产生各自包含在不同位置上的转座元件的把DNA分子群体。转座子供体可以通过添加或替换抗生素例如卡那霉素抗性标记进行修饰。供体质粒可以在标准实验室大肠杆菌菌抹中生长，并且载体主链携带与转座子不同的抗生素标记例如Ampr和复制起点。为了破坏未反应的供体分子且避免不希望的反应产物，供体可以通过用稀有切割酶例如PI-SceI(VDE)消化进行破坏。对于其中诱变DNA转化到天然感受态生物(其摄取单条DNA链)内的应用，缺口被填充且连接。一旦鉴定了在萤光素酶序列中对修饰耐受的位点，就可以制备序列的插入、缺失和变换、或其任何组合。就变换的序列而言，Plainkum等人(2003)报道，由于活性位点的空间位阻，具有新N和C末端以及包含连接原始N和C末端的蛋白酶识别位点的肽接头的环状变换形式的核糖核酸酶A具有减少的核糖核酸酶活性。Plainkum等人发现用蛋白酶切割环状变换核糖核酸酶A会增加该蛋白质的活性，推测是通过去除对于活性位点的阻断而实现。在萤光素酶的情况下，N和C末端隔开约40埃，这是与5-6个氨基酸相等的距离。制备环状变换萤火虫萤光素酶，其中之一具有在Asp(234)上的新N末端和在Pro(233)上的新C末端以及蛋白酶肠激酶的识别位点，所述肠激酶在Asp(4)Lys的羧基末端侧切割(参见美国公开申请20050153310和PCT/US2004/032705)。融合的突变蛋白的活性通过用肠激酶处理增加约90-约150倍(图3)。其他生42物传感器包括插入环状变换萤火虫萤光素酶或叩头虫萤光素酶(CPhR=Asn401和CP2:R=Arg223)(参见美国公开申请20050153310和PCT/US2004/032705)内的胱天蛋白酶-3DEVD切割位点(图3)、PSA切割位点例如Ala-Asn-Lys-Ile-Ser-Tyr-Gln國Ser-Ser-Ser-Thr-Glu(SEQIDNO:17)、鼻病毒蛋白酶位点例如Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQIDNO:19)、和SARS病毒蛋白酶位点例如TSAVLQSGFR(SEQIDNO:20)。CP2具有在叩头虫萤光素酶中对应萤光素酶中的第234位的位置上的插入。如下文所述，制备环状变换海肾萤光素酶。本发明生物传感器包括但不限于以下这些其中异源氨基酸序列包括蛋白质结合结构域，例如结合IL-17RA的结构域，例如IL-17A，或IL-17RA的IL-17A结合结构域，Erg的Jun结合结构域，或Jun的EG结合结构域；钾通道电压传感结构域，例如用于检测蛋白质构象变化的结构域，Cdc42或rac粑的GTP酶结合结构域，或其他GTP酶结合结构域，与激酶或磷酸酶活性相关的结构域，例如调节性肌球蛋白轻链，PKCS,包含血小板-白细胞C激酶底物的PH和DEP结构域，其他磷酸化识别结构域和底物；葡萄糖结合蛋白结构域，谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白结构域，PKA或cAMP依赖性结合底物，InsP3受体，GKI,PDE,雌激素受体配体结合结构域，apoKl-er,或钙调蛋白结合结构域。在一个实施方案中，生物传感器用于检测GTP酶，例如Cdc42或Rac与EBFP、EGFPPAK片段、Raichu-Rac、Raichu-Cdc42、整联蛋白avp3、输入蛋白-a的IBB、CRafl的DMCA或NBD-Ras(用于Ras活化)、具有Ras异戊二烯化序列的Ras/RapRalRBD的结合结构域的结合。在一个实施方案中，生物传感器检测PI(4,5)P2(例如，使用PH-PCL51、PH-GRP1)、PI(4,5)P2或PI(4)P(例如，PH-OSBP)、PI(3,4,5)P3(例如，使用PH國ARNO、或PH-BTK、或PH-胞黏蛋白1)、PI(3,4,5)P3或PI(3,4)P2(例如，使用PHAkt)、PI(3)P(例如，使用FYVE-EEA1)、或Ca2+(胞质溶胶的)(例如，使用钙调蛋白或PKC的C2结构域。在一个实施方案中，结构域是具有磷酸化的酪氨酸(例如，在Src、Abl和EGFR中)的结构域，其检测ErbB2的磷酸化，Src、Abl和EGFR中的酪氨酸磷酸化，MKA2的活化(例如，使用MK2),cAMP诱导的磷酸化，PKA的活化(例如使用CREG的KID)，CrkII的磷酸化(例如使用SH2结构域pTyr肽)，bZIP转录因子和REL蛋白质(例如bFos和bJunATF2和Jun,或p65NFkB)的结合，或微管结合(例如使用驱动蛋白)。因此，本发明包括萤光素酶生物传感器，包括环状变换萤光素酶，所述萤光素酶序列可以包括原始(野生型)N或C末端或两者上的残基的缺失，例如在N末端上的1-3个或更多残基或在C末端上的1-6个或更多残基的缺失，以及与目的分子直接或间接相互作用的序列。II.示例性多核苷酸和蛋白质本发明包括包含任何以下氨基酸序列的经修饰的萤光素酶，所述氨基酸序列提供重组或合成地合成的具有可检测活性，例如发光活性的多肽，以及其蛋白质片段。经修饰的萤光素酶的萤光素酶序列与相应未修饰的萤光素酶的氨基酸序列相同或基本上相同。具有基本上相同的序列的多肽或肽意指氨基酸序列很大程度上相同但可能不是完全相同的，且保留与它相关的序列的功能活性。一般而言，如果两个氨基酸序列具有至少70%同一性，或具有至少80%、90%、95%或更多同一性，则它们是基本上相同或基本上同源的。同源性或同一性通常使用序列分析软件(例如，GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison，WI53705的序列分析软件包)进行测量。此种软件通过对各种缺失、取代和其他修饰指定同源性程度来匹配相似序列。在两个或更多核酸或多肽序列背景中的术语"同源性"和"同一性"指，当使用任何数目的序列比较算法或通过人工比对和目测进行测量时，当在比较窗或指定区域上就最大对应性比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多序列或子序列。对于序列比较，一般地一个序列充当与测试序列进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机内，需要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定可替代参数。序列比较算法随后基于程序参数计算相对于参照序列的测试序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以通过下述来进行Smith等人(1981)的局部同源性算法、44Needleman等人(1970)的同源性比对算法、Person等人(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或人工比对和目测。这些数学算法的计算机实现可以用于比较序列以测定序列同一性。此种实现包括但不限于PC/Gene程序(可从Intdligenetics,MountainView,California获得)中的CLUSTAL;ALIGN程序(版本2.0)以及Wisconsin遗传学软件包，版本8(可从GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的算法可以使用缺省参数来进行。CLUSTAL程序由Higgins等人(1988);Higgins等人(1989);Corpet等人(1988);Huang等人(1992);和Pearson等人(1994)充分描述。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)的算法。Altschul等人(1990)的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)的算法。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSPs),当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足某些正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等人，1990)。这些起始邻近字命中充当种子用于起始搜索以找到包含它们的更长HSPs。字命中随后在两个方向上沿着每个序列进行延伸，只要累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(—对匹配残基的奖励得分；总是〉0)和N(错配残基的惩罚得分；总是<0)进行计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积得分。每个方向上的字命中的延伸在下述情况时停止累积比对得分与其达到的最大值相比减少量X，由于一个或多个负评分残基比对，累积得分变成零或零以下，或达到任一序列的末端。除了计算序列同一性百分比，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin&Altschul(1993)。由BLAST算法提供的一种相似性测量值是最小和概率(P(N)),其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果测试核酸序列与参照核酸序列的比较中的最小和概率小于约0.1、更优选地小于约O.Ol、最优选地小于约0.001,则测试核酸序列^皮-魄为与参照序列相似。为了获得用于比较目的的有缺口比对，可以如Altschul等人(1997)中所述来使用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。可替代地，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用于执行检测分子之间的遥远关系的迭代检索。参见Altschul等人，同上。当使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)的缺省参数。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、截止值100、M=5、N=-4、和2条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10、和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(参见Henikoff&Henikoff，1989)。参见http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。特别地，除了保守变异，多肽可以是基本上相关的。保守变异指氨基酸残基由另一个生物学相似残基替换。保守变异的例子包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或曱疏氨酸取代另一个，或一个极性残基取代另一个，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。保守取代的其他举例说明性例子包括下述变化丙氨酸改变为丝氨酸；精氨酸改变为赖氨酸；天冬酰胺改变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸改变为谷氨酸；半胱氨酸改变为丝氨酸；谷氨酰胺改变为天冬酰胺；谷氨酸改变为天冬氨酸；甘氨酸改变为脯氨酸；组氨酸改变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸改变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸改变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸改变为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；曱硫氨酸改变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸改变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸改变为苏氨酸；苏氨酸改变为丝氨酸；色氨酸改变为酪氨酸；酪氨酸改变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸改变为异亮氨酸改变为亮氨酸。在一个实施方案中，本发明多核苷酸为在特定宿主中表达而进行优化。如本文所使用的，优化包括密码子优化以及在真核细胞中，Kozak序列和/或一个或多个内含子的引入。因此，核酸分子可以具有在超过30°/。、35%、40%或超过45%,例如50%、55%、60%或更多的密码子上不同于编码未修饰的萤光素酶的野生型核酸序列的密码子组成。用于在本发明中使用的优选密码子是对于特定生物中的相同氨基酸比至少一个其他密码子更频繁使用的那些，并且更优选地，也不是那种生物中的低使用密码子并且不是该生物中用于克隆或篩选核酸分子表达的低使用密码子。此外，某些氨基酸(即，具有3个或更多密码子的那些氨基酸)的优选密码子可以包括比其他(非优选)密码子更频繁使用的两个或更多密码子。核酸分子中在一种生物中比另一种生物中更频繁使用的密码子的存在导致这样的核酸分子即当引入更频繁地使用那些密码子的生物的细胞内时，所述核酸分子在那些细胞中表达的水平高于野生型或亲本核酸序列在那些细胞中的表达。在本发明的一个实施方案中，不同的密码子是在哺乳动物中更频繁使用的那些，而在另一个实施方案中，不同的密码子是在植物中更频繁使用的那些。特定类型的哺乳动物，例如人可以具有与另一种类型的哺乳动物不同组的优选密码子。同样地，特定类型的植物可以具有与另一种类型的植物不同组的优选密码子。在本发明的一个实施方案中，不同的密码子中的大多数是在所需宿主细胞中的优选密码子。用于哺乳动物(例如，人)和植物的优选密码子是本领域已知的(例如，Wada等人，1990)。例如，优选的人密码子包括但不限于，CGC(Arg)、CTG(Leu)、TCT(Ser)、AGC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCC(Ala)、GGC(Gly)、GTG(Val)、ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAG(Gln)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)和TTC(Phe)(Wada等人，1990)。因此，本发明优选的"人源化"合成核酸分子通过具有增加数目的优选的人密码子而具有不同于野生型核酸序列的密码子组成，所述优选的人密码子例如CGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、GAG、GAC、TAC、TGC、TTC、或其任何组合。例如，相对于野生型核酸序列，本发明核酸分子可以具有增加数目的编码亮氨酸的CTG或TTG密码子、编码缬氨酸的GTG或GTC密码子、编码甘氨酸的GGC或GGT密码子、编码异亮氨酸的ATC或ATT密码子、编码脯氨酸的CCA或CCT密码子、编码精氨酸的CGC或CGT密码子、编码丝氨酸的AGC或TCT密码子、编码苏氨酸的ACC或ACT密码子、编码丙氨酸的GCC或GCT密码子、或其任何组合。类似地，具有增加数目的在植物中更频繁使用的密码子的核酸分子通过具有增加数目的植物密码子而具有不同于野生型核酸序列的密码子组成，所述植物密码子包括但不限于CGC(Arg)、CTT(Leu)、TCT(Ser)、TCC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCT(Ser)、GGA(Gly)、GTG(Val)、ATC(He)、ATT(lie)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAA(Gin)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)、TTC(Phe)、或其任何组合(Murray等人，1989)。优选密码子对于不同类型的植物可以是不同的(Wada等人，1990)。本发明经修饰的萤光素酶蛋白质或融合蛋白可以通过重组方法或通过固相化学肽合成方法进行制备。此种方法自二十世级60年代早期已是本领域已知的(Merrifield,1963)(还参见Stewart等人，SolidPhasePeptideSynthesis,第2版，PierceChemicalCo.,Rockford,Ill.，第11-12页))，并且近期已用于商购可得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearchBiochemicals)中。此种商购可得的实验室试剂盒一般使用Geysen等人(1984)的教导，并且提供用于在许多"杆(rods)"或"针(pins)"的尖端上合成肽，所有这些杆或针与单个板连接。当使用此种系统时，杆或针的板^^皮倒置并且插入相应孔或储存器的笫二块板内，所述孔或储存器包含用于使合适的氨基酸与针或杆的尖端附着或锚定的溶液。通过重复此种加工步骤，例如倒置且将杆和针的尖端插入合适的溶液内，氨基酸被构建成所需肽。此外，许多可用的FMOC肽合成系统是可用的。例如，多肽或片段的装配可以使用A卯liedBiosystems，Inc.Model431A自动化肽合成仪在固体支持物上进行。此种设备通过直接合成或通过合成可以使用其他已知技术偶联的一系列片段容易制备本发明肽。III.对本发明经修饰的萤光素酶有用的融合配偶体编码经修饰的萤光素酶的本发明多核苷酸可以与其他核酸序列一起使用，所述其他核酸序列例如天然序列例如cDNA或已进行体外操作的那种，所述操作例如用于制备N末端、C末端、或N和C末端融合蛋白，例如与由不同的报道基因，包括选择标记编码的蛋白质的融合物。合适的融合配偶体的许多例子是本领域已知的并且可以在本发明的实践中使用。融合配偶体包括但不限于亲和结构域或其他功能性蛋白质序列，例如具有酶促活性的那些。例如，功能性蛋白质序列可以编码激酶催48化结构域(Hanks和Hunter,1995),产生可以给特定氨基酸酶促添加磷酸部分的融合蛋白，或可以编码Src同源性2(SH2)结构域(Sadowski等人，1986;Mayer和Baltimore,1993)，产生与磷酸化酪氨酸特异性结合的融合蛋白。亲和结构域一般是可以与结合配偶体，例如固定在固体支持物上的结合配偶体相互作用的肽序列。编码多个连续单氨基酸例如组氨酸的DNA序列，当与表达的蛋白质融合时，可以通过与树脂柱例如镍琼脂糖的高亲和力结合而用于重组蛋白质的单步纯化。编码肽，例如壳多糖结合结构域(其与壳多糖结合)、谷胱甘肽-S-转移酶(其与谷胱甘肽结合)、生物素(其与亲和素和链霉亲和素结合)等的序列，还可以用于促进目的蛋白质的纯化。亲和结构域可以通过本领域众所周知的方法与目的蛋白质分开，所述方法包括内含肽(蛋白质自我剪接元件(Chong等人，1997)的使用。示例性亲和结构域包括HisV5(HHHHH)(SEQIDNO:4),HisX6(HHHHHH)(SEQIDNO:5),C-myc(EQKLISEEDL)(SEQIDNO:6),Flag(DYKDDDDK)(SEQIDNO:7),SteptTag(WSHPQFEK)(SEQIDNO:8)，血凝素，例如HA标记(YPYDVPDYA)(SEQIDNO:9),GST，硫氧还蛋白，纤维素结合结构域，RYIRS(SEQIDNO:10)，Phe画His画His-Thr(SEQIDNO:11),壳多糖结合结构域，S-肽，T7肽，SH2结构域，C-末端RNA标记，WEAAAREACCRECCARA(SEQIDNO:12)，金属结合结构域，例如锌结合结构域或钓结合结构域，例如来自钓结合蛋白的那些，所述钙结合蛋白例如4丐调蛋白、肌钓蛋白C、钙依赖磷酸酶B、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S-调节蛋白(modulin)、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、海马钓蛋白、常见蛋白(frequenin)、钙牵蛋白、钙激活中性蛋白酶大亚基、S100蛋白质、小清蛋白、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K、和钙视网膜蛋白，内含肽，生物素，链霉亲和素，MyoD,Id,亮氨酸拉链序列，和麦芽糖结合蛋白。在一个实施方案中，融合配偶体是用于纯化融合蛋白的序列，例如His或GST标记，并且在一个实施方案中，纯化标记与环状变换萤光素酶的N或C末端融合。另一类融合配偶体包括由报道基因编码的蛋白质，所述报道基因包括但不限于weo基因、卩-gal基因、gz^基因、cw基因、gA基因、/7嫂基因、/n、Z)基因、We基因、m/W基因、6w基因、腈水解酶基因、吡喃半乳糖苷基因、木糖苷酶基因、胸苦激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)或乙酰乙酸合酶基因(AAS)、氨甲蝶呤抗性cZ/^基因、茅草枯脱由素酶基因、赋予对5-甲基色氨酸的抗性的突变邻氨基苯甲酸合酶基因(WO97/26366)、R-基因座基因、卩-内酰胺酶基因、；cy氾基因、a-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因、珊瑚虫萤光素酶(/wc)基因(例如，海肾萤光素酶基因)、水母发光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、或绿色荧光蛋白基因。在术语可选或可筛选标记基因内也包括的编码"可选标记"的基因，其分泌可以作为鉴定或选择转化细胞的方法进行检测。例子包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原的标记，或甚至可以通过其催化活性进行^r测的可分泌酶。可分泌蛋白质包括在许多类别内，包括例如可通过ELISA检测的小的、可扩散蛋白质，和插入或捕获在细胞膜中的蛋白质。IV.编码经修饰的萤光素酶或其融合物的载体和宿主细胞一旦制备编码经修饰的萤光素酶或其融合物的所需核酸分子后，就制备编码经修饰的萤光素酶或包含经修饰的萤光素酶的融合蛋白的表达盒。例如，包含编码经修饰的安光素酶的核酸序列的核酸分子任选与转录调节序列可操作地连接，以形成表达盒，所述转录调节序列例如一种或多种增强子、启动子、转录终止序列或其组合。可以将核酸分子或表达盒引入载体例如质粒或病毒载体中，所述载体任选包括可选标记基因，并且将载体引入目的细胞中，所述目的细胞例如原核细胞例如大肠杆菌、链霉菌属物种(S^e/7fomyc^spp.)、芽孢杆菌属物种(5acz'〃uyspp.)、葡萄球菌属物种(Stap/z_y/ococci^spp.)等,以及真核细胞包括植物(双子叶植物或单子叶植物)，真菌，酵母例如毕赤酵母属(尸zc/n'a)、糖酵母属(S"cc/zaramyc^)或裂殖酵母属(Sc/^o卵cc/mramycw),或哺乳动物细月包。优选的哺乳动物细月包包才舌牛、山羊、绵羊、犬、猫、非人灵长类动物例如猿猴和人细胞。优选的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、COS、293、Hela、CV-1、SH國SY5Y、HEK293和NIH3T3细胞。编码的经々务饰的愛光素酶的表达可以由能够在原核细月包或真核细胞中表达的任何启动子控制。优选的原核生物启动子包括但不限于SP6、T7、T5、Mc、Wa、frp、ga/、/ac或麦芽糖启动子。优选的真核生物启动子包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子，例如CMV、SV40和RSV启动子，以及调节型启动子，例如i秀导型或阻遏型启动子例如tet启动子、hsp70启动子和由CRE调节的合成启动子。本发明的核酸分子、表达盒和/或载体可以通过任何方法引入细胞中，所述方法包括但不限于钓介导的转化、电穿孔、显微注射、脂转染等。V示例性用途经修饰的萤光素酶或其融合物对于以下任何目的有用，包括但不限于检测特定分子的量或存在(生物传感器)，分离特定分子，检测特定分子中例如由于结合、磷酸化或电离导致的构象变化，促进高或低通量筛选，检测蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA或其他基于蛋白质的相互作用，或选择或进化生物传感器。例如，经修饰的萤光素酶或其融合物用于例如在体外或基于细;l包的测定中^r测特定激酶(例如，通过将激酶位点插入报道蛋白质内)，RNAi(例如，通过将怀疑由RNAi识别的序列插入报道蛋白质的编码序列内，随后监控RNAi添加后的报道物活性)，或蛋白酶的量、存在或活性，例如检测特定病毒蛋白酶的存在，其依次是病毒或抗体的存在的指示剂；篩选抑制剂，例如蛋白酶抑制剂；鉴定识别位点或检测底物特异性，例如使用具有所选择的识别序列的经修饰的萤光素酶或具有多个不同序列的经修饰的萤光素酶文库与单个目的分子或多个分子(例如，文库)；选择或进化生物传感器或目的分子，例如蛋白酶；或在体外或基于细胞的方法中经由互补或结合来检测蛋白质-蛋白质相互作用。在一个实施方案中，使包括插入的经修饰的安光素酶与分子的随机文库或突变文库接触，并且鉴定与插入相互作用的分子。在另一个实施方案中，使具有多个插入的经修饰的萤光素酶文库与分子接触，并且鉴定与分子相互作用的经修饰的萤光素酶。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶或其融合物用于例如在体外或基于细胞的测定中检测cAMP或cGMP的量或存在(例如，通过将cAMP或cGMP结合位点插入环状变换萤光素酶内)，筛选抑制剂或活化剂，例如cAMP或cGMP抑制剂或活化剂、与cAMP结合位点结合的cAMP的抑制剂或活化剂、或G蛋白偶联受体(GPCR)的抑制剂或活化剂，鉴定识别位点或检测底物特异性，例如使用具有所选择的识别序列的经修饰的萦光素酶或具有多个不同序列的经修饰的萤光素酶文库与单个目的分子或多个分子(例如，文库)，以选择或进化cAMP或cGMP结合位点，或用于全动物成像中。51本发明还提供了使用经修饰的萤光素酶或其融合蛋白，监控分子在细胞中的表达、定位和/或运输，以及监控细胞内的微环境的变化的方法。在一个实施方案中，经修饰的萤光素酶包含分子的识别位点，并且当该分子与识别位点相互作用时，导致活性的增加，并且因此可以用于检测或测定分子的存在或量。例如，在一个实施方案中，经修_饰的萤光素酶包含含有两个结构域的内部插入，所述两个结构域在某些条件下彼此相互作用。在一个实施方案中，插入中的一个结构域包含可以磷酸化的氨基酸，并且另一个结构域是磷酸氨基酸结合结构域。在合适的激酶或磷酸酶的存在下，插入中的两个结构域相互作用且改变经修饰的萤光素酶的构象，导致经修饰的萤光素酶的可检测活'性的改变。在另一个实施方案中，经修饰的萤光素酶包含分子的识别位点，并且当该分子与识别位点相互作用时，导致活性的增加，并且因此可以用于检测或测定另一种分子的存在或量。双杂交系统是用于在体内检测蛋白质蛋白质相互作用以及鉴定涉及蛋白质蛋白质相互作用的残基/结构域的特别有力的方法。双杂交系统的基础是在某些转录因子中发现的调节结构域与特定DNA序列结合的DNA结合结构域，和与基本转录机制(Sadowski，1988)相互作用的转录活化结构域。与DNA结合结构域締合的转录活化结构域可以促进RNA聚合酶II复合物在TATA盒上的装配且增加转录。在CheckMate哺乳动物双杂交系统(PromegaCorp.,Madison，WI)中，当与DNA结合结构域融合的一种蛋白质("X")与第二种蛋白质("Y，，)相互作用时(所述第二种蛋白质与转录活化结构域融合)，由分开的质粒产生的DNA结合结构域和转录活化结构域是紧密结合的。在这个系统中，蛋白质X和Y之间的相互作用导致报道基因或可选标记基因的转录。特别地，pBIND载体包含多克隆区域上游的酵母GAL4DNA结合结构域，并且pACT载体包含多克隆区域上游的单纯疱渗病毒VP16活化结构域。此外，pBIND载体表达海肾荄光素酶。将编码2种潜在相互作用的目的蛋白质的2种基因克隆到pBIND和pACT载体内，以产生分别具有GAL4的DNA结合结构域和VP16的活化结构域的融合蛋白。pG5/wc载体包含最小TATA盒上游的5个GAL4结合位点，其依次是萤火虫萤光素酶基因(/wc+)的上游。将pGAL4和pVP16融合构建体连同pG5/wc载体一起转染到哺乳动物细胞内。转染后2-3天，细胞被裂解，52并且海肾萤光素酶和萤火虫萤光素酶的量可以使用Dual-Luciferase报道物测定系统(Promega目录弁E1910)进行定量。2种测试蛋白质如GAL4和VP16融合构建体之间的相互作用，导致萤火虫萤光素酶表达超过阴性对照的增加。本发明经修饰的萤光素酶，例如在对修饰耐受的位点或区域上缺失的那种(N末端片段)与DNA结合结构域融合，而萤光素酶的其余部分(C末端片段)与转录活化结构域融合。本发明还提供了筛选能够调节目的分子例如环状核苷酸的量的试剂("测试"试剂)的方法。"调节"指性质的改变；生物或化学活性的此种增强或抑制，其中改变在特定事件的发生上可以是偶然的，例如信号转导途径的活化，和/或仅在特定细胞类型中表现。"调节剂"指试剂(天然存在的或非天然存在的)，例如生物大分子(例如，核酸、蛋白质、非肽、或有机分子)，小分子，由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物，或任何其他试剂。调节剂通过包括在本文描述的筛选测定中评估作为生物过程的抑制剂或活化剂(直接或间接)(例如，激动剂、部分拮抗剂、部分激动剂、或拮抗剂)的潜在活性。调节剂的活性可以是已知的、未知的或部分已知的。此种调节剂可以使用本发明方法进行筛选。术语"测试试剂"指通过本发明的一种或多种筛选方法测试为假定调节剂的试剂。通常，各种预定浓度用于筛选，例如O.OlpM、0.1^M、1.0nM和10.0pM。对照可以包括在不存在测试试剂的情况下的信号测量，与已知调节耙的试剂比4支，或在与测试试剂接触之前、之时和/或之后与样品(例如细胞、组织或生物)比较。在一个实施方案中，该方法包括筛选调节蛋白酶活性的试剂。例如，在一个实施方案中，提供了鉴定能够调节凋亡的试剂的方法。胱天蛋白酶家族蛋白酶已与凋亡相关。因此，该方法包括使怀疑包含胱天蛋白酶家族蛋白酶的样品与怀疑调节胱天蛋白酶活性的试剂、和具有可由胱天蛋白酶切割的切割位点的经修饰的萤光素酶接触。经修饰的萤光素酶的活性在与测试试剂接触前和后在样品中进行检效'J。与试剂接触后活性的增加指示抑制凋亡的试剂，并且活性的减少指示激活凋亡的试剂。因此，本发明提供了用于鉴定试剂且检测其活性的筛选系统，所述试剂调节本发明经修饰的萤光素酶蛋白质中存在的识别序列的切53割。这允许快速筛选蛋白质活性调节剂。本文描述的筛选系统的使用提供了鉴定调节(例如，抑制或激活)蛋白酶例如胱天蛋白酶家族蛋白质的试剂的敏感和快速方法。本发明经修饰的萤光素酶蛋白质因此用作底物，以研究调节经修饰的萤光素酶蛋白质中的插入和目的分子之间的相互作用的试剂或条件。特别地，本发明考虑了其中插入包括一种氨基酸序列的经修饰的营光素酶蛋白质，所述氨基酸序列是目的酶的切割位点。因此，当目的分子是蛋白酶时，插入包括包含蛋白酶的切割识别序列的肽。蛋白酶的切割识别序列是在蛋白水解切割期间由蛋白酶识别的特定氨基酸序列。因此，本发明提供了测定样品中的蛋白酶的量的方法，该方法通过使样品与本发明经修饰的萤光素酶多肽接触且测量萤光素酶活性的改变。本发明经修饰的萤光素酶蛋白质可以用于监控表达经修饰的萤光素酶的细胞内的蛋白酶活性等。在一个实施方案中，本发明经修饰的萤光素酶因此用作底物，以研究调节经修饰的萤光素酶中的环状核苷酸结合位点和目的分子例如环状核苷酸之间的相互作用的试剂或条件、调节环状核苷酸的存在或量的试剂或条件，或者调节与细胞内环状核苷酸浓度相关的分子例如受体的试剂或条件。特别地，本发明考虑了其中插入包括cAMP或cGMP结合位点的经修饰的萤光素酶蛋白质。因此，当目的分子是cAMP或cGMP时，本发明提供了测定样品中的cAMP或cGMP的存在或量的方法，该方法是通过使样品与本发明经修饰的萤光素酶多肽接触且测量萤光素酶活性的改变。本发明经修饰的萤光素酶蛋白质可以用于监控cAMP或cGMP的量或存在，或者改变具有经修饰的萤光素酶的细胞内的cAMP或cGMP的量或存在的分子的量或存在等等。本发明的测定可以用于筛选药物，以鉴定改变例如环状核苷酸的量或改变环状核苷酸与环状核普酸结合位点的结合的化合物。在一个实施方案中，测定在体外对包含cAMP的样品进行。使包含已知量的cAMP的样品与本发明经修饰的萤光素酶和测试试剂混合。随后测定样品中的萤光素酶活性的量。随后在测试试剂的存在下的每摩尔cAMP的活性的量可以与在不存在测试试剂的情况下的每摩尔cAMP的活性的量进行比较。差异指示测试试剂改变cAMP的量或cAMP与cAMP结合位点的结合。在一个实施方案中，细胞用试剂调节或与试剂进行接触，所述试剂怀疑直接或间接调节例如cAMP量或结合。培养中的细胞进行裂解并且测量cAMP量。例如，使包含已知或未知量的cAMP的裂解细胞样品与本发明经修饰的萤光素酶混合。样品中的cAMP的量随后如上所述进行测定，该测定是通过测定对照或未处理样品和处理的裂解细胞样品中经修饰的萤光素酶活性的程度。活性或抑制可以基于样品中的每微克或毫克蛋白质进行计算。一般地，差异针对标准测量进行校正以产生cAMP的绝对量。盒。此种试剂盒可以包含载体工具，其含有一种或多种容器工具，例管形瓶、管等，每个容器工具包含在该方法中使用的分开元件之一。容器之一包含本发明经修饰的萤光素酶或多核苷酸(例如以载体的形式)。第二个容器可以包含经修饰的萤光素酶的底物。本发明将通过下述非限制性实施例进行进一步描述。实施例I在叩头虫和萤火虫萤光素酶中对修饰耐受的位点叩头虫和萤火虫萤光素酶中对修饰耐受的位置和某些经修饰的萤光素酶公开于美国公开申请20050153310和PCT/US2004/032705中，所述专利的公开内容合并入本文作为参考(还参见图l和表l)。表1萤火虫萤光素酶中氨基酸后的插入_活性％7121233267294303361540541105-1050-75235-103画51575实施例II与cAMP结合位点的环状变换萤火虫萤光素酶融合物cAMP是用于细胞信号转导的最重要的笫二信使之一。cAMP测定对于G蛋白偶联的受体(GPCR)药物开发特别重要。为了鉴定cAMP的生物传感器，使cAMP结合位点与环状变换萦火虫萤光素酶(CPM-FFLuc)融合(图5A画B)(pBFB8、pBFB9、pBFB10、pBFBll、pBFB22、pBFB40、pBFB41、pBFB42)。一种CPM-FFLuccAMP结合位点融合物使用来自人Epacl的cAMP结合位点(由cAMP直接激活的交换蛋白质)(Bos,2003)。先前研究显示来自人Epacl的单链片段(残基157-316)结合cAMP(Nikolaev,J.Biol.Chem,，279,37215(2004))。第二种CPM-FFLuc/cAMP结合位点融合物使用来自人PKA调节性IIB型亚基的B结构域(CPM-FFLuc/RII卩B)。材料与方法合成编码人Epacl的残基157-316的DNA片段，其包括某些沉默核苷酸变化以潜在增加在大肠杆菌中的表达(图5C)。两个引物用于产生在5'和3'末端上分别具有Z/zoI和位点的EPAC1的PCR片段5'引物atgcctcgagGAAGAAGAACTTGCTGAAGCTG(SEQIDNO:22)3'引物atgccatggAACTCCATGTTCTTCTAAACGC(SEQIDNO:23)所得到的PCR片段进行消化且克隆到环状变换甲虫萤光素酶构建体的X/zoI和Wcol位点内。所得到的质粒表达具有插入原始N和C末端之间的EPAC1的经修饰的萤火虫(pSPLuc十，PromegaCorporation)萤光素酶。融合蛋白的正确大小通过TnT无细胞表达和SDS-PAGE进行^S正(图6)。这种构建体鉴定为FF105。将编码RII卩B的DNA插入编码CPM-FFLuc/RII卩B融合物[Luc2.0(234-544)-接头X-人RII卩(残基266-414)-接头Y-Luc(4-233)]的新表达载体内。通过使用限制酶的独特组合，产生具有RIipB的各种构建体，所述RIipB与具有各种X/Y肽接头长度的CPM-FFLuc融合。用于后续插入RII(3B的CPM-FFLuc表达质粒的合成编码CPM-FFLuc的合成1816bp片段(DNA2.0;SEQIDNO:16,参见图20)用仏'm/ni/Z6al进行消化，并且与pGL4.74(PromegaCorp.)的3265bp///^mi/X^I片段连接。所得到的质粒编码合成通过42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽与萤火虫萤光素酶的氨基酸544和4连接的合成萤光素酶(Luc2.0;PromegaCorp.)的环状变换突变体[Luc2.0(234-544)陽42aa富含Gly/Ser的肽國Luc2,0(4-233)](pBFB8)。图5A描述了这种亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)和用于制备各种接头长度且插入cAMP结构域的独特限制位点。这种融合蛋白可以在体外或体内分别使用T7或HSV-TK启动子进行表达。此外，Sg/I和尸mel限制酶位点包括在5'和3'末端上，以促进这种可读框后续转移至另外的质粒(Flexi载体系统；PromegaCorp.)。编码具有(X-4、Y-4;pBFB9)、(X=10,Y=10;pBFB10)和(X=20,Y=20;pBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII阳融合蛋白的质粒合成上述质粒DNA构建体用连接编码Luc2.0(233-544)和Luc2.0(4-233)的DNA片段的多克隆位点(MCS)中存在的独特限制酶进行消化，以允许合成具有(X=4,Y=4)、(X=10,Y=10)和(X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII|3B表达构建体。图5B描述了侧接RII卩B结构域以制备pBFB9的接头长度(X=4,Y=4)、pBFB10(X=10,Y=10)和pBFBll(X=20，Y=20)。为了合成具有(X=4，Y=4)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAAGTCGACCGGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC-3'(SEQIDNO:25;BFB51)和5'隱AAAAAAGAGCTCCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC國3'(SEQIDNO:26;BFB20)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII卩BDNA。所得到的产物用&/I/SacI限制酶进行消化且连接到用X/zoIASacI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。这种新构建体鉴定为pBFB9。为了合成具有(X^10,Y40)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAATCCGGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC-3'(SEQIDNO:211;BFB21)和5'-AAAAAAAGGCCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC-3'(SEQIDNO:27;BFB22)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII卩BDNA。所得到的产物用5^EIASVwI限制酶进行消化且连接到用SwEI/Zral消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。这种新构建体鉴定为pBFB10。57为了合成具有(X-20,Y二20)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAACCCGGGATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC-3'(SEQIDNO:28;BFB23)和5'画AAAAAATCCGGACCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC國3'(SEQIDNO:29;BFB24)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII)3BDNA。所得到的产物用^/^IASmal限制麟进行消化且连接到用JgeWnJ消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。这种新构建体鉴定为pBFBll。具有(X=4,Y=4)、(X=10,Y=10)和(X=20,Y-20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIIBB融合蛋白的表达预期大小的融合蛋白的合成使用TNTT7偶联的麦芽提取物系统(PromegaCorp.)连同FluoroTectGreenLys体夕卜翻i奪标记系统(PromegaCorp.)证实具有(X=4,Y=4;pBFB9)、(X=10,Y=10;pBFB10)和(X=20,Y=20;pBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII(3B融合蛋白。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配400ng质粒DNA10pLTnT麦芽提取物0.8TNT反应緩冲液0.4^LT7聚合酶0.4nL氨基酸混合物0.4rRNasin0.4(iLFluoroTectGreenLys标记dH20至20总体积于30。C温育1.5小时后，5TNT反应根据制造商的方案(NuPAGENovex4-12%bis-tris凝胶，InvitrogenCorp.)经由SDS-PAGE进行分辨。翻i奪的蛋白质随后经由荧光成傳、义(fluorimager)(TyphoonVariableModeImager,AmershamBiosciences)进行显现。光密度测定分析(ImageQuant,GEHealthcare)指出具有可变X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白类似于具有42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽(pBFB8)和Epacl(FF105)的CPM-FFLuc融合蛋白表达。具有(X=4,Y=4;pBFB9)、(X=10,Y=10;pBFB10)和(X=20,Y=20;pBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RHBB融合蛋白的功能表征对于具有(X=4,Y=4:pBFB9)、(X=10.Y=10;dBFBIO)和(X=20,Y=20;oBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白，使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)测量在100cAMP的存在和不存在下的萤光素酶活性。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配400ng质粒DNA10兔网织红细胞提取物0.8(iLTNT反应緩冲液0.4^LT7聚合酶0.4氨基酸混合物0.4rRNasindH20至20|iiL总体积于30。C温育1.5小时后，各自的融合蛋白在100pMcAMP的存在或不存在下进行温育，该温育是通过使9TNT⑧反应与1|iL1mMcAMP原液或dH20组合。在室温下温育10分钟后，将1jiiL样品加入100(iL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液+/-100cAMP(90LAR+101mMcAMP原液或dH20中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。使用具有(X:4,Y-4;pBFB9)、(X=10,Y=10;pBFB10)和(X=20,Y=20;pBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RHBB融合蛋白的剂量反应实验具有(X二4,Y-4;dBFB9)、(X=10,Y=10;pBFB10)和(X=20.Y=20;dBFBII)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白的cAMP剂量反应4吏用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在表达后进行测量。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配2000ng质粒DNA50|iL兔网织红细胞提取物4uLTNT反应緩冲液592^T7聚合酶2氨基酸混合物2|uLrRNasindH20至100pL总体积于3(TC温育2小时后，各自的融合蛋白与各种浓度的cAMP—起温育，该温育是通过使9^LTnT⑧反应与1pLcAMP原液(0、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10、25或100^McAMP的终浓度)组合。在室温下温育>25分钟后，将1样品加入具有各自的cAMP浓度(90pLLAR+10cAMP原液)的100萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。具有(X40,Y-10;pBFB10)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII阳融合蛋白的选择性相对于其他环状核苷酸，具有(X=10,Y=10;pBFB10)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII(3B融合蛋白对于cAMP活化的选择性使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在表达后进行测量。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配6000ng质粒DNA150nL兔网织红细胞提取物12nLTNT反应緩冲液6pLT7聚合酶6pL氨基酸混合物6pLrRNasindH20至300总体积于3CTC温育2.3小时后，融合蛋白与各种浓度的cAMP、cGMP或N6-苯曱酰cAMP—起温育，该温育是通过使9^LTnT⑧反应与1环状核苷酸原液(O、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10、25或100pMcAMP的终浓度)组合。在室温下温育》29分钟后，将1^L样品加入具有各自的环状核苷酸浓度(90LAR+10核糖核苷酸原液)的100pL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中。发光使用Veritas孩吏量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright画Glo)进行测量。结果蛋白质激酶A调节性II卩型亚基(PRKAR2B)具有两个cAMP结合位点，即A和B。来自B结构域(RII|3B)的cAMP结合位点用于制备具有RII|3B的环状变换萤光素酶(CPM-FFLuc)(CPM-FFLuc/RII卩B)。具有(X=4,Y=4;pBFB9)、(X=10，Y=10;pBFB10)和(X=20,Y=20;pBFBll)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白各自显示在100cAMP的存在下萤光素酶活性分别23、58和39倍的诱导。如预期的，对于具有42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽的CPM-FFLuc融合蛋白(pBFB8)没有观察到cAMP调节。除了RII卩B夕卜，来自Epacl的cAMP结合位点用于产生cAMP传感器(FF105)。然而，萦光素酶活性的诱导倍数小于基于RIIPB的传感器(图7)。对于50%最大诱导倍数的有效浓度，每种CPM-FFLuc/RIIpB融合蛋白显示出具有变量值的独特剂量反应(图8A)。相对于其他环状核苷酸，具有(X=10,Y=10;pBFB10)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIIpB融合蛋白显示出对于与cAMP结合的增强的选择性(图8B)。实施例III具有cAMP结合位点的环状变换海肾萤光素酶材料与方法4种人源化海肾萤光素酶DNA片段由pF5RK或phRL空载体(PromegaCorp.)进行扩增，并且克隆到CPM-FFLuc融合蛋白构建体内=[Luc2.0(234-544)-42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽-Luc2.0(4-233)](pBFB8;图5A),以产生在位置Ser91/Tyr92或Ile223/Pro224之间分裂的环状变换海肾萤光素酶可读框(CPM-hRL)(图5D)。用于产生4种人源化海肾萤光素酶DNA片段的测序引物是5'-ATGGGCGATCGCCatgtatcgcctcctggatcactacaag画3'(hRL92Sg/I;FF273;SEQIDNO:110);5'-ATGGGCGATCGCCatgcctctcgttaagggaggcaagc誦3'(hRL224Sg/I;FF277;SEQIDNO:111);615'-gcatCTCGAGccctgctcgttcttcagcacgcgc-3'(hRL311/Z/wI;FF294;SEQIDNO:112);5'-atgcGAGCTCaggagcttccaaggtgtacgacccg國3'(hRL2Sacl;FF295;SEQIDNO:113);5'誦TTGTGTTTAAACtgagccattcccgctcttgccg-3'(hRL91/尸wel;FF276;SEQIDNO:114);和5'-TTGTGTTTAAACgatctcgcgaggccaggagagg國3'(hRL223FF278;SEQIDNO:115)。引物对FF273/FF294和FF277/FF294用于扩增人源化海肾萤光素酶DNA的C末端片段(分别为hRL92-311和hRL224-311)。所得到的产物用Sg/7/Z/w/限制酶进行消化，并且连接到用Sg/7/X/w/消化的亲本CPM-FFLuc融合蛋白构建体=[Luc2.0(234-544)-42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽-Luc2.0(4-233)]，pBFB8内。引物对FF276/FF295和FF278/FF295用于扩增人源化海肾萤光素酶DNA的N末端片段(分别为hRL2-91和hRL2-223)。所得到的产物用S"d/尸we/限制酶进行消化，并且连接到用Sac/ZPme/消化的编码[hRL(92-311或224-311)-42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽-Luc2.0(4-233)〗的中间产物CPM-FFLuc/hRL质粒内。这导致CPM-hRL表达载体的产生，其中环状变换hRL萤光素酶片段通过42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽(等同于图5A的富含Gly/Ser的肽，201325.15.A1(CPM91);201325.15.B6(CPM223))进行融合。将编码人RII(3B氨基酸266-414(GenbankIDBC075800)的序列克隆到独特的限制酶位点的子集内，所述位点编码如前文对于CPM-FFLuc/RII(3BcAMP传感器所述的富含Gly/Ser的肽中存在的氨基酸(图5D)。所得到的构建体编码具有分别与RII|3B的N和C末端融合的、具有X=4,Y=20(201325.44.H6(CPM91);201325.33.C9(CPM223))、X=10,Y=4(201325.50.D12(CPM91);201325.54.E2(CPM223))或X40,Y=20(201325.58.E11(CPM91);201325.54.E12(CPM223))个富含Gly/Ser的接头的CPM-hRL/RIipB融合体(图5D)。此外，将全长hRL可读框克隆到编码Luc2.0(234-544)-42个氨基酸的富含Gly/Ser的肽-Luc2.0(4-233)的CPM-FFLuc表达质粒(201325.50.A7，图5A)的Sg/I/尸wel位点内。ljig纯化的质粒DNA/50pl麦芽TnT(Promega目录#L4140)反应用于表达蛋白质产物。麦芽TnT⑧反应在FluoroTectGreenLystRNA(Promega目录存L5001)的存在下于30。C进行1小时。CPM-hRL构建体连同下述对照一起进行表达具有X=10，Y=4(pBFB41)的CPM-FFLuc/RII(3B,全长海肾萤光素酶(201325.50.A7)，和"无DNA，，(阴性对照)。使15pl每种裂解物与1.5pl1mMcAMP(Promega目录存V642A,100nM终浓度)或水混合，并且在室温下温育IO分钟。将75piIX海肾萤光素酶测定裂解緩冲液(5X海肾萤光素酶测定裂解緩冲液(Promega目录^E291A)+水(Promega目录弁P119C)加入海肾萤光素酶反应和"无DNA"样品中，混合，并且将20pl每种混合物一式三份地加入96孔白色平底板中。将2pl具有X40，Y-4个接头的CPM-FFLuc/RII卩B样品(pBFB41)—式三份地加入96孔白色平底板中。将100海肾萤光素酶测定緩冲液+IX海肾萤光素酶测定底物(PromegaCorp.;目录#E2820)加入每个海肾萤光素酶和"无DNA"孔中。将100pl萤光素酶测定緩冲液加萤光素酶测定底物(PromegaCorp.;目录#E1500)加入包含具有X=10,Y=4个接头的CPM-FFLuc/RII卩B(pBFB41)的每个孔中。发光使用Veritas光度计进行测量。在cAMP温育前，使10pl每种裂解物在SDS-PAGE凝胶上大小分级分离。荧光蛋白质产物在Typhoon成像仪上显现。结果麦芽TnT⑧反应得到大约等量的每种构建体蛋白质。不存在来自"无DNA"样品的可见蛋白质产物。全长海肾萤光素酶构建体(201325.50.A7)导致比CPM-hRL91画42aa构建体(201325.15.A1)多约100倍的发光,和比CPM-hRL223-42aa构建体(201325.15.B6)多约100,000倍的发光。RII(3B构建体CPM-hRL91-4aa-RII卩B-20aa(201325.44.H6)和CPM-hRL91-10aa画RII卩B-20aa(201325.58.E11)与100pMcAMP—起温育时产生比水更多的发光(分别为115-146倍和100倍)。RII卩B构建体CPM-hRL223-4aa-RII卩B-20aa(201325.33.C9)、CPM-hRL223-10aa-RII卩B-4aa(201325.54.E2)和CPM-hRL223-10aa-R,-20aa(201325,54.E12)与100pMcAMP—起温育时产生比水多1.7-2.1倍的发光。与水比较，全长海肾萤光素酶(201325.50.A7)、CPM-hRL91-42aa(201325.15.A1)、和CPM-hRL223-42aa构建体(201325.15.B6)与cAMP—起温育时改变不超过1.3倍。具有X=10、Y=4个接头的构建体的CPM-FFLuc/RIIpB传感器(pBFB41)在cAMP的存在下产生多85-90倍的发光。"无DNA"反应具有低发光(比全长海肾萤光素酶小1，000,000倍)并且与cAMP—起温育时无改变(参见63图10)。实施例IV用CPM-FFLuc/RII卩BcAMP生物传感器体外4全测cAMP材料与方法为了证实cAMP测量在细胞裂解物中和细胞裂解物去污剂的存在下的功效，具有(X=10,Y=10;pBFB10)的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合蛋白使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)进行表达。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配且于30。C温育1.5小时1000ng质粒DNA25pL兔网织红细胞提取物2^LTNT反应緩冲液1pLT7聚合酶1nL氨基酸混合物1|iLrRNasindH20至50nL总体积为了模拟在去污剂介导的细胞裂解后cAMP测量的实验条件，下述组分在室温下与终浓度0、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10和25pM的cAMP混合。0.5^LTNT⑧表达的cAMP传感器19.5|iL麦芽提取物(PromegaCorp.;目录弁L4140，部分弁L411A)5^LcAMP原液25pLBright画Glo测定试剂(PromegaCorp.,目录#E2610)装配反应立即混合并且萤光素酶活性使用Turner20/20光度计以1次测量/秒进4亍连续观'J量(TurnerBiosystems)。在某些实验中，为了增强信号稳定性和发光，反应混合物包括4mM萤光素(PromegaBioscience)、2mM辅酶A(Sigma)、10mMATP(Pharmacia)、10mMDTT(Promega)、16mM硫酸镁、150mMHEPES、pH8.0(Fisher)、1%TergitolNlOl(Sigma)、1%MazuDFlOl、和1mMCDTA(Sigma)。体外翻译的CPM-FFLuc/RIipBcAMP生物传感器使用TnT偶联的兔网织红细胞系统(Promega)进行合成，其中对于50pi总反应体积使用1质粒DNA，并且在即将测定cAMP前加入反应混合物中(每100^1测定试剂添加1^翻译产物)。随后将100^测定试剂+传感器加入100pi细胞培养物或100pi在完全培养基(DMEM/F12+10%FBS)中稀释的cAMP。细胞培养对于体外分析，HEK-293细胞在96孔板中铺板，并且在具有10%FBS(Hyclone)的100piDMEM/F12(Invitrogen)中在37。C与5。/。C02的条件下生长至50-90%汇合。细胞用0.02-250pM福司柯林(Sigma)进行刺激，其中福司柯林在完全培养基中通过稀释2倍。4吏用cAMP的标准曲线使用0.005-50pMcAMP的浓度范围将lmMcAMP(Promega)稀释到具有10%FBS的完全DMEM/F12培养基内，其中cAMP通过2倍稀释进行系列稀释。使100plcAMP与100nl均质的cAMP发光测定试剂混合。结果CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器在各种裂解緩冲液中并且与各种安光素酶试剂一起起作用。此外，CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器以均质测定形式用于在体外检测cAMP(图9、11A和11B)。例如，使用麦芽提取物，萤光素酶活性的剂量依赖值在约3分钟内发生，具有0.025-25nMcAMP的cAMP检测的动态范围(图9)。在使用优化试剂制剂的另外例子中，对于具有X40，Y=4(pBFB41)的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器，cAMP的体外检测显示信号与本底比为20,EC5o为1.28(图11A)。类似地，使用相同的优化试剂制剂，对于具有乂=10，Y=10(pBFB10)的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII(3BcAMP传感器，cAMP的体外检测显示信号与本底比为ll，EC5o为0.64^M(图IIA)。本cAMP测定具有下述优点减少化合物干4尤的生物发光读出；均质单步形式；以及需要结合的特异性和诱导构象变化的能力。实施例V使用CPM-FFLuc/RII(3BcAMP生物传感器在细胞内检测cAMP浓度的变化细胞培养细胞在具有HEPES緩冲液(Invitrogen)与10%FBS的60mlDMEM/F12中在37。C与5。/。C02下进行培养。质粒将编码具有(X=10,Y=0)的X/Y接头长度的基于CPM-FFLuc/RII(3B的cAMP生物传感器的ORF转移至Flexi载体pF4K(Flexi载体系统；PromegaCorp.)。所得到的质粒构建体(pBFB141)利用上游CMV启动子用于在哺乳动物细胞中表达相关的cAMP生物传感器。转染细胞使用0.3plrra^It⑧-LTl试剂和0.15吗DNA/96孔板的孔，用rra^It⑧-LTl试剂(MIRUS)进行转染。允许细胞生长过夜且在第二天进行测定。生物传感器的调节转染后约l天，从培养箱中取出细胞且平衡至室温。100mM萤光素EF的5lal等分试样加入总共90jil细胞培养物+转染试剂中，以产生约5mg/mL萤光素的终浓度。细胞随后在室温下温育至少90分钟。在室温下90分钟后，发光的基线测量值使用96孔Veritas光度计(TurnerBiosystems;0.5秒/孔的整合时间)进行测量。细胞随后用10nM异丙肾上腺素(CalBiochem)、50mM福司柯林(Sigma)进行i秀导，或不诱导(0.1。/。DMSO，Sigma),并且连续测量发光约30分钟。30分钟后，将10mM普萘洛尔(Sigma)加入具有异丙肾上腺的细胞中，且将0.1%DMSO加入所有其他样品中。随后在接下来的30分钟连续测量发光。将50^M福司柯林的最终添加物加入异丙肾上腺/普萘洛尔样品中，且将0.1%DMSO加入所有其他样品中。随后在接下来的半小时连续测量发光。样品在12次重复的组中进行测量。异丙肾上腺素、普萘洛尔、福司柯林和DMSO的10x原液在lxPBS(Invitrogen)中进行制备。结果为了测量cAMP的细胞内浓度的变化，HEK293细胞用CPM-FFLuc/RII卩B(X=10,Y=0,pBFB141)构建体进行瞬时转染，随后用化合物进行处理，所述化合物已知通过GPCR活化增加细胞内cAMP浓度66<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>pBFB96X==2,Y=2GS-卿B-SG(SEQIDNO:131)pBFB97X==2,Y=4GS-RII卩B-GSSG(SEQIDNO:132)pBFB98X==2,Y=6GS-卿B-SGGSSG(SEQIDNO:133)pBFB99X==2，Y=8GS-R,-GGSGGSSG(SEQIDNO:134)pBFB100X==2,Y=10GS-RII|3B-GSGGSGGSSG(SEQIDNO:135)pBFB101X==4，Y=0GSTG-R叩B(SEQIDNO:136)pBFB102X==4,Y=2GSTG-卿B-SG(SEQIDNO:137)pBFB9X==4，Y=4GSTG-卿B隱GSSG(SEQIDNO:138)pBFB103X==4，Y=6GSTG-卿B-SGGSSG(SEQIDNO:139)pBFB104X==4,Y=8GSTG-RII阳-GGSGGSSG(SEQIDNO:140)pBFB39X=4,Y=10GSTG-RII阳-GSGGSGGSSG(SEQIDNO:141)pBFB105X==6,Y=0GSTGGS-卿B(SEQIDNO:142)pBFB106X==6，Y=2GSTGGS-R卿-SG(SEQIDNO:143)pBFB107X==6,Y=4GSTGGS-R,-GSSG(SEQIDNO:144)pBFB108X==6,Y=6GSTGGS-RIIpB-SGGSSG(SEQIDNO:145)pBFB109X==6,Y=8GSTGGS-RII(3B-GGSGGSSG(SEQIDNO:146)pBFB110X==6,Y=10GSTGGS-R卿-GSGGSGGSSG(SEQIDNO:147)pBFBlllX==8,Y=0GSTGGSGG-卿B(SEQIDNO:148)pBFB112X==8,Y=2GSTGGSGG-RII卩B-SG(SEQIDNO:149)pBFB113X==8,Y=4GSTGGSGG-卿B-GSSG(SEQIDNO:150)pBFB114x==8,Y=6GSTGGSGG-R,-SGGSSG(SEQIDNO:151)pBFB115x==8,Y=8GSTGGSGG-R,國GGSGGSSG(SEQIDNO:152)pBFB116x==8,Y=10GSTGGSGG-RIIpB-GSGGSGGSSG(SEQIDNO:153)pBFB117x==10,Y=0GSSGGSGGSG誦卿B(SEQIDNO:154)pBFB118x==10，,Y=2GSSGGSGGSG-R,-SG(SEQIDNO:155)pBFB41x==10，,Y=4GSSGGSGGSG-R,-GSSG(SEQIDNO:156)pBFB119X:=10，,Y=6GSSGGSGGSG-RII阳-SGGSSG(SEQIDNO:157)pBFB120x==10，,Y=8GSSGGSGGSG-RIIpB隱GGSGGSSG(SEQIDNO:158)pBFB10X:=10:,Y=10GSSGGSGGSG-RIIpB陽GSGGSGGSSG(SEQIDNO:159)pBFB128x==10:,Y=-2GSSGGSGGSG-RII卩B(266-412)(SEQIDNO:160)pBFB129x==10,,Y=-4GSSGGSGGSG-RII阳(266-410)(SEQIDNO:161)pBFB130x==10,,Y=-6GSSGGSGGSG隱(266-408)(SEQIDNO:162)68pBFB131X==10,Y==-8GSSGGSGGSG-卿B(266-406)(SEQIDNO:163)pBFB132X==10,Y==-10GSSGGSGGSG-R,(266-据)(SEQIDNO:164)pBFB133X==10,Y==-12GSSGGSGGSG-卿B(266-術)(SEQIDNO:165)pBFB134X==10,Y==-14GSSGGSGGSG-R,(266-400)(SEQIDNO:166)pBFB135x==12,Y==0GSSGGSGGSGGG-RII|3B(SEQIDNO:167)pBFB136x==14,Y==0GSSGGSGGSGGGSG-卿B(SEQIDNO:168)pBFB137x==16，Y==0GSSGGSGGSGGGSGGS-R,(SEQIDNO:169)pBFB138x==18，Y==0GSSGGSGGSGGGSGGSGG-卿B(SEQIDNO:170)pBFB139x=:20,Y==0GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG-R卿(SEQIDNO:171)(RII卩B对应GenbankIDAAH75800的氨基酸266-414)i.编码缺乏肽接头(X=0,Y=0;pBFB89)的基于CPM-FFLuc/RII6B的cAMP传感器的质粒合成为了合成缺乏肽接头(X=0,Y=0)的构建体，用3个分开的引物对扩增RII(3BDNA,以产生3种分开的PCR产物。引物对5'-CCTCGAACACCGAGCGACC-3'(SEQIDNO:31)和5'-GCAGTGACTCAATAAAGCTTTCATACATCTTCTTGGCCTTAATGAGAATCTCG-3'(SEQIDNO:18)用于产生产物#1;引物对5'-CGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC-3'(SEQIDNO:32)和5'-GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG國3'(SEQIDNO:33)用于产生产物2;并且引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTAGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC曙3'(SEQIDNO:34)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG-3(SEQIDNO:35)用于产生产物3。3种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sg/I/Z力"I限制酶进行消化，并且连接到用Sg/I/XMI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。ii.编码具有(X=2.Y=2:dBFB96)肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的质粒合成为了合成具有肽接头(X=2,Y=2)的构建体，3个分开的引物对用于扩增RII卩B,以产生3种分开的PCR产物。引物对5'-CCTCGAACACCGAGCGACC國3'(SEQIDNO:36;BFB31)和5'画CAATAAAGCTTT69CATACATCGAGCCCTTCTTGGCCTTAATGAGAATCTCG-3'(SEQIDNO:37;BFB120)用于产生产物1;引物对5'-CGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCTCGATGTATGAAAGCTTTATTG-3'(SEQIDNO:38;BFB119)和5'-CTTCTTAATGTTTTTGGCACCGGATACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG-3'(SEQIDNO:39;BFB122)用于产生产物2;并且引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTATCCGGTGCCAAAAACATTAAGAAG-3'(SEQIDNO:40;BFB122)和5'國GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG-3'(SEQIDNO:41;BFB34)用于产生产物3。3种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sg/I/X6al限制酶进行消化，并且连接到用Sg/I/XkI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。iii.编码具有(X=6,Y=6;pBFB108)肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIII3B的cAMP传感器的质粒合成为了合成具有肽接头(X二6,Y-6)的构建体，引物5'-AAAAAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC画3'(SEQIDNO:42;BFB123)和5'國AAAAAAGAGCTCCCTCCAGATACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG-3'(SEQIDNO:43;BFB124)用于PCR扩增RII卩BDNA。所得到的产物用Sa/IASacI限制酶进行消化，并且连接到用X/zoI/S"cI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。iv.编码具有(X=8,Y=8;pBFB115)肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIII3B的cAMP传感器的质粒合成为了合成具有肽接头(X-8,Y:8)的构建体，引物5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC-3'(SEQIDNO:44;BFB125)和5'-AAAAAAGAGCTCCCTCCAGATCCACCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG-3'(SEQIDNO:116;BFB126)用于PCR扩增RII卩BDNA。所得到的产物用Sall/Sacl限制酶进行消化，并且连接到用Z/wI/SacI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。v.编码具有集合「2x(x=0-5),2v(v=0-5)l中的肽接头长度的其余基于CPM-FFLuc/RII(3B的cAMP传感器的质粒合成对编码具有(X=0,Y=0)、(X=2，Y=2)、(X=4,Y=4)、(X=6,Y=6)、(X=8,Y=8)、和(X=10,Y=10)的肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒进行A72oI/^ZaI或Zm"I/Z6al限制酶消化。在每种情况下，限制酶消化产生两个片段编码RII(3B的C末端部分、接头Y、和Luc2.04-233片段的较小片段；和包含原始质粒的所有其余元件的较大片段，包括编码Luc2.0234-544、接头X和RIIpB的N末端部分的序列。为了产生[2x(x=0-5),2y(y=0-5)]集合中的所有36种克隆，使较小的片段与来自各种限制酶消化的较大片段连接。vi.编码具有集合riO+2n(n=1-5),Ol中的肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的质粒合成为了合成具有肽接头长度(X=12,Y=0;pBFB135)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII(3B,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAATCCGGAGGAGGTATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC國3'(SEQIDNO:46BFB142)和5'-GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG誦3'(SEQIDNO:47;BFB118)用于产生产物#1;引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTAGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC國3'(SEQIDNO:48;BFB117)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG-3'(SEQIDNO:49;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用^spEI/XZ^I限制酶进行消化，并且连接到用S^EI/Z^I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有肽接头长度(乂=14，丫=0;pBFB136)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RIIpB,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAATCCGGAGGAGGTTCTGGCATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC-3'(SEQIDNO:45;BFB143)和5'國GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG-3'(SEQIDNO:21;BFB118)用于产生产物1;引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTAGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC誦3'(SEQIDNO:24;BFBl17)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:30;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用5^EI/;^al限制酶进行消化，并且连接到用^y/7EI/ZZ^1消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有肽接头长度(X-16,Y^;pBFB137)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII卩B，以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-ATAAATTCCGGAGGAGGTTCTGGCGGATCAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC-3'(SEQIDNO:50;BFB144)和5'-GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG-3'(SEQIDNO:51;BFB118)用于产生产物1;引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTAGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC國3'(SEQIDNO:52;BFB117)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:53;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用^y/7EI/Z6al限制酶进行消化，并且连接到用^^EI/Z^I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有肽接头长度(乂=18,丫=0;pBFB138)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RIipB，以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAATTCCGGAGGAGGTTCTGGCGGATCAGGCGGTATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGC-3'(SEQIDNO:54;BFB145)和5'-GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCTACAATATCCATGTTCGTTCCAAACAG國3'(SEQIDNO:55;BFB118)用于产生产物1;引物对5'-CTGTTTGGAACGAACATGGATATTGTAGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC-3'(SEQIDNO:56;BFB117)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG-3'(SEQIDNO:57;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用^^EI/ZkI限制酶进行消化，并且连接到用5^EI/ZMI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。vii.编码具有集合「10,-2n(n=1-7)l中的肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的质粒合成为了合成具有(X=10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266画412(10,画2;pBFB128)的基于CPM画FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII(3BDNA,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC國3'(SEQIDN0:58;BFB127)和5'-GGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCATCCATGTTCGTTCCAAACAGG國3'(SEQIDNO:59;BFB128)用于产生产物1;引物对5'-CCTGTTTGGAACGAACATGGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCC-3'(SEQIDNO:60;BFB129)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:61;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用限制酶进行消化，并且连接到用A7wI/Z6"I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X=10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266國410(10，画4;pBFB129)的基于CPM画FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII(3BDNA,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC画3'(SEQIDNO:62;BFB127)和AAC-3'(SEQIDNO:63;BFB130)用于产生产物#1;引物对GGCC画3'(SEQIDNO:64;BFB131)和5'國GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:65;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sfl/I人YZ^1限制酶进行消化，并且连接到用ZAoI/ZZjal消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X=10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266-408(10，-6;pBFB130)的基于CPM画FFLuc/卿B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII(3BDNA,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC國3'(SEqiDNO:66;BFB127)和TCTTC-3'(SEQIDNO:67;BFB132)用于产生产物1;引物对AGGGCC-3'(SEQIDNO:68;BFB133)和735'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG陽3'(SEQIDNO:69;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sa/I/ZZ^I限制酶进行消化，并且连接到用Z/zoIA^"I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X=10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266-406(10,誦8;pBFB131)的基于CPM-FFLuc/RIipB的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RIIpBDNA，以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC國3'(SEQIDNO:70;BFB127)和AGG-3'(SEQIDNO:71;BFB134)用于产生产物1;引物对GGGCC國3'(SEQIDNO:72;BFB135)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:73;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sa/I/ZMI限制酶进行消化，并且连接到用Z/zoI/X6al消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X=10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266-404(10,-10;pBFB132)的基于CPM-FFLuc/RIipB的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RIipBDNA，以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC-3'(SEQIDNO:74;BFB127)和CGATG-3'(SEQIDNO:75;BFB136)用于产生产物1;引物对AGGGCC-3'(SEQIDNO:76;BFB137)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:77;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sa/I/X6al限制酶进行消化，并且连接到用X/oI/X6"I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X-10)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266-402(10,-12;pBFB133)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RII(3BDNA，以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC画3'(SEGIDNO:78;BFB127)和TCC-3'(SEQIDNO:79;BFB138)用于产生产物1;引物对GGGCC-3'(SEQIDNO:80;BFB139)和5'画GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG國3'(SEQIDNO:81;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用Sa/I/ZMI限制酶进行消化，并且连接到用X/zoI/X^I消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X40)的N末端肽接头长度、缺乏C末端肽接头、具有RII卩B残基266画400(10,-14;pBFB134)的基于CPM-FFLuc/RII卩B的cAMP传感器的质粒，两个分开的引物对用于扩增RIIPBDNA,以产生2种分开的PCR产物。引物对5'-AAAAAAGTCGACCGGAGGTTCAGGCGGTTC画3'(SEGIDNO:82;BFB127)和5'-画3'(SEQIDNO:83;BFB140)用于产生产物1;引物对5'國GCC國3'(SEQIDNO:84;BFB141)和5'-GTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG-3'(SEQIDNO:85;BFB34)用于产生产物2。2种产物的SOEPCR产生全长PCR产物，其随后用限制酶进行消化，并且连接到用Z/zoI/ZMI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。B.具有可变X/Y肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的功能表征i.具有集合「2x(x=0-5),2v(v=0-5)l中的X/Y肽接头长度的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的功能表征在用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)表达后，测量具有集合[2x(x=0-5),2y(y=0-5)]中的X/Y接头长度CPM-FFLuc/RIIPBcAMP传感器在cAMP存在和不存在下的萤光素酶活性。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配400ng质粒DNA10(iL兔网织红细胞提取物0.8^LTNT反应緩冲液0.4(iLT7聚合酶0.4pL氨基酸混合物0.4(aLrRNasindH20至20pL总体积于3(TC温育1.5小时后，各自的融合蛋白在100pMcAMP的存在或不存在下进行温育，该温育是通过使9TNT⑧反应与1pL1mMcAMP原液或dH20组合。在室温下温育>15分钟后，将1^L样品加入100nL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液+/-100cAMP(90(iLLAR+10pL1mMcAMP原液或dH20)中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。总的来说，用具有集合[2x(x=0-5),2y(y=0-5)]中的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RII卩B融合物观察到一种趋势，其中在100cAMP的存在或不存在下，随着肽接头长度增加，测量到的荧光素酶活性增加(图12)。此外，观察到笫二种趋势，其中在100^McAMP的存在下，萤光素酶活性的诱导倍数随增加的肽接头长度而增加(图13)。ii.具有集合ri0,-2n(n=l-7)l、『10,2n(n=l誦5)1和「10+2n(n=0-5),Ol个氨基酸残基中的X/Y肽接头的基于CPM-FFLuc/RIIBB的cAMP传感器的功能表征在用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)表达后，测量具有集合[10，-2n(n=l-7)]、[10，2n(n=1-5)]和[IO+2n(n=0-5),0]中的X/Y接头长度的CPM國FFLuc/RII卩BcAMP传感器在cAMP存在和不存在下的萤光素酶活性。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配400ng质粒DNA7610兔网织红细胞提取物0.8^LTNT反应緩冲液0.4pLT7聚合酶0.4pL氨基酸混合物0.4(iLrRNasindH20至20总体积于30。C温育1小时后，各自的融合蛋白在100iaMcAMP的存在或不存在下进行温育，所述温育是通过使9^LTNT⑧反应与1pL1mMcAMP原液或dH20组合。在室温下温育>9分钟后，将1^L样品加入100萤光素酶测定试剂(LAR;P匪egaCorp.)溶液+/画100一cAMP(90LAR+10pL1mMcAMP原液或dH20)中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。一般而言，对于缺乏C末端肽接头的CPM-FFLuc/RIipBcAMP传感器，在100nMcAMP的存在或不存在下的萤光素酶活性伴随增加的RIipBC末端截短而减少(图14)。此外，对于集合[IO,-2n(n=1-7)]和[IO,2n(n=1-5)]的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器，在100cAMP的存在下的最大诱导倍数是具有(X=10，Y=0;pBFB117)的肽接头的传感器。此外，对于具有(X=10，Y=0;pBFB117)个氨基酸残基的肽接头的传感器，集合[IO+2n(n=0-5),O]的CPM-FFLuc/RII卩BcAMP传感器显示最大的诱导倍数(图15)。实施例VII具有环状变换叩头虫萤光素酶和来自PKA调节性IIB型亚基的B结构域的cAMP生物传感器A.用于后续插入RIIBB的CPM叩头虫Luc表达质粒(PBFB53)的合逸为了合成实施例X,部分A中合成的质粒的叩头虫变体，引物5'-TATAATGCTAGCGATCGCCATGGGCGTGACTGTGCTGGTGTATC國3'(SEQIDNO:86;BFB94)和5'-TTTTTTCTCGAGCCGCCGCCAGCTTTTTCGAGG-3'(SEQIDNO:87;BFB95)用于扩增编码来自质粒pCBG68-基础(GenbankAcc#77AY258593;PromegaCorp)的残基234-544(叩头虫萤光素酶氨基酸231-542)的萤火虫萤光素酶片段的叩头虫等价物。所得到的产物用Mzel/^TzoI限制酶进行消化，并且连接到用A^el/z/zol消化的亲本CPM-FFLuc(pBFB8)表达质粒内，以产生质粒中间产物1。随后，引物5'画AAAAAAGAGCTCCGGTGAAAAGAACGTGATCTACGGCC-3'(SEQIDNO:88;BFB96)和3'(SEQIDNO:89;BFB97)用于扩增编码来自质粒pCBG68-基础(GenbankAcc#AY258593;P譲egaCorp)的残基4-233(叩头虫萦光素酶氨基酸5-230)的安火虫萤光素酶片段的叩头虫等价物。所得到的产物用&cI/Z6"I限制酶进行消化，并且连接到用&cI/Z6aI消化的上文描述的质粒中间产物1内。B.编码具有(X=4，Y=4;pBFB54)和(X=10,Y=4;pBFB55)个氨基酸残基的肽接头的CPM叩头虫Luc/RII阳融合蛋白的质粒的合成为了合成具有(X=4,Y=4)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAAGTCGACCGGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC國3'(SEQIDNO:90;BFB51)和5'画AAAAAAGAGCTCCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC-3'(SEQIDNO:91;BFB20)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII卩BDNA。所得到的产物用Sa/IASacI限制酶进行消化且连接到亲本CPM叩头虫Luc(pBFB53)内。为了合成具有(乂=10,丫=4)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAAGAGCTCCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC-3'(SEQIDNO:92;BFB20)和5'-AAAAAATCCGGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC隱3'(SEQIDNO:93;BFB21)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII卩BDNA。所得到的产物用S^EI/SacI限制酶进行消化，并且连接到用5s/EIASacI消化的亲本CPM叩头虫Luc(pBFB53)表达质粒内。B.具有(X=4，Y=4;pBFB54)和(X=10,Y=4;pBFB55)个氨基酸残基的肽接头的CPM叩头虫Luc/RIIBB融合蛋白的功能表征具有(X=4，Y=4;pBFB54)和(X=10,Y=4;pBFB55)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM叩头虫Luc/RII卩B融合蛋白的cAMP剂78量反应使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在表达后进行测量。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配2400ng质粒DNA60兔网织红细胞提取物4.8uLTNT反应緩冲液2.4^LT7聚合酶2.4氨基酸混合物2.4rRNasindH20至120总体积于3(TC温育1.5小时后，各自的融合蛋白与各种浓度的cAMP—起进行温育，该温育是通过使9^LTNT⑧反应与1pLcAMP原液(O、0.01、0,025、0.1、0.25、1、2.5、10和25cAMP的终浓度)组合。在室温下平衡约20分钟后，将1pL样品加入包含各自浓度的cAMP(90LAR+10cAMP原液)的100|iiL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright誦Glo)进行测量。具有(X=4,Y=4;pBFB54)和(X=10,Y=4;pBFB55)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM叩头虫Luc/RII(3B融合蛋白在25|LiMcAMP下分别显示出萤光素酶活性的诱导倍数是4.0和5.5。然而，在测试的所有浓度下，基于叩头虫萦光素酶的cAMP传感器的诱导倍数小于基于萤火虫萤光素酶的传感器的诱导倍数(图16)。实施例VIII利用环状变换萤火虫萤光素酶和来自PKA调节性la型亚基的B结构域的cAMP生物传感器将编码来自人PKA调节性la型亚基(RIaB)的B结构域的DNA连接到编码CPM-FFLuc/RIaB融合物[Luc2.0(234-544)-接头X-人RIa(残基245-381)-接头Y-Luc2.0(4-233)]的表达载体内。A.具有(X=4，Y=4:dBFB56)和(X=20,Y=20;dBFB58)个氨基酸残基的肽接头的CPM-FFLuc/RIaB融合蛋白的合成为了合成具有(X=4，Y=4)接头长度的构建体，引物5'-ATATAACTCGAGCGGAATGTATGAGGAATTCCTTAGTAAAGTCTCTATTTTAG-3'(SEQIDNO:94;BFB98)和5'誦(SEQIDNO:95;BFB99)用于扩增RIaBDNA(GenbankAcc#BC036285)。所得到的产物用Z/zoI/SacI限制酶进行消化，并且连接到用Z/zoI/fecI消化的亲本CPM-FFLuc(pBFB8)表达载体内。为了合成具有(X=20,Y=20)接头长度的构建体，引物5'-AG-3'(SEQIDNO:96;BFB102)和5'-(SEQIDNO:97;BFB103)用于扩增RIaBDNA(GenbankAcc#BC036285)。所得到的产物用Smal/^y/EI限制酶进行消化，并且连接到用消化的亲本CPM-FFLuc(pBFB8)表达载体内。B.具有(X=4,Y=4;pBFB56)和(X=20，Y=20;pBFB58)个氨基酸残基的肽接头的CPM-FFLuc/RIaB融合蛋白的功能表征具有(X=4,Y=4;pBFB56)和(X=20,Y=20;pBFB58)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIaB融合蛋白的cAMP剂量反应使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在表达后进行测量。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配2400ng质粒DNA60兔网织红细胞提取物4.8pLTNT反应緩冲液2.4^LT7聚合酶2.4|liL氨基酸混合物2.4rRNasindH20至120总体积于3(TC温育1.5小时后，各自的融合蛋白与各种浓度的cAMP—起进行温育，该温育是通过使9^LTNT⑧反应与1pLcAMP原液(O、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2,5、10、25、和100cAMP的终浓度)组合。在室温下平衡>10分钟后，将1nL样品加入包含各自浓度的cAMP(90pLLAR+10pLcAMP原液)的100(^L萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。具有(X=4，Y=4;pBFB56)和(X=20,Y=20;pBFB58)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/RIaB融合蛋白在100cAMP下显示出萤光素酶活性的诱导倍数是1.8。然而，在浓度>0.025^M时，基于RIaB的cAMP传感器的诱导倍数小于基于RIIpB的传感器的诱导倍数(图17)。实施例IX利用环状变换耐热萤光素酶和来自RKA调节性IIB型亚基的B结构域的cAMP生物传感器A.用于后续插入RIIBB的CPM耐热Luc表达质粒(t>BFB45)的合成为了合成耐热萤光素酶(UltmGloluciferase,PromegaCorp.),引物5'-CC-3'(SEQIDNO:98;BFB88)和5'國TTTTTTCTCGAGCCATTGGTGTGTTTTTCTAACATTTGTCTTAAC-3'(SEQIDNO:99;BFB89)用于扩增编码残基234-544(UltmGlo萤光素酶残基233-543)的萤火虫萤光素酶片段的UltmGlo萤光素酶等价物。所得到的产物用A^el/Z/zoI限制酶进行消化，并且连接到用Mzel/Z/zoI消化的亲本CPM-FFLuc(pBFB8)表达质粒内，以产生质粒中间产物1。随后，引物5'-AATTTTGAGCTCCGGTGATAAGAATATTTTATATGGGCCCGAAC-3'(SEQIDNO:100;BFB90)和AG-3(SEQIDNO:101;BFB91)用于扩增编码残基4-233(UltraGlo萤光素酶残基3-232)的萤火虫萤光素酶片段的叩头虫等价物。所得到的产物用S"cI/ZZ)al限制酶进行消化，并且连接到用S"cI/^&"I消化的上文描述的质粒中间产物1内。B.编码具有(X=4,Y=4;pBFB51)和(X=20,Y=20;pBFB52)个氨基酸残基的肽接头的CPM耐热Luc/RIIBB融合蛋白的质粒合成为了合成编码具有(X=4,Y=4)接头长度的CPM耐热Luc/RII卩B融合蛋白的质粒，引物5'-AAAAAAGTCGACCGGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC-3'(SEQIDNO:102;BFB51)和5'画AAAAAAGAGCTCCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC画3'(SEQIDNO:103;BFB20)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII卩BDNA。所得到的产物用^/IA^cI限制酶进行消化，并且连接到用Z/zoIASacI消化的上文描述的亲本CPM耐热Luc表达质粒(pBFB45)内。为了合成编码具有(乂=20^=20)接头长度的CPM耐热Luc/RII卩B融合蛋白的质粒，引物5'-AAAAAACCCGGGATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCC-3'(SEQIDNO:104;BFB23)和5'-AAAAAATCCGGACCCAACAATATCCATGTTCGTTCCAAAC-3'(SEQIDNO:105;BFB24)用于扩增来自ATCC10625233(GenbankIDBC075800)的RII^BDNA。所得到的产物用^y/7EI/Smal限制酶进行消化，并且连接到用Xgel/A^wl消化的上文描述的亲本CPM耐热Luc表达质粒内。C.具有(X=4,Y=4;pBFB51)和(X=20,Y=20;pBFB52)个氨基酸残基的肽接头的CPM耐热Luc/RII阳融合蛋白的功能表征具有(X=4,Y=4;dBFB51)和(X=20，Y=20:dBFB52)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM耐热Luc/RII卩B融合蛋白的cAMP剂量反应使用TNT⑧T7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在表达后进行测量。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配2400ng质粒DNA60兔网织红细胞提取物4.8TNT反应緩冲液2.4^LT7聚合酶2.4氨基酸混合物2.4rRNasindH20至120总体积于3(TC温育1.5小时后，各自的融合蛋白与各种浓度的cAMP—起进行温育，该温育是通过使9^LTNT㊣反应与1pLcAMP原液(O、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10、25、和100cAMP的终浓度)组合。82在室温下平衡>19分钟后，将1^L样品加入包含各自浓度的cAMP(90LAR+101mMcAMP原液)的100pL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。具有X=4，Y=4个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM耐热Luc/RIipB融合蛋白(dBFB51)在100nMcAMP下显示出萤光素酶活性的诱导倍数是1.5(图18)。然而，具有X=20,丫=20个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM耐热Luc/RII卩B融合蛋白(pBFB52)对cAMP无反应(图18)。在2种情况下，在浓度>0.025pM时，基于CPM耐热Luc/RII卩B的cAMP传感器的诱导倍数小于基于萤火虫萤光素酶的传感器的诱导倍数(图18)。实施例X使用CPM海肾萤光素酶/RIIBB生物传感器细胞内检测cAMP浓度的变化(福司柯4木滴定)细胞培养100plHEK-293细胞在96孔板中铺板，并且在具有HEPES緩冲液(Invitrogen)与10%FBS的DMEM/F12中在37。C与5%C02下生长至70-90%汇合。转染细胞使用0.3plrra朋It⑧-LTl试剂和0.15|igDNA(具有(X=4,Y=20)的X/Y肽接头长度的CPM-hRL/RIipBcAMP生物传感器(201325.78.E5))/96孔板的孔，用rra似It⑧-LTl试剂(MIRUS)进行转染。允许细胞生长过夜且在第二天进行测定。生物传感器的调节转染后约l天，从培养箱中取出细胞且平衡至室温。600EnduRen活细胞底物(Promega)的lOpl等分试样加入总共100pl细胞培养物中，以产生约60coelentrazine的终浓度。细胞随后在室温下温育至少15分钟。在室温下15分钟后，发光的基线测量值使用96孔Veritas光度计(Turner)以0.5秒/孔进行测量。细胞随后用0.025-250pM福司柯林(Sigma)进行诱导，或不诱导(0.1%DMSO,Sigma),并且连续测量发光约30分钟(图19)。样品在5次重复/福司柯林浓度的组中进行测量。EC5oS使用GraphPadPrismforWindows，版本4进行计算。结果在用福司柯林刺激后，来自用DNA转染的细胞的光输出增加，所述DNA编码具有(X=4,Y=20)的X/Y肽接头的CPM-hRL/RII卩BcAMP生物传感器(201325.78.E5)(图19)。福司柯林的最大水平诱导的光输出比未处理细胞高3.6倍。此外，福司柯林反应的EC5o是0.059(图19)。实施例XI利用环状变换萤火虫萤光素酶和来自cGMP活化的蛋白质激酶(GKI-B)或人石舞酸二酯酶2A(PDE2A)的B结构域的cGMP生物传感器cGMP是具有各种生理功能的重要的细胞第二信使，特别是在心血管和神经系统中。一系列cGMP传感器通过使环状变换萤火虫萤光素酶与cGMP结合结构域融合进行制备。A.编码具有(X=4,Y=4)和(X=10,Y=10)个氨基酸残基的肽接头的CPM-FFLuc/GKI-B融合蛋白的质粒合成为了合成具有(X=4,Y=4)接头长度的构建体，引物5'國AAAAAACTCGAGCGGATTAAAAAGCGTTCCAACATTCCAG-3'(SEQIDNO:106;BFB151)和5'画AAAAAAGAGCTCCCAGACAGCTTCAGGTTGGCGAAG画3'(SEQIDNO:107;BFB163)用于扩增人GKI画BDNA(Origene，目录#TC116252;GenbankAcc#NM—006258),例如对应残基231-350(pBFB164，pBFB165)或231-373(pBFB171,pBFB172)的DNA。所得到的产物用限制酶进行消化，并且连接到用Z/wI/SacI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。为了合成具有(X=10,Y=10)接头长度的构建体，引物5'-AAAAAATCCGGATTAAAAAGCGTTCCAACATTCCAG-3'(SEQIDNO:108;BFB153)和5'國AAAAAAAGGCCTGACAGCTTCAGGTTGGCGAAG-3'(SEQIDNO:109;BFB164)用于扩增人GKI-BDNA(Origene,目录存TC116252;GenbankAcc#NM—006258)。所得到的产物用^;EI/泣wI限制酶进行消化，并且连接到用5^EI/ZraI消化的亲本CPM-FFLuc表达质粒(pBFB8)内。B.具有(X=4,Y=4)和(X=10,Y=10)个氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/GKI-B融合蛋白的功能表征使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.),在表达后测量具有(X=4,Y=4)和(X=10,Y=10)氨基酸残基的X/Y接头长度的CPM-FFLuc/GKI-B融合蛋白在100cGMP存在和不存在下的萤光素酶活性。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配400ng质粒DNA10(xL兔网织红细胞提取物0.8^LTNT反应緩冲液0.4T7聚合酶0.4jxL氨基酸混合物0.4rRNasindH20至20总体积于3(TC温育1小时后，各自的融合蛋白在100(iMcGMP的存在或不存在下进行温育，该温育是通过使9TNT⑧反应与11mMcGMP原液或dH20组合。在室温下温育>IO分钟后，将1iiL样品加入lOO^iL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液+/-100一cGMP(90IliLLAR+101mMcGMP原液或dH20)中。发光使用Veritas微量滴定板光度计(TurnerBiosystems;程序Bright-Glo)进行测量。在100cGMP的存在下，具有(X=4,Y=4)接头长度的CPM-FFLuc/GKI-B融合蛋白(pBFB171)显示出萤光素酶活性的2倍增加。此外，在100|iMcGMP的存在下，具有(X=10,Y=10)接头长度的CPM-FFLuc/GKI-B融合蛋白(pBFB172)显示出萤光素酶活性的1.5倍增加。表2pBFB接头组合使用100cGMP的RLU不使用cGMP的RLUpBFB171(X=4，Y=4)247,801497,938pBFB172(X=10，Y=10)1,148,4961,707,44985C.编码CPM-FFLuc/人磷酸二酯酶2A(PDE2A;GenbankNM002599;氨基酸残基416-549)的质粒的合成使编码具有分别在残基234和233上的工程化N和C末端的环状变换萤火虫萤光素酶构建体的DNA序列与编码人PDE2A的序列融合，所述人PDE2A具有相对于RIipB结构域[Met-(Luc2.0234-544)-(接头X)-(人PDE2A416-549)画(接头Y)誦(Luc2.04-233)-Val]不同的蛋白质折叠。来自人PDE2A的cGMP结合结构域属于称为GAF结构域的小分子结合单位的大家族。制备具有(pBFB167;X=4,Y=4)(pBFB168;X=10，Y=10)和(pBFB169;X=20,Y=20)个氨基酸残基的X/Y接头长度的构建体(图21)。在100^McGMP的存在下，对于具有(pBFB168;X=10,Y=10)和(pBFB169;X=20,Y=20)个氨基酸接头的构建体，在体外表达后使用T7偶联的网织红细胞裂解物系统，鉴定出基于PDE2A的生物传感器的萤光素酶活性分别具有2和11倍诱导(图22)。此外，在表达后使用T7偶联的网织红细胞裂解物系统在分开的实验中发现这些生物传感器经由cGMP的活化是剂量依赖性的，并且对cAMP是选择性的(pBFB169;图23)。因此，这些cGMP传感器用于在体外检测cGMP浓度的变化，并且这些生物传感器对于检测活细胞中的cGMP浓度的变化可能有用，用于在细胞培养实验中使用或用于全动物成像研究。实施例XII萤光素酶钙生物传感器钙生物传感器通过使编码环状变换萤火虫萤光素酶的序列与编码结合钙的蛋白质结构域的序列融合进行制备，所述萤火虫萤光素酶具有分别在残基234和233上的工程化的N和C末端。一种类型的4丐生物传感器利用快速鸡骨骼肌肌钙蛋白C(TnC)(氨基酸15-163;N109D,D111N,N145D，D147N;GenbankNM—205450)[Met-(Luc2.0234-544)-(接头X)-(TnC)画(接头Y)-(Luc2.04-233)-Val]的突变体，笫二种类型的钾生物传感器利用人钙调蛋白(CaM)(氨基酸5-148;GenbankBC005137)[Met-Luc十(234-544)國(接头X)-人钙调蛋白(5-148)-(接头Y)-Luc+(4-233)]。具有可变X/Y肽接头长度的CPM-FFLuc/TnC和CPM-FFLuc/CaM86构建体使用T7偶联的网织红细胞裂解物系统在体外进行表达(pBFB225,pBFB226,pBFB227，pBFB7;图24)。反应随后补充IOmMCaCl2或10mMEDTA加2.5mMEGTA。对于具有(X=8,Y=8;pBFB7)的CPM-FFLuc/CaM生物传感器可见最大反应，其中X=LEGSGGGG(SEQIDNO:306)且Y=GGGGSGPW(SEQIDNO:307),在^5的存在下萤光素酶活性减少超过60倍。对于具有不同X/Y肽接头长度的CPM-FFLuc/CaM构建体(pBFB225，pBFB226,pBFB227)可见类似反应，尽管量级较低。对于具有随机42个氨基酸的接头的对照构建体或对于野生型萤火虫萤光素酶没有观察到反应(pBFB8和pBFB22;图25)。这些生物传感器对于在体外和活细胞内检测钓浓度的变化可能有用。实施例XIII使用萤火虫萤光素酶中的多个修饰位点的cAMP生物传感器另外的修饰位点，例如环状变换，可以用于开发萤火虫萤光素酶生物传感器，例如cAMP生物传感器。在上文中，cAMP生物传感器使用具有一级结构Met-(Luc2.0残基234-544)-GSSGGSGGSGGG-RII卩B-(Luc2.0残基4-233)-Val(SEQIDNO:184;RI印B是来自人PKA调节性II卩型结构域氨基酸266-414的BcAMP结合结构域)的安火虫萤光素酶的环状变换突变体进行制备。类似构建体使用在另外残基上环状变换的萤火虫萤光素酶突变体进行制备。总的来说，测试了编码下述类型的融合蛋白的23种独立的构建体Met-(Luc2.0残基X画544)-GSSGGSGGSGGG-RII卩B國(Luc2.0残基4画Y)-Val(GSSGGSGGSGGG对应SEQIDNO:121;图26列出了关于各种构建体的X/Y值)。对于这些构建体中的每一种，排除具有在残基255上的环状变换的构建体，对于环状变换，使用PDB文件ILCI(http:〃www.rcsb.org/pdb/home/homedo)，选择在由二级结构例如卩4斤叠或a螺旋为边界的溶剂暴露面环中的位点。溶剂暴露面环作为修饰位点，例如环状变换比包埋在蛋白质核心中的位点或参与a或P结构的位点可能更顺应。这由对于具有在255上的环状变换的构建体可见的活性缺乏得到支持，其中Tyr255是包埋在蛋白质核心中的a螺旋的组分。这个构建体集合表示在1LCI晶体结构中可见的大多数但不是全部表面折叠。使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统表达后，鉴定了许多不同的环状变换位点，其中在100^McAMP的存在下，超过光度计的本底检测水平的发光活性和诱导倍数超过2倍(CPM位点37、47、75、83、107、144、160、188、225、233、242、268、308、358、377、403和490)。此外，鉴定了发光活性的诱导倍数超过CPM233的构建体，其中在这个实验中最大倍数活化值超过200倍。将编码选择构建体的DNA转移至包含CMV启动子的哺乳动物表达载体(pF9A;PromegaCorp.)中。构建体是pBFB317(CPM位点268)、pBFB318(CPM位点358)、pBFB319(CPM位点47)、pBFB321(CPM位点225)、pBFB322(CPM位点233)、pBFB325(CPM位点308)、pBFB326(CPM位点377)、pBFB327(CPM位点403)、pBFB328(CPM位点75)、和pBFB329(CPM位点83)(关于X、Y值参见图26)。用编码各种Met-(Luc2.0残基X-544)誦GSSGGSGGSGGG國RII13B画(Luc2.0残基4-Y)國Val(GSSGGSGGSGGG对应SEQIDNO:121)构建体的DNA瞬时转染后，HEK293细胞用50[iM福司柯林进行处理以活化内源性腺香酸环化酶。温育16分钟后，测量来自活细胞群体的发光。如预期的，各种构建体在活细胞内充当cAMP生物传感器。有趣的是，在细胞内显示最高诱导倍数的构建体不是在体外具有最高诱导倍数的同一构建体(比较图27-28)。实施例XIV非变换海肾萤光素酶cAMP生物传感器如本文所述，环状变换海肾萦光素酶构建体可以用作生物传感器。制备了具有插入对修饰耐受的位点内的RIipB的非变换海肾萤光素酶构建体,所述位点例如残基91/92、223/224或229/230之间。构建体如上所述产生。它们是hRL(1-91)-4个氨基酸的肽接头-RII(3B-4个氨基酸的肽接头-hRL(92-311)(201360.17.A3)、hRL(1-91)國4个氨基酸的肽接头-RIIPB-20个氨基酸的肽接头-hRL992-311)(201360.17.A12)、hRL(1-91)-10个氨基酸的肽接头-RII卩B-4个氨基酸的接头-hRL(92-311)(201360.17.D7)、hRL(1-91)-42个氨基酸的88肽接头-hRL(92-311)(201325.165.A2)、hRL(1-223)画4个氨基酸的肽接头國RII卩B-4个氨基酸的接头-hRL(224-311)(201360.24.A1)、hRL(1-223)-4个氨基酸的肽接头-RII(3B-20个氨基酸的接头-hRL(224-311)(201360.24.A10)、hRL(1-223)-10个氨基酸的肽接头画RII卩B-4个氨基酸接头-hRL(224-311)(201360.24.C5)、hRL(1-223)-10个氨基酸的肽接头-RIipB-20个氨基酸的接头-hRL(224-311)(201360.24.E11)、hRL(1-223)-42个氨基酸的肽接头-hRL(224-311)(201325.177.B7)、hRL(1-229)-4个氨基酸的肽接头-RII卩B-4个氨基酸的接头-hRL(230-311)(201360.19.E9)、hRL(1-229)-4个氨基酸的肽接头-RII卩B-20个氨基酸的接头-hRL(230-311)(201360.54.A1)、hRL(1-229)-42个氨基酸的肽接头-hRL(230-311)(201325.165.C5)(图29)。蛋白质使用TNTT7偶联的麦芽裂解物系统由构建体进行表达，使17^LTNT反应与补充有3.41mMcAMP原液或dH20的17300mMHEPES/200mM硫脲(pH约7.5)混合；允许反应在室温下温育约IO分钟。将10inL每种样品一式三份地加入96孔板孔中，并且发光使用100jxL海肾萤光素酶测定试剂在Glomax光度计上进行测量。hRL(1-91)画接头-RII卩B-接头-hRL(92-311)蛋白质被诱导约12-23倍，hRL(1-223)画接头RII卩B-接头-hRL(224-311)蛋白质未被诱导，hRL(1-229)-接头-RII卩B-(230-311)蛋白质被诱导约2-9倍。42个氨基酸的接头的构建体中无一被诱导，全长海肾萤光素酶构建体(201325.50.A7)和"无DNA"对照也未被诱导(图30)。实施例XV光输出和诱导倍数作为关于基于CPM-hRL91Luc/RIIBB的cAMP传感器的X/Y肽接头长度的函数改变产生了编码具有可变X/Y肽接头长度的基于CPM-hRL91Luc/RII卩B的cAMP传感器的构建体。蛋白质使用TNTT7偶联的麦芽裂解物系统由构建体进行表达，使17TNT反应与补充有3.41mMcAMP原液或dH20的17300mMHEPES/200mM硫脲(pH约7.5)混合；允许反应在室温下温育约IO分钟。将10pL每种样品一式三份地加入96孔板孔中，并且发光使用100|iL海肾萤光素酶测定试剂89在Glomax光度计上进行测量。如图32中所示，光输出和诱导倍数随接头长度而变。诱导倍数为约87-331。42个氨基酸的接头的构建体、全长海肾萤光素酶构建体和"无DNA"对照未被诱导(图32)。实施例XVI利用环状变换海肾萤光素酶和来自PKA调节性Ia型亚基的B结构域或GAF结构域的cAMP生物传感器将编码来自人PKA调节性Ia型亚基的B结构域(RIaB)的DNA连接到编码CPM-hRL91Luc/RIaB融合物[hRL(92-311)-接头X-humanRIa(残基245-381)國接头Y-hRL(1-91)];(X=4,Y=20;pBFB210),(X=4,Y=4;pBFB211)，(X=10,Y=10;pBFB212)和(X=20,Y=20;pBFB213)的表达载体内(图33)。蛋白质使用TNTT7偶联的麦芽裂解物系统由构建体进行表达，使17^LTNT反应与补充有3.4|LiL1mMcA證原液或dH20的17300mMHEPES/200mM硫脲(pH约7.5)混合；允许反应在室温下温育约IO分钟。将10pL每种样品一式三份地加入96孔板孔中，并且发光使用100|iL海肾萤光素酶测定试剂在Glomax光度计上进行测量。如图34中所示，光输出和诱导倍数随接头长度而变。诱导倍数为约2.8-6.8。42个氨基酸的接头的构建体(201325.15.A1)、全长海肾营光素酶构建体(201325.50.A7)和"无DNA"对照未被诱导(图34)。使用环状变换海肾萤光素酶(hRL)和GAF结构域构建另外类型的cAMP生物传感器。质粒DNA构建体编码下述融合蛋白Met-(hRL92-311)-GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG-(来自布鲁斯锥虫(Trypanosomabrucei)PDE的GAFA结构域；GenbankAF192755氨基酸241-375)-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG画A-(hRL3-91)画Val(SEQIDNO:185)[克隆pBFB232]。使用T7偶联的网织红细胞裂解物系统表达后，发光活性在外源cAMP的存在或不存在下进行测量。在cAMP的存在下，测量的活性是7595RLU;在不存在cAMP的情况下，测量的活性是298RLU(约25倍变化)。这些结果指出另外的结构域可以在CPMhRL构建体中在生物传感器的产生中使用。这种类型的试剂可以允许监控活细胞中的cAMP浓度的变化，并且在那种测定形式中它还可以提供超过现有的基于FRET的cAMP生物传感器的不同优点。此外，因为GAF结构域在负责结合广泛范围的分子的性质中是高度保守的折叠，所以可能另外类型的CPMhRL生物传感器可以使用这种折叠进行制备。实施例XVII使用海肾萤光素酶中的多个修饰位点的cAMP生物传感器具有海肾萤光素酶的环状变换突变体的cAMP生物传感器在与cAMP结合后显示发光活性的增加，所述海肾萤光素酶的环状变换突变体具有一级结构Met-(hRL92-311)-GSTG-RIIJ3B-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(hRL2陽91)-Val(SEQIDNO:186;RIIBB是来自人PKA调节性型结构域氨基酸266-414的BcAMP结合结构域)。类似构建体，即"分裂"蛋白质或环状变换蛋白质，可以使用在另外位点上修饰的海肾萤光素酶突变体来产生。总的来说，测试了编码下述类型的融合蛋白的14种独立的环状变换构建体Met-(hRLX-311)-GSTG画RII13B-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(hRL2-Y)-Val(GSTG对应SEQIDNO:122;GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:123)。下表提供了14种构建体的肽X/Y值。表3CPM位点X值Y值克隆ID313230pBFB276424341pBFB277697068pBFB278111112110pBFB279151152150pBFB280169170168pBFB281193194192pBFB282208209207pBFB283*251252250pBFB284259260258pBFB285274275273pBFB286919291pBFB287和201325.44.H691<formula>formulaseeoriginaldocumentpage92</formula>*注对于构建体pBFB283,在C末端上的最后一个氨基酸是PFSEFKPD(SEQIDNO:120)而不是PFK,并且在终止密码子之前未插入Val。对于这些构建体中的全部(4种除外)，使用海肾萤光素酶的同源模型，使用1BN6(红球菌属物种)(i^o^cocc^)和2DHD(自养黄色杆菌)(Z朋f/^ac^^M加户/^w)卤代烷脱卤酶晶体结构作为模板选择在溶剂暴露面环中的位点用于环状变换。溶剂暴露面环作为修饰位点例如环状变换比包埋在蛋白质核心中的位点或参与ot或P结构的位点可能更顺应。这个假设由对于具有在255上的环状变换的萤火虫萤光素酶构建体可见的活性缺乏得到支持，其中Tyr255是包埋在蛋白质核心中的oc螺旋的组分。这个构建体集合表示在同源模型结构中可见的某些但不是全部表面折叠。基于先前报道(Kaihara等人，2003,Remy等人，2005和Paulmurugan等人，2003)选择4个CPM位点91、111、223和229。构建体使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统或TnTT7偶联的麦芽提取物系统进行表达，并且在体外进行测试(图35和36)。结果指出许多不同的环状变换位点可以用于产生生物传感器例如cAMP生物传感器。鉴定了环状变换的可替代位点，其中未诱导/诱导的活性水平超过具有在91上的环状变换的起始构建体(CPM91)。此外，鉴定了发光活性的诱导倍数超过CPM91的构建体。此外，由于CPM91的极低溶解性，当在大肠杆菌中表达时，将测试与这种构建体比较，另外的构建体溶解性的增加。增加的溶解性可以促进体外生物传感器例如cAMP4企测试剂的开发。结果还指出许多位点无法用于环状变换。残基169-274之间的所有位点具有低诱导和未被诱导的活性，并且发光活性的诱导倍数为约2倍或更低。构建体在载体主链(pF5A;PromegaCorp.)中进行设计，其允许体外表达(T7启动子)以及哺乳动物表达(CMV启动子)。用编码各种Met-(hRL残基X-311)-GSTG國RII卩B-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG-(hRL残基2画Y)-Val(GSTG对应SEQIDNO:122;GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG对应SEQIDNO:123)构建体(pBFB276、pBFB277、pBFB278、pBFB279、pBFB280、pBFB287)的DNA瞬时转染后，HEK293细胞用100福司柯林进行处理以活化内源性腺苷酸环化酶。温育14分钟后，测量来自活细胞群体的发光。如预期的，各种构建体在活细胞内充当cAMP生物传感器。有趣的是，构建体CPM31显示在体外最高的诱导倍数，然而，这在细胞内不是这样。然而，一般而言，光输出和诱导倍数显示在体外和体内类似的趋势(图37)。实施例XVIII制备许多不同的遗传构建体，以测试使用缺乏充当分泌信号的17个氨基酸的N末端肽的曲萤萤光素酶(Glue)(GenbankAAG54095;氨基酸18-185)制备生物传感器的可能性。当由活细胞测量时，相对于其他萤光素酶，含或不含N末端信号肽的曲萤安光素酶已报道产生更大的光强度(Tannous等人，2005;Remy等人，2006)。此外，Gluc的片段已在蛋白质互补系统中使用(Gluc在氨基酸残基110上分裂；Remy等人，2006);因此，可能Gluc还将顺应在这个位点或其他位点上的环状变换。为了制备GluccAMP生物传感器，蛋白质二级结构的预测用于选择Gluc环状变换的各个位点Met-(GlucA-185)-(接头X)-(人RII卩BGenbankBC075800氨基酸残基266-414)-(接头Y)-(Gluc18-B)。表4CPM位点A残基B残基接头长度X接头长度YpBFB#1001019944pBFB290100101991010pBFB291100101992020pBFB29211011110944pBFB2931101111091010pBFB2941101111092020pBFB29548494744pBFB2964849471010pBFB2974849472020pBFB29868696744pBFB2996869671010pBFB3006869672020pBFB30184858344pBFB3028485831010pBFB3038485832020pBFB3049192卯44pBFB3059192901010pBFB3069192卯2020pBFB30711411511344pBFB3081141151131010pBFB3091141151132020pBFB31012612712544pBFB3111261271251010pBFB3121261271252020pBFB31316216316144pBFB3141621631611010pBFB3151621631612020pBFB316其中各种接头组合具有序列:94<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>对于GluecAMP有用的位点可以进行取代，以产生使用这种环状变换位点用于其他分子的生物传感器。此外，在一种桡足动物萤光素酶中顺应环状变换的位点可能在其他桡足动物萦光素酶例如来自MeWd/a/o"ga的萤光素酶中有用。实施例XIX用于基于细胞的GPCR测定的方法可以涉及细胞内信号转导事件的直接检测。最成功的包括使用荧光染料或水母发光蛋白用于实时监控细胞内钩的方法。然而，类似技术缺乏细胞内cAMP动力学的检测。具有蛋白激酶A的变构RII|3BcAMP结合结构域的环状变换萤火虫萤光素酶是能够发出与cAMP浓度成比例的发光的传感器。使用这种传感器的活细胞、零步骤GPCR测定允许使用稳定或瞬时转染的细胞系动态检测cAMP浓度的变化。此外，可以开发单步同源测定形式用于在体外检测cAMP(图38)。来自在称为"CPM-FFLuc/RIIPB"的生物传感器类别下的pBFB135的ORF用于产生下文描述的瞬时和稳定细胞系。这些细胞系称为"CP234-Luc/RIIB"、"cAMPLucSensor"、"LucSensor"和"FFcAMP传感器"。将稳定表达CP234-Luc/RIIB(ORF来源于pBFB135)的HEK293细胞重悬浮于完全培养基中，且与5mg/mL安光素-EF混合。细胞以1乂105细胞/孔在96孔板中铺板，且平衡至室温1.5小时。用福司柯林刺激后，发光在15分钟时使用GloMaxTM光度计进行测量。结果显示这种测定对于福司柯林产生0.36|iM的EC5o值(图38)。对于Z，测量，将2乂104个细胞/孔等分到384孔板中且使用类似方案进行平衡。一半板用20nM福司柯林诱导，而另一半保持不诱导。发光在诱导后使用TECANGENiosProTM光度计捕获15分钟。诱导倍数为6.1且Z，为0.83。因为具有超过0.5的Z，的测定视为高流通量筛选(HTS)的良好品质，所以基于cAMP生物传感器的测定顺应HTS。稳定表达多巴胺Dl受体的HEK293细胞用编码CP234-Luc/RIIB或R361K突变体(cAMP结合结构域中的突变)(ORFs分别来源于pBFB135和pBFB147)的质粒DNA进行瞬时转染。细胞进行铺板且如上所述用萦光素-EF进行平衡，并且将来自LOPAC文库(板6)的化合物加入每个孔中(10iuM)。温育50分钟后，板在TECANGENiosProTM光度计上进行读数。还使用萤光素酶报道基因测定(CRE反应元件)进行鉴定的命中以红色显示(图39)。由cAMP生物传感器测定鉴定的大多数命中与由CRE-Luc报道物测定鉴定的命中相关，证实了cAMP生物传感器GPCR测定的生物关联性。细胞同样铺板且用萤光素-EF进行平衡，然后在化合物添加后，发光使用GloMaxTM光度计在40分钟时进行测量。使用cAMP生物传感器测定产生的EC5Q和IC5Q值的药代动力学参数与在文献中使用其他方法报道的那些关联良好，再次证实cAMP生物传感器GPCR测定的生物关联性(图40)。反应还在不同温度下(图42)以及与各种激动剂和拮抗剂(图43)一起温育的细胞中进行测试。表达cAMPLucSensor(ORF来源于pBFB135)和多巴胺D1受体的HEK293细胞与萤光素一起在室温或37。C下温育1.5小时，然后与激动剂或拮抗剂接触。反应在光度计上进行测量。当细胞在生理条件例如37C和C02下进行温育时，存在对化合物更快速和动态的反应。在37。C下的结果在性质上类似于对于细胞内cAMP动力学预期的那些。在室温下，存在对于较低的动力学范围较慢的反应，这对于大规模筛选可能是有用的。图44显示在用cAMPLucSensor稳定转染且与不同量的多巴胺接触的细胞中关于诱导倍数的时程。结果显示该系统允许实时监控活细胞中的cAMP动力学。此外，图45中的结果显示该系统允许评估化合物效力，这在不同时间点上是相对一致的。图46提供了关于各种激动剂的效力排序(EC5G)和结果，并且显示某些化合物是部分激动剂。关于拮抗剂效力(IC50)的数据显示于图47中。cAMPLucSensor还可以用于测量已在宿主细胞中表达的GPCR(内源性GPCR)的调节。一个例子使用表达卩2-肾上腺素能受体且用cAMPLucSensor稳定转染的HEK293细胞显示。如对于多巴胺受体描述的类似方案后，图48-49分别显示各种激动剂和拮抗剂的效力排序。进行3种生物发光GPCR测定的比较。关于那些测定和激动剂的结果显示于图50中。关于使用拮抗剂的3种生物发光测定的结果显示于图51中。关于测试化合物的排序在所有3种测定中是相同的。在cAMP的存在下cAMPLucSensor的发光的增加可以是从"开放，，到"闭合，，的构象变化中增加的效率的结果。稳定表达多巴胺D1受体的HEK293细胞也用编码在CMV启动子(201325.78.E5)或TK启动子(201325.44.H6)控制下的CPM-hRLLuc/RI印BX=4,Y=20的质粒DNA进行瞬时转染，然后用福司柯林、SKF38393或多巴胺进行刺激。同样测试野生型海肾萤光素酶和不含RI印B结构域的CPM-hRLLuc,并且未显示对cAMP调节的特异性反应(数据未显示)。细胞在T75烧瓶中用7>"raIt-LTl试剂(MIRUS)进行转染，其中使用60rra^It-LTl试剂和30DNA/烧瓶，允许过夜生长且在第二天进行测定。转染后约1天，从培养箱中取出细胞且受胰蛋白酶处理，计数，并且将10,000细胞/孔铺板在96孔板中的具有10%FBS和60|iMEnduRen活细胞底物的DMEM/F12(HEPES緩沖液，Invitrogen)中。EnduRen活细胞底物(Promega)在100(xLDMSO中重构且加入预热的完全培养基中至60(xM的终浓度。细胞随后在37。C下温育至少1小时且随后冷却至室温。在室温下15分钟后，发光的基线测量值使用96孔GloMaxTM光度计以0.5秒/孔进行测量。细胞随后用在完全培养基中制备的福司柯林(Sigma)、SKF38393(Sigma)、多巴胺(Sigma)的10x原液进行诱导，或未诱导(0.1%DMSO(Sigma)),并且连续测量发光约30分钟。样品在4次重复/福司柯林、多巴胺或SKF38393浓度的组中进行测量。EC5o数据表示诱导后15分钟，并且使用GraphPadPrismforWindows,版本4进行计算。类似于CPM-FFLuc/RII卩B生物传感器，使用CPM-hRLLuc/RIipBX=4,丫=20生物传感器(201325.44.H6和201325.78.E5)产生的EC50值与在文献中使用其他方法报道的那些关联良好，再次证实cAMP生97物传感器GPCR测定的生物关联性(图52A-D)。实施例XX使用CPM-hRLLuc/RIIBBcAMP生物传感器细胞内检测cAMP浓度的变必细胞培养细胞在具有HEPES緩沖液(Invitrogen)与10%FBS的2mlDMEM/F12中在37°C与5%C02下在6孔板中进行培养。质粒实施例XVII中描述的3种构建体用于检测cAMP浓度的细胞内变化。4吏用的构建体是pBFB277、pBFB279和pBFB287。稳定表达CPM91-hRL/RII卩B(ORF来源于201325.44.H6的HEK293细胞)也在这些实验中使用。转染HEK293细胞使用6plrraralt⑧-LTl试剂和2貼DNA(pBFB277、pBFB279和pBFB287)/6孔板的孔，用rra朋It③画LTlReagent(MIRUS)进行转染。允许细胞生长过夜且在第二天进行测定。生物传感器的调节转染后约l天，细胞受胰蛋白酶处理，重悬浮于含HEPES緩冲液(Invitrogen)与1%FBS的新鲜DMEM/F12中，并且以约10,000个细胞/孔在96孔板中铺板。可替代地，稳定表达CP91-hRL/RIipB的HEK293细胞系以约10,000个细胞/孔在96孔板中铺板。将600^MEnduRen的10juL等分试样加入总共IOO^L细胞培养物中，以产生约5.5iiMEnduRen的终浓度。细胞随后在37C与5。/。C02下进行温育。5小时后，板从培养箱中取出且允许冷却至室温至少20分钟。20分钟后，发光的基线测量值使用96孔Veritas光度计(TurnerBiosystems;0.5秒/孔的整合时间)进行测量。细胞随后用IOnM异丙肾上腺素(CalBiochem)、50mM福司柯林(Sigma)进行诱导，或不诱导(0.1%DMSO,Sigma),并且连续测量发光约30分钟。30分钟后，将10mM普萘洛尔(Sigma)力口入已用异丙肾上腺诱导的细胞中，且将0.1°/0DMSO加入所有其他样品中。随后在接下来的30分钟连续测量发光。将50pM福司柯林的最终添加物加入异丙肾上腺/普萘洛尔样品中，且将0.1%DMSO加入所有其他样品98中。随后在接下来的半小时连续测量发光。样品在4-6次重复的组中进行测量。异丙肾上腺素、普萘洛尔、福司柯林和DMSO的10x原液在含HEPES緩冲液(Invitrogen)与1%FBS的DMEM/F12中进行制备。结果为了测量cAMP的细胞内浓度的变化，HEK293细胞用3种CPM-hRLLuc/RII卩B(X=4，Y=20)构建体(在海肾萤光素酶内的不同位置上环状变换的)进行瞬时转染，随后用化合物进行处理，所述化合物已知通过GPCR活化增加细胞内cAMP浓度(异丙肾上腺素，即一种卩-肾上腺素能受体激动剂)、通过GPCR抑制减少细胞内cAMP浓度(普萘洛尔，即一种p-肾上腺素能受体拮抗剂)、或通过腺普酸环化酶的活化增加细胞内cAMP浓度(福司柯林)。异丙肾上腺素和福司柯林处理单独使来自转染细胞的光输出增加约2倍，反映细胞内cAMP浓度中的增加(图53)。此外，对cAMP浓度的变化的短暂反应通过用异丙肾上腺素，随后用普萘洛尔，随后用福司柯林处理细胞观察到(图53)。使用海肾萤光素酶生物传感器的cAMP调节的检测也在稳定表达CPM91-hRL/RII|3B的HEK293细胞中得到证实。这些数据显示响应异丙肾上腺素和福司柯林处理的光输出的约5倍增加(图53)。类似于瞬时转染的细胞，对cAMP浓度的变化的短暂反应通过用异丙肾上腺素，随后用普萘洛尔，随后用福司柯林处理细胞观察到(图53)。实施例XXI非变换萤火虫萤光素酶cAMP生物传感器制备了具有直接插入对修饰耐受的位点内的RIipB的各种非变换萤火虫萤光素酶构建体，所述位点例如残基233/234、355/359、82/83、和307/308之间。将编码下述融合蛋白的DNA克隆到载体pF9A内表6<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>Luc2.0=由/wc20基因编码的北美萤火虫萤光素酶(参见GenbankIDAY738222);RII卩B=人PKA调节性II卩型亚基的残基266-414(GenbankBC075800)蛋白质使用TnTT7偶联的网织红细胞裂解物系统由这些构建体进行表达。表达后，使9TNT反应与11mMcAMP原液或H20混合，并且允许反应在室温下温育约15分钟。温育后，将2^L溶液一式三份地等分到96孔板的各个孔中。发光在注入100萤光素酶测定试剂(0.5秒整合时间)后使用Glomax光度计进行测量。结果指出cAMP生物传感器可以通过将RIIPB直接插入4个所选择的插入位点中的任何一个内来产生(参见图54)。结果还指出对环状变换耐受的位点看起来对于直接插入也是耐受的，从而产生可行的生物传感器。实施例XXII非变换和变换刺虾萤光素酶cAMP生物传感器细角刺奸rOp/op/zo^wgracWraWn'sJ萤光素酶(OpLuc)催化coelentmzine的氧化以发出蓝光。酶的成熟形式是18.7kD(169aa)。原始ORF包括代表用于分泌的假定信号肽的27个额外残基。假定的27aa信号肽的去除导致萤光素酶活性约50倍的增加。由于其小尺寸，OpLuc特别顺应作为生物传感器或在PCA中使用。OpLuc是活跃和稳定的，前提是它存在于无TnT细胞的提取物或大肠杆菌细胞裂解物中。然而，它在纯化后立即灭活。凝胶过滤显示萤光素酶(在大肠杆菌中表达，不含在天然生物中发现的35kD蛋白质)在13.7和29kD蛋白质标准之间洗脱。酶的MW是18.7kD。因此，看起来如果表达，而不含35kD蛋白质，那么萤光素酶作为单体维持。该酶在pH7.5-9下保持活性，并且活性在pH9.5下开始减少。制备了具有直接插入对修饰耐受的位点内的RI印B的各种非变换刺虾萤光素酶(OpLuc)构建体，所述位点例如残基50/51和84/85之间。将编码下述融合蛋白的DNA克隆到载体pF5K内表7pBFB397Met-(OpLuc1-50)-GSTG-R2(3B-GSSG-(OpLuc51-169)(SEQIDNO:190)pBFB398Met-(OpLuc1-50)-GSSGGSGGSG-R2^-GSSGGSGGSG-(OpLuc51-169)(SEQIDNO:191)pBFB399Met-(OpLuc1-50)-GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG-R2PB-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG-(OpLuc51-169)(SEQIDNO:192)pBFB400Met-(OpLuc1-84)-GSTG-R2PB-GSSG-(OpLuc85-169)(SEQIDNO:193)pBFB401Met-(OpLuc1-84)-GSSGGSGGSG-R2阳-GSSGGSGGSG國(OpLuc85-169)(SEQIDNO:194)pBFB402Met-(OpLuc1-84)-GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG-R2pB-GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG-(OpLuc85-169)(SEQIDNO:195)上表中的残基'r指出成熟形式的蛋白质中的第一个残基(缺乏用于分泌的信号肽，GenbankAB030246中的残基28);RIipB二人PKA调节性lip型亚基的残基266-414(GenbankBC075800)。蛋白质使用TnTT7偶联的网织红细胞裂解物系统由这些构建体进行表达。表达后，使9TNT反应与11mMcAMP原液或H20混101合，并且允许反应在室温下温育约15分钟。温育后，将10nL2x緩冲液(300mMHEPES,pH=8.0,200mM硫脲)加入每个反应中，并且在添加100pL海肾测定试剂后使用Turner20/20N光度计(1秒整合时间)由所产生的20pL溶液测量发光。结果在下表中列出表8__pBFB397+918pBFB397-225pBFB398+4,917pBFB398-291pBFB399+38,051pBFB399-356pBFB400+10,369pBFB400-6,387pBFB401+6,124pBFB401-2,304pBFB402+62,264pBFB402-8,568FLOpluc+25,225,870FLOpluc-23,231,428NoDNA+120NoDNA-116FLOpluc=GenbankBC075800的残基28-169的表达；'+，=外源cAMP添加至50终浓度；'-，=未添加外源cAMP。其他载体包括具有克隆到pF4K-CMV质粒内的RII(3B结构域的刺奸萤光素酶(OpLuc)的环状变换突变体，以使得能够在T7和CMV启动子控制下表达。还制备了具有插入对修饰耐受的位点内的RIIPB的各种环状变换刺奸萤光素酶(OpLuc)构建体。参见图63。括号中的数目对应成熟形式的刺虾萤光素酶中的氨基酸残基。整数"4"、"10"和"20"指出相应长度的接头。应当指出Met和Val残基加入萤光素102酶的N末端。因此，环状变换突变体中的各种分裂的位置移动两个氨基酸残基。例如，分裂标记"50-51"(指的是天然成熟形式的酶中的残基顺序)在使用的实际萤光素酶形式中的残基52和53两者之间出现。pF4K-CMV-[51-169]-4國RII卩B-4画[l画50]-OpLucpF4K國CMV-[51隱169]國10-RII卩B画10-[l-50]-OpLucpF4K-CMV画[51-169]-20-RII卩B-20-[l-50]-OpLucpF4K-CMV隱[85-169]國4-RII卩B-4-[l-84]-OpLucpF4K画CMV-[85画169]-10-RII卩B-10-[l-84]-OpLucpF4K-CMV-[85-169]誦20國RII卩B画20-[l-84]-OpLucpF4K-CMV-[113-169]-4-RII卩B陽4-[l画112]-OpLucpF4K-CMV國[113國169]画10-RII卩B-10-[l誦112]画OpLucpF4K-CMV画[113-169]-20-RII卩B-20國[l國112]陽OpLucpF4K-CMV-[135-169]-4-RII卩B-4-[l-134]-OpLucpF4K-CMV-[135誦169]誦10國RII卩B-10-[l-134]誦OpLucpF4K-CMV誦[135-169]画20-RII卩B-20誦[1-134]國OpLucpJ15:4809-OgLuc-具有克隆的完整大小的刺虾萦光素酶ORF的2.7kb质粒(通过DNA2.0)pJ15:4810-具有成熟的刺奸萤光素酶ORF的ORF的2.6kb质粒(27aa信号肽被去除)(通过DNA2.0)pFlK-OgLucS-3.7kb。将完整大小的ORF克隆到pFlK内(FLOpLuc)pFlK-OgLuc-3.6kb。将成熟萤光素酶的ORF克隆到pFlK内pFlK-OpLucDN-3.6kb。等同于pFlK-OgLuc,除了前4个N末端残基被去除pFlK-OpLucDC-3.6kb。等同于pFlK-OgLuc,除了最后3个C末端残基被去除pFlK國OpLucDNDC國3.6kb。等同于pFlK-OgLuc，除了前4个N末端和最后3个C末端残基^皮去除pFVDnK-OgLucS-4.4kb。使HaloTag与完整大小的萤光素酶ORF融合pFVDnK-OgLuc-4.5kb。使HaloTag与成熟萤光素酶的ORF融合pFN6K-叩Luc-3.6kb。将HQ-标记引入成熟萤光素酶的ORF的N103末端内等量CPMOpLuc/RII卩B构建体(0.1ng质粒/50pl反应混合物；图64)在兔网织红细胞TnT系统(Promega#L1170)中表达。在TnT反应完成后，加入cAMP至0.1mM的终浓度，并且使混合物另外在室温下温育15分钟。反应用海肾裂解緩冲液稀释10倍，并且萤光素酶活性如建议的(海肾萤光素酶测定系统,#E2810,PromegaCorp.)在海肾试剂中进行测量。对于所有4种环状变换萤光素酶构建体观察到萤光素酶活性的诱导(图64)。具有在残基84和85之间的萤光素酶分裂的构建体证实最高诱导(约250倍)。20个氨基酸的接头支持最有效的折叠。结果指出cAMP生物传感器可以通过环状变换或RIIPB直接插入任何上文选择的插入位点内来产生。实施例XXIII与刺虾萤光素酶的蛋白质互补为了测定刺奸萤光素酶中对于蛋白质互补有用的位点，制备N和C末端融合物。载体主链包括用于体外实验的pF3A和用于细胞实验的pF5K。制备下述构建体"N末端-FRB",即，OpLuc(1-50或1-84)10aaG/S接头誦FRB,"FKBP-C末端"，即，FKBP画(G4S)2接头-OpLuc(51-170或85-170),"FRB國N末端,"即，FRB隱(G4S)2接头-OpLuc(1-50或1-84),和"C末端國FKBP,"即，OpLuc(51-170或85-170)-10aaG/S接头-FKBP。参见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>201518.45.08pF3A全长FL-OpLucFLOpLuc201518.57.A2pF3AFRB-n末端FRB-OpLuc(1-50)FRB-50201518.57.A11pF3AFRB-n末端FRB-OpLuc(1-84)FRB-84201518.57.D9pF3AFKBP-C末端FKBP-OpLuc(51-170)FKBP-51201518.61.H3pF3AFKBP-C末端FKBP-OpLuc(85-170)FKBP-85201518.110.4-1pF3An末端-FRBOpLuc(1-50)-FRB50-FRB201518.104.04pF3An末端-FRBOpLuc(1-84)-FRB84-FRB201518.129.03pF3AC末端-FKBPOpLuc(51-170)-FKBP51-FKBP201518.129.06pF3AC末端-FKBPOpLuc(85-170)-FKBP85-FKBP蛋白质使用TnTSP6高产量蛋白质表达系统于30。C表达或共表达2小时(根据制造商的方案；PromegaCo卬.)。20pL裂解物在+/-1|iM雷帕霉素条件下在室温下温育15分钟。10iliL裂解物在2xHEPES/石危脲中1:l稀释，并且将5—式三份地置于96孔板孔中。发光通过经由注射器添加100nL海肾萤光素酶测定试剂(R-LAR)进行测量。关于在位置50/51(50-FRB+FKBP-51)上的分裂的体外结果显示于图56中，关于84/85(84-FRB+FKBP-85)的那些显示于图58中。图57和59显示了关于各自的SDS-PAGE分析的结果。5|^-/+雷帕霉素裂解物在4-12%SDS-PAGE上大小分级分离。图61-62显示关于51-FKBP十FRB-50和85-FKBP+FRB-85方向的体外结果。对于在图62中的数据，7.5jiL+/-雷帕霉素裂解物在4-12%SDS-PAGE上大小分级分离。图60显示使用HEK-293细胞的细胞内结果。HEK-293细胞用互补片段或用刺奸营光素酶的单个片段在6孔板中进行瞬时转染并且温育过夜。第二天细胞受胰蛋白酶处理且以20,000个细胞/孔在96孔板中铺板。同时将lpM雷帕霉素或媒介物(DMSO)加入细胞中，并且允许它们在37。C与5%C02下恢复过夜。第二天去除培养基，并且将201x海肾萤光素酶测定裂解緩冲液加入每种样品中，并且使板在500rpm下振荡15分钟。将100海肾萤光素酶测定试剂注入每个孔内，并且样品以3秒/孔伴随0.5秒延迟进行测量。实施例XXIVCPM萤火虫萤光素酶(FFLuc)和海肾萤光素酶(hRLLuc)也用105作生物传感器以测定激酶戶粦酸酶活性。以类似于cAMP、cGMP和钓的先前生物传感器的方式，制备各种环状变换(CPM)FFLuc和hRLLuc构建体，以检测通过酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸激酶的磷酸化(分别在有下划线的Tyr或Thr残基上的磷酸化，在下文描述的构建体中)。由具有束缚的磷酸肽识别结构域的磷酸化肽序列的结合引起的构象变化，可以引起融合的生物传感器营光素酶活性的调节。这表示相对于现有的基于FRET的生物传感器，能够测量激酶活性的新类别的试剂可能具有增强的性能特征。用于酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶的肽序列和识别结构域分别是具有磷酸肽识别结构域人SrcSH2结构域(GenbankNM—005417;aa残基151-248)的肽GSTSGSGKPGSGEGSEIIGEF(SEQIDNO:295)或EIXGEF(SEQIDNO:296),和具有来自Rad53p的磷酸肽识别结构域FHA2的RKRDRLGILGI(SEQIDNO:297)(核酸序列Genbank登记#AY693009的密码子优化形式，其与登记弁AAT93028的石成基1717-2186;aa残基573-730比对)。关于先前鉴定为对于产生FFLuc和hRLLuc中的生物传感器有用的CPM的多个位点用于构建激酶生物传感器。这些构建体使用连接到独特的限制位点内的PCR产物或通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)剪接进行制备。FFLuc构建体在pF9A主链中进行制备，hRLLuc构建体在pF5A主链中进行制备，除了在实施例II中描述的经修饰的pGL4.74主链中制备的质粒pBFB174、175、176、178、179、180、181、182、228、229和230。制备下述构建体Met-(Luc2.0或hRLC末端片段)-(片段X)-(通过激酶磷酸化的肽)-(片段)-(磷酸肽识别结构域)-(片段Y)-(Luc2.0或hRLN末端片段)-Val。还制备其中通过激酶磷酸化的肽和磷酸肽识别结构域的顺序转变的构建体。此外，对于酪氨酸激酶FFLuc生物传感器制备下述构建体Met-(通过激酶磷酸化的短肽)-(片段X)-(Luc2.0)-(片段)-(磷酸肽识别结构域)-Val。参见图65。酪氨酸激酶构建体1)Met-(Luc2.0234-544)-GSSG-(人SrcSH2结构域)-GSG-GSTSGSGKPGSGEGSEIXGEF-(接头Y)-(Luc2.04-233)-Val,其中Y=GSGGSGGSSG(SEQIDNO:291)、或GSGGSGGSGGGSGGSGGSSG(SEQIDNO:286)。(GSSG对应SEQIDNO:270;GSGGSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF对应SEQIDNO:298)。克隆pBFB180、181、182、365、366、367。2)Met-EIXGEF-(接头X)-(Luc2.04-544)-GSSG-(人SrcSH2结构域)，其中X=GSSG(SEQIDNO:270)、GSSGGSGGSG(SEQIDNO:276)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277)。(EI工GEF对应SEQIDNO:296)。克隆pBFB174、175、176。3)Met-(hRL92-311)-GSG-(人SrcSH2结构域)-GSG-GSTSGSGKPGSGEGSEIXGEF-(接头X)-GSSG-(hRL2-91)陽Val,其中X=GSSG(SEQIDNO:270)、GSGGSGGSSG(SEQIDNO:291)、或GSGGSGGSGGGSGGSGGSSG(SEQIDNO:286)。(GSGGSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF对应SEQIDNO:298)。克隆pBFB228、229、230。4)Met-(Luc2,0A國544)-(接头X)-(人SrcSH2结构域)-GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF-(接头Y)-(Luc2.04-B)-Val，其中X=GSTG(SEQIDNO:275)、GSSGGSGGSG(SEQIDNO:276)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277)和Y=GSSG(SEQIDNO:270)、GSGSGGSGGSSG(SEQIDNO:299)、或GSGGSGGSGGGSGGSGGSSG(SEQIDNO:286)(GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF对应SEQIDNO:295).CPM位点[A、B]=[235、233]、[359、355]、[84、82]、[309、307]。克隆pBFB368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379。5)Met-(hRLA-311)-(接头X)-(人SrcSH2结构域)-GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF-(接头Y)-(hRL3-B)-Val,其中X=GSSG(SEQIDNO:270)、GSSGGSGGSG(SEQIDNO:276)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277)和Y=GSSG(SEQIDNO:270)、GSGSGGSGGSSG(SEQIDNO:299)、或GSGGSGGSGGGSGGSGGSSG(SEQIDNO:286)。(GSTSGSGKPGSGEGSEIYGEF对应SEQIDNO:295)。CPM位点[A、B]=[92、91]、[42、41〗、[111、110]、[31、30]、[69、68]。克隆pBFB380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394。107丝氨酸/苏氨酸激酶构建体1)Met-(Luc2.0A-544)-(接头X)-RKRDRLGILGI國(GGSSGGGSGGGGSGG)-(Rad53pFHA2结构域)-(接头Y)-(Luc2.04隱B)，其中X=GSSG(SEQIDNO:270)、GGSGGSGSSG(SEQIDNO:300)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGSSG(SEQIDNO:301),Y=GSSG(SEQIDNO:270)、GSGGSGGSGG(SEQIDNO:281)、或GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:278).(RKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG对应SEQIDNO:283)。CPM位点是[A、B]=[235、233]、[359、355]、[84、82]、[309、307]。克隆pBFB335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346。2)Met-(hRLA-311)画(接头X)國RKRDRLGILGI-(GGSSGGGSGGGGSGG)-(Rad53pFHA2结构域)-(接头Y)-(hRL3-B)，其中X=GSSG(SEQIDNO:270)、GSSGGSGGSGGG(SEQIDNO:302)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277)，Y=GSSG(SEQIDNO:270)、GSGGSGGSSG(SEQIDNO:291)、或GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:278).(RKRDRLGTLGIGGSSGGGSGGGGSGG对应SEQIDNO:283)。CPM位点是[A、B]=[92、91]、[42、41]、[111、110]、[31、30]、[69、68]。克隆pBFB350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364。3)Met-(Luc2.0A誦544)-(接头X)-(Rad53pFHA2结构域)-GGSSG-RKRDRLGILGI-(接头Y)-(Luc2.04誦B),其中X=GSGG(SEQIDNO:293)、GGSGGGGSGG(SEQIDNO:294)、或GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277),Y=GGSSG(SEQIDNO:304)、GSSGSGGSGG(SEQIDNO:305)、或GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:278)(GGSSGRKRDRLGTLGI对应SEQIDNO:303)。CPM位点是[A、B]=[235、233]、[359、355]。克隆pBFB417、418、419、420、421、422。4)Met-(hRLA國311)-(接头X)-(Rad53pFHA2结构域)-GGSSG画RKRDRLGILGI-(接头Y)-(hRL3-B)，其中X=GSGG(SEQIDNO:293)、GGSGGGGSGG(SEQIDNO:294)、或108GSSGGSGGSGGGSGGSGGSG(SEQIDNO:277),Y=GGSSG(SEQIDNO:304)、GSSGSGGSGG(SEQIDNO:305)、或GSGGSGGSGGTSGGSGGSSG(SEQIDNO:278).(GGSSGRKRDRLGTLGI对应SEQIDNO:303)。CPM位点是[A、B]=[42、41]、[111、110]。克隆pBFB423、424、425、426、427、428。丝氨酸/苏氨酸激酶传感器的子集的体外测试构建体pBFB335、336、338、339、340、417、418、419、422、22和8使用TNTT7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)在体外进行测试。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配1ing质粒DNA25|iL兔网织红细胞提取物2pLTNT反应緩冲液1^T7聚合酶1氨基酸混合物1(iLrRNasindH20至50总体积于3(TC温育1小时后，各自的融合蛋白在10ngAktl/PKBa重组酶(UpstateBiotechnology)的存在或不存在下进行温育，该温育是通过使2TNT⑧反应与8(aL水+45x反应緩冲液(40mMMOPS/NaOHpH7.0,ImMEDTA)+45xMg-ATP(50mM乙酸镁，0.5mMATP)+2|iL5ng/jaL酶(由在PKB稀释緩冲液[20mMMOPS(7.0)、lmMEDTA、5%甘油、0.05%DTT、lmg/mlBSA]中稀释的100ng/ul原液稀释)或仅2PKB稀释緩冲液组合。样品随后于3(TC温育20分钟。将5pL样品加入100|iL萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.)溶液中，并且快速上下吸取4X以混合。发光使用Turner20/20N光度计(TurnerBiosystems;1秒整合时间)进行测量。所有样品一式三份地进行测量。结果与无Aktl/PKB比较，构建体pBFB340显示+Aktl/PKB发光的50%减少。对照构建体pBFB22和pBFB8随Aktl/PKB添加无改变(图66)。109关于其他丝氨酸/苏氨酸激酶传感器的方案等同于上文那种，除了对于CPMhRLLuc样品，将5pL样品加入96孔板+不含去污剂(150mMHEPES,100mM硫脲)的52x海肾裂解緩冲液，并且通过注射器加入100海肾测定试剂(PromegaCorp.),其中使用Veritas微量滴定板光度计并且测量发光(TurnerBiosystems;Bright-Glo程序；3秒整合时间)。FFLuc样品通过经由注射器将lOO]iL安光素酶测定试剂加入96孔板中的5pL样品进行测量，其中使用Veritas微量滴定板光度计并且测量发光(TurnerBiosystems;Bright-Glo程序；3秒整合时间)。酪氨酸激酶传感器如下进行测试蛋白质使用TNT⑧T7偶联的网织红细胞裂解物系统(PromegaCorp.)进行体外表达。简言之，下述组分根据制造商推荐的方案进行装配1ing质粒DNA25兔网织红细月包提取物2pLTNT反应緩冲液1&T7聚合酶1|LlL氨基酸混合物1(iLrRNasindH20至50(xL总体积于30。C温育1小时后，各自的融合蛋白在如下的50iul激酶反应中使用IXProFlour反应緩冲液(PromegaCorp.)+10|ilRRTnT反应+100|iM钒酸钠+1mMMnCl2+1mMMgATP+0.5pic-Src激酶或水。在Src激酶添加后0、30和60分钟时，获取10pi等分试样且^藏于-2(TC直至测定。对于CPMFFLuc样品，将5iil转移至96孔^1,并且通过注射器加入lOOul萤光素酶测定试剂(LAR;PromegaCorp.),其中使用Veritas微量滴定板光度计并且测量发光(TurnerBiosystems;Bright-Glo程序；3秒整合时间)。对于CPMhRLLuc样品，将5|il样品加入96孔板+不含去污剂(150mMHEPES,100mM硫脲)的5pL2x海肾裂解緩冲液，并且通过注射器加入100海肾测定试剂(PromegaCorp.)，其中使用Veritas微量滴定板光度计并且测量发光(TurnerBiosystems;Bright-Glo程序；3秒整合时间)。为了测试细胞中的激酶传感器，FFLuc和CPMhRLLuc丝氨酸/苏氨酸激酶生物传感器如下进行测试HEK293和NIH/3T3细胞以1-1.5x104个细胞/孔的细胞密度在C02不依赖性培养基(Invitrogen)+10%FBS中在96孔板中铺板。它们随后4吏用4.2|uL7>wwIt-LTl试剂和1.4jigDNA/孔，用Traralt③國LTlReagent(MIRUS)进行转染。允许细胞在37°C/10%C02下生长过夜。第二天将培养基换成C02不依赖性培养基+0.2°/。FBS以使细胞血清饥饿。随后允许细胞在37。C/10%C02下生长过夜。转染后约2天，对于FFLuc传感器，细胞用终浓度5mM的萤光素-EF(PromegaCorp.)进行平4軒，或对于CPMhRLLuc传感器，细胞用终浓度60的EnduRen(PromegaCorp.)进行平衡。1.5小时后，发光的基线测量值使用MithrasLB940光度计(BertholdTechnologies;1秒/孔的整合时间)在37°C下进行测量。接下来，一半细胞用激酶激活物例如血小板来源的生长因子(PDGF,50ng/ml终浓度)进行处理。随后在37。C下在接下来的30分钟连续测量发光。实施例XXV在不存在三维蛋白质结构信息的情况下用于制备环状变换蛋白质的合适的分裂点的测定方法1)获得目的蛋白质的氨基酸序列。2)使用一种或多种计算机程序以预测帮助确定合适的分裂点的蛋白质结构特征。合适的分裂点可能暴露于蛋白质表面上。位于常规二级结构元件例如螺旋和折叠外的分裂点较不可能破坏蛋白质结构和功能。预测表面暴露的蛋白质区域暴露区域可能是亲水的。亲水和疏水残基沿着蛋白质序列的分布(疏水性点/得分)可以基于常用的疏水性等级使用在公开进入的网站上获得(例如来自瑞士生物信息学会的ExPASy蛋白组学服务器的ProtScalehttp:〃www.expasv.ch/cgi-bin/protscale.pl)以及作为商业序列分析软件包的部分(例如来自DNASTAR的Lasergene)的程序进行计算。预测蛋白质二级结构此种程序可在公开进入的网站上(参见ExPASy蛋白组学工具网址上的列表http:〃www.expasv.org/too諸se函darv)以及作为商业序列分析软件包的部分(例如来自DNASTAR的Lasergene)获得。3)基于来自一种或多种预测方法的结果选择分裂点。例子1)蛋白质序列细角刺虾成熟萤光素酶序列(Genbank登记BAB13776，残基28-196)。2)预测表面暴露的蛋白质区域使用窗口大小5和7,基于Kyte-Doolittle疏水性等级计算每个残基的疏水性得分，其指定对于发现假定的表面暴露区域建议的范围(KyteJ和DoolittleRF:Asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein.J.Mol.Biol.157:105,1982)。预测蛋白质二级结构使用5种不同的预测算法a.PSIPRED(JonesDT.(1999)Proteinsecondarystructurepredictionbasedonposition-specificscoringmatrices.J.Mol.Biol.292:195-202,McGuffinU，BrysonK，JonesDT)。b.JPRED(CuffJA,ClampME,SiddiquiAS,FinlayM和BartonGJ.1998.Jpred:AConsensusSecondaryStructurePredictionServer,Bioinformatics14:892-893)。c.PORTER(GPollastri,AMcLysaght."Porter:anew,accurateserverforproteinsecondarystructureprediction".Bioinformatics,21(8),1719-20,2005)。d.SCRATCH(GPollastri，DPrzybylski，BRost,PBaldi:Improvingthepredictionofproteinsecondarystructureinthreeandeightclassesusingrecurrentneuralnetworksandprofiles.Proteins,47，228-335,2002)。e.PROF(MOuali,RKing:Cascadedmultipleclassifiersforsecondarystructureprediction.ProteinScience,9,1162-1176,1999)。3)汇集表中的蛋白质结构特征预测的结果用于比较。选择在亲水的(低疏水性得分)且位于预测的常规二级结构元件(螺旋和折叠)外的区域中的合适分裂点。参见表9(在下文3个部分中)。112表9:关于细角刺虾成熟萤光素酶汇集的结构特征预测结果。二级结构预测结果代码是11=螺旋，E-折叠，C-巻曲，空白=巻曲。疏水性预测得分对于疏水区域为>0,对于亲水区域为O。合适的分裂点例子在最右侧的列中标记为xxx。一,辆>列，PSIP咖'咖POFUERSCRATCH疏水性得W捐^511CTc':c3Hi:-H0.844AhiD別;sDKhtci6H.cc誦D.犯7VHcc■:0.09-0.088GCc0c0,44Dcccc-1-0010WHHH-0,41-2,38"Q.HHHI-o'n-2、4212H.HH-1.38-1,3813THHH.-1.72428UACCC-172-暖15(3CCC0-2.01-0,8216Ycccc-2.0117Mc曙。-1/1618QHHH-O朋19E)HHH-HE-1,9620HH.，H,':fi*1.5921VHHHHE-"9-0.522H.HH.H-1.14掘23HH.H■H',《330.1224Q■、i二c广掘30.825GCGC0"'0,826GCCCc0J2-0,2627LHHH0.11謂28SH.H--HHJ0,"1,1229SH■H-'j-r"8加H■■..H:-.HHj1.17Q.331H■.H■1"70.8232QHHH'-H1.211J433H■.HH■■!1.2134LH-h{H1J7"835GCCCCU717236VCCCC0,782,237SCcc"71.338VCcc1081,0639Tccc1,12化0cC0*730,5841ccc0,73404420EE1,24,43搭E0.691,144V0.7209645V0.511,546|_伝E踪-0.382.2sCC-0,03D朋48cCC0.82-,49￡cccc-CL08-1,7250cc':c-0,34.仏8-U容13溢i€€、f.f.在5在4453ccc-0.8854Accc-0020-5455踪sc0-87-O.挑56瞧EEE1.410.7657HEE10.8158VE..E2.9591E固1朋60画ECL隨2,06113<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>参考文献Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403(1990).Altschul等人，Nuc.AcidsRes.,21:3389(1977).Bos,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,4:733(2003)Chong等人，Gene,192:271(1997).Corpet等人，Nucl.AcidsRes.，1088(1988).Dremieret.al.,FEBSLett,546:163(2003).Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,3998(1984).Hanks和Hunter,FASEBJ,2:576-595(1995).Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,ii:10915(1989)Higgins等人，Gene,21:237(1988).Higgins等人，CABIOS,&157(1989).Huang等人，CABIOS,&155(1992).Kaiham等人，Anal.Chem,,21:41(2003).Karlin&Altschul,P跳Natl.Acad.Sci.USA，,5873(1993).Lee等人，Anal.Biochem.,316:162(2003).Liu等人，Gens,237:153(1999).Mayer和Baltimore,TrendsCell.Biol.,2:8(1993).Merri認，J.Am.Chem.Soc.,2149(1963).Murray等人，Nucl.AcidsRes.,17:477(1989)Myers和Miller,LABIOS,i:11(1988).Ozawa等人,AnalyticalChemistry,73:2516(2001).Needleman等人，J.Mol.Biol.,1^:443(1976).Paulmurugan等人，Anal.Chem.,21:1584(2003).Paulmurugan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99:3105(2002).Paulmurugan等人，PNAS,21:15603(1999).Pearson等人，MethodsMol.Biol.,24:307(1994).Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，M:2444(1985.Plainkum等人，Nat.Struct.Biol.，辺115(2003).Remy等人,Biotechniaues，38:763(2005).Remy等人，Nat.Methods,1:977(2006).Sadowski,等人，Mol.Cell.Bio.,4396(1986).Sala-Newby等人，BiochemJ.,279727(1991).Sala-Newby等人，FEBS,307:241(1992).Sambrook等人,In:MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor(1989).Smith等人，Adv.Appl.Math.,&482(1981).Stewart等人,SolidPhasePeptideSynthesis,2ed.,PierceChemicalCo.,Rockford，Ill.，pp.11-12).Tannous等人，Mol.Them.,U:435(2005).Wada等人，Nucl.AcidsRes.,Jl:2367(19卯).Wang等人，BBRC,282:28(2001).Waud等人，BBA,1292:89(1996).Zagotta等人，Nature,425:730(2003).所有出版物、专利和专利申请合并入本文作为参考。尽管在前述说明书中本发明已就其某些优选实施方案进行描述，并且许多细节已出于举例说明的目的进行阐述，但对于本领域技术人员显而易见的是本发明容许另外的实施方案，并且无需背离本发明的基本原理可以相当大地改变本文的某些细节。权利要求1.一种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含环状变换萤光素酶的可读框，所述环状变换萤光素酶包含环状核苷酸结合位点，所述萤光素酶在其中相应的未变换萤光素酶对修饰耐受的位点上或区域中进行变换，并且其中所述环状变换萤光素酶的活性是可检测的。2.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状变换萤光素酶在N末端、C末端或两者上进一步包含至少一个氨基酸的标记。3.权利要求2的多核苷酸，其中所述标记是PEST序列、GST序列或聚组氨酸序列。4.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状变换萤光素酶在对应所述非变换萤光素酶的N末端和/或C末端的序列上进一步包含萤光素酶序列的缺失。5.权利要求4的多核苷酸，其中所述N末端或所述C末端上的缺失不超过萤光素酶序列的15个残基。6.权利要求1或5的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应所述非变换萤光素酶的所述N末端和/或C末端的序列上。7.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点长度为约4-约200个氨基酸残基。8.权利要求1的多核香酸，其中所述萤光素酶是鞘翅目萤光素酶。9.权利要求l的多核苷酸，其中所述萤光素酶是叩头虫萤光素酶或萤火虫萤光素酶。10.权利要求1的多核苷酸，其中所述萤光素酶是珊瑚虫萤光素酶。11.权利要求10的多核苷酸，其中所述萤光素酶是海肾萤光素酶。12.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应萤火虫萤光素酶的残基2-12、残基32-53、残基70-88、残基102-126、残基139-165、残基183-203、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495、或残基535-546的区域中。13.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应叩头虫萤光素酶的残基15-30、残基112-122、残基352-362、残基371-384、残基393-414、或残基485-495的区域中。14.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应海肾萤光素酶的残基2-12、残基26-47、残基64-74、残基86-116、残基147-157、残基223-234、或残基301-311的区域中。15.权利要求1的多核苷酸，其中所述变换在对应萤火虫萤光素酶的残基2-12、残基32-53、残基70-88、残基102-126、残基139-165、残基203-193、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495、或残基535-546的区域中。16.权利要求1的多核苷酸，其中所述变换在对应叩头虫萤光素酶的残基15-30、残基112-122、残基352-362、残基371-384、残基393-414、或残基485-495的区域中。17.权利要求1的多核苷酸，其中所述变换在对应海肾萤光素酶的残基26-47、残基64-74、残基85-116、残基147-157、残基223-234、或残基301-311的区域中。18.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点与cAMP结合。19.权利要求1的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点与cGMP结合。20.—种载体，其包含权利要求1-19中任一项的多核苷酸。21.—种宿主细胞，其包含权利要求20的载体中的多核苷酸。22.—种环状变换萤光素酶，其由权利要求1-19中任一项的多核普酸编码。23.—种检测或测定细胞中的环状核普酸的方法，其包括a)提供包含权利要求21的宿主细胞或其裂解物，和用于发光反应的试剂的混合物；和b)检测或测定所述混合物中的发光，从而检测或测定所述细胞中的环状核苷酸的存在或量。24.—种检测或测定样品中的环状核苷酸的方法，其包括a)提供包含怀疑具有环状核苷酸的样品、权利要求22的环状变换萤光素酶，和用于发光反应的试剂的混合物；和b)检测或测定所述混合物中的发光。25.权利要求23或24的方法，其中所述萤光素酶是萤火虫萤光素酶。26.权利要求23或24的方法，其中所述萤光素酶是叩头虫萤光素酶。27.权利要求23或24的方法，其中所述萤光素酶是海肾萤光素酶。28.权利要求23或24的方法，其中环状核苷酸与环状核苦酸结合位点的结合导致发光的增加。29.权利要求24的方法，其中所述样品包含细胞。30.权利要求24的方法，其中所述样品包含细胞裂解物或细胞级分。31.—种检测G蛋白偶联受体的一种或多种调节剂的方法，其包括a)提供样品，其包含一种或多种测试试剂、权利要求21的宿主细胞或其裂解物，和用于发光反应的试剂；和b)检测或测定所述样品中的发光。32.—种检测G蛋白偶联受体的一种或多种调节剂的方法，其包括a)提供样品，其包含一种或多种测试试剂、权利要求22的环状变换萤光素酶，和用于发光反应的试剂；和b)检测或测定所述样品中的发光。33.—种检测G蛋白偶联受体的一种或多种调节剂的方法，其包括a)比4交来自第一种发光反应混合物的发光与来自相应的发光反应混合物的发光，所述第一种发光反应混合物包含一种或多种测试试剂、权利要求21的宿主细胞或其裂解物、和用于发光反应的试剂，所述相应的发光反应混合物不包含所述一种或多种测试试剂，但包括权利要求21的宿主细胞或其裂解物、和用于发光反应的试剂；和b)检测或测定相对于所述相应的发光反应混合物，所述第一种发光反应混合物中的所述一种或多种测试试剂是否改变所述第一种发光反应混合物中的发光。34.—种检测G蛋白偶联受体的一种或多种调节剂的方法，其包括a)比较来自第一种发光反应混合物的发光与来自相应的发光反应混合物的发光，所述第一种发光反应混合物包含一种或多种测试试剂、权利要求22的环状变换萤光素酶、和用于发光反应的试剂，所述相应的发光反应混合物不包含所述一种或多种测试试剂，但包括权利要求的环状变换营光素酶和所述试剂；和b)检测或测定相对于所述相应的发光反应混合物，所述第一种发光反应混合物中的所述试剂是否改变所述第一种发光反应混合物中的发光。35.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述一种或多种试剂增强G蛋白偶联受体活性。36.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述一种或多种试剂抑制G蛋白偶联受体活性。37.权利要求31或34的方法，其中所述一种或多种试剂在添加所迷宿主细胞或其裂解物和试剂之前与固体底物接触。38.权利要求32或34的方法，其中所述一种或多种试剂在添加所述环状变换萤光素酶和试剂之前与固体底物接触。39.权利要求31或33的方法，其中所述宿主细胞表达重组G蛋白偶联受体。40.—种包含核酸序列的多核苦酸，所述核酸序列包含任选包含插入的环状变换珊瑚虫螢光素酶的可读框，所述插入包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，其中所述变换在珊瑚虫萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，并且其中所述插入位于珊瑚虫萤光素酶序列中对修饰耐受的不同的残基上或区域中。41.权利要求40的多核苷酸，其中所述核酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述环状变换珊瑚虫萤光素酶和在所述N末端、C末端或两者上的至少一个氨基酸的标记。42.权利要求40的多核普酸，其中所述环状变换珊瑚虫萤光素酶进一步包含对应于相应的非环状变换珊瑚虫萤光素酶的N末端和/或C末端序列的珊瑚虫安光素酶序列的缺失。43.权利要求42的多核苷酸，其中所述缺失不超过珊瑚虫萤光素酶序列的15个残基。44.权利要求40的多核苷酸，其中所述环状变换珊瑚虫萤光素酶进一步包含位于所述插入N末端和/或C末端的珊瑚虫萤光素酶序列的缺失。45.权利要求44的多核苷酸，其中所述缺失不超过珊瑚虫萤光素酶序列的15个残基。46.权利要求40的多核苷酸，其中所述插入在对应于相应的非环状变换珊瑚虫萤光素酶的N末端和/或C末端的序列上。47.权利要求40的多核苷酸，其中所述插入为约4-约200个氨基酸残基。48.权利要求40的多核苷酸，其中所述插入在对应非环状变换海肾萤光素酶的残基2-12、残基26-47、残基64-74、残基86-116、残基147-157、残基223画234、或残基301-311的区域中。49.权利要求40的多核苷酸，其中所述变换在对应非环状变换海肾萤光素酶的残基2-12、残基26-47、残基64-74、残基86-116、残基147-157、残基223-234、或残基301-311的区域中。50.—种载体，其包含权利要求40-49中任一项的多核苷酸。51.—种宿主细胞，其包含权利要求50的载体中的所述多核苷酸。52.—种经修饰的珊瑚虫萤光素酶，其由权利要求40-49中任一项的多核苷酸编码。53.—种检测或测定细胞中的目的分子的方法，其包括a)提供包含权利要求51的宿主细胞或其裂解物，和用于发光反应的试剂的混合物，其中所述环状变换萤光素酶包含插入；和b)检测或测定所述混合物中的发光，从而检测或测定所迷细胞中的所述分子的存在或量。54.—种检测或测定样品中的目的分子的方法，其包括a)提供包含怀疑具有环状核苷酸的样品、包含插入的权利要求52的经修饰的萤光素酶，和用于发光反应的试剂的混合物；和b)检测或测定所述混合物中的发光。55.—种检测目的分子的一种或多种调节剂的方法，其包括a)提供包含一种或多种测试试剂、权利要求51的宿主细胞或其裂解物，和用于发光反应的试剂的混合物；和b)检测或测定所述样品中的发光。56.—种检测目的分子的一种或多种调节剂的方法，其包括a)提供包含一种或多种测试试剂，包含插入的权利要求52的萤光素酶，和用于发光反应的试剂的样品；和b)检测或测定所述样品中的发光。57.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的甲虫营光素酶的可读框，其中所述经修饰的甲虫萤光素酶相对于相应未修饰的曱虫萤光素酶包含环状核苷酸结合位点，其中所述环状核苷酸结合在甲虫萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，并且其中所述经修饰的曱虫萦光素酶的活性是可检测的。58.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核苦酸结合位点在经修饰的曱虫萤光素酶的C末端上。59.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在N末端和C末端内部。60.权利要求57的多核苷酸，其中所述核酸序列进一步编码在经修饰的甲虫萤光素酶的N末端、C末端或两者上的至少一个氨基酸的标记。61.权利要求57的多核苷酸，其中所述经修饰的的曱虫萤光素酶进一步包含位于所述环状核苷酸结合位点N末端和/或C末端的曱虫萦光素酶序列的缺失。62.权利要求61的多核苷酸，其中所述缺失不超过甲虫萤光素酶序列的15个残基。63.权利要求57的多核苷酸，其中所述经修饰的甲虫萤光素酶进一步包含甲虫萤光素酶序列在对应所述未修饰的曱虫萤光素酶的N末端和/或C末端的序列上的缺失。64.权利要求63的多核苷酸，其中在所述N末端和/或所述C末端上的缺失不超过甲虫萤光素酶序列的15个残基。65.权利要求57的多核苷酸，其中所述曱虫萤光素酶是叩头虫萤光素酶。66.权利要求57的多核苷酸，其中所述甲虫萤光素酶是萤火虫萤光素酶。67.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应萤火虫萤光素酶的残基2-12、残基32-53、残基70-88、残基102-126、残基139-165、残基183-203、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495、或残基535-546的区域中。68.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点在对应叩头虫萤光素酶的残基15-30、残基112-122、残基352-362、残基371-384、残基393曙414、或残基485-495的区域中。69.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核苷酸结合位点与cAMP结合。70.权利要求57的多核苷酸，其中所述环状核香酸结合位点与cGMP结合。71.—种载体，其包含权利要求57-70中任一项的多核苷酸。72.—种宿主细胞，其包含权利要求71的载体。73.—种经修饰的曱虫萤光素酶，其由权利要求57-70中任一项的多核苷酸编码。74.—种检测细胞中的环状核苷酸的方法，其包括a)使细胞与权利要求71的载体接触；和b)检测或测定由所述载体编码的经修饰的甲虫萤光素酶的活性。75.—种检测样品中的环状核苷酸的方法，其包括a)使样品与权利要求73的经修饰的甲虫萤光素酶接触；和b)检测或测定由所述载体编码的经修饰的甲虫营光素酶的活性。76.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的珊瑚虫萤光素酶的可读框，其中所述经修饰的珊瑚虫萤光素酶相对于相应未j奮饰的珊瑚虫萤光素酶包含内部插入，所述插入在其中相应的野生型珊瑚虫安光素酶对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述插入包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸，并且其中所述经修饰的珊瑚虫安光素酶的活性是可检测的。77.权利要求76的多核苷酸，其中所述插入在对应海肾萤光素酶的残基2-12、残基26-47、残基64-74、残基86-116、残基147-157、残基223-234、或残基301-311的区域中。78.—种载体，其包含权利要求76或77的多核苷酸。79.—种宿主细胞，其包含权利要求78的载体。80.—种经修饰的珊瑚虫萤光素酶，其由权利要求76或77的多核苷酸编码。81.—种检测细胞中的目的分子的方法，其包括a)使具有细胞或体外转录/翻译混合物的样品与权利要求78的载体接触，其中所述插入由所述目的分子识别；和b)检测或测定由所述载体编码的经修饰的珊瑚虫萤光素酶的活性，从而检测或测定所述样品中的所述分子的存在或量。82.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的萤火虫萤光素酶的可读框，其中所述经修饰的萤火虫萤光素酶相对于相应未修饰的萤火虫萤光素酶包含内部插入，所述插入在萤火虫萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述插入相对于相应未修饰的萤火虫萤光素酶包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，并且其中所述经修饰的萤火虫营光素酶的活性是可检测的，并且其中所述插入不在对应萤火虫萤光素酶的残基2-12、残基116-126、残基228-238、残基262-272、残基289-308、残基356-366、残基432-442、或残基535-546的区域中。83.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的萤火虫萤光素酶的可读框，其中所述经修饰的萤火虫萤光素酶相对于相应未修饰的萤火虫萤光素酶包含插入和萤火虫萤光素酶序列的片段，其中所述片段具有所述相应未修饰的萤火虫萤光素酶的至少50个邻接氨基酸残基，其中所述插入在萤火虫萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述经修饰的萤火虫萤光素酶的活性由萤火虫萤光素酶序列的第二个片段增加，所述第二个片段对应于相应未修饰的萤火虫萦光素酶的不同的至少50个邻接氨基酸残基，其中所述插入包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，并且其中所述片段的所述C末端或N末端不对应一种区域中的残基，所述区域对应萤火虫萦光素酶的残基116-126、残基228-238、残基262-272、残基289-308、残基356-366、或残基432-442。84.权利要求82或83的多核苷酸，其中所述经修饰的萤火虫萤光素酶进一步包含位于所述插入N末端和/或C末端的萤火虫荄光素酶序列的缺失。85.权利要求84的多核苷酸，其中所述缺失不超过萤火虫萤光素酶序列的15个残基。86.权利要求82或83的多核苷酸，其中所述经修饰的萤火虫萤光素酶进一步包含萤火虫萤光素酶序列在对应所述未修饰的萤火虫萤光素酶的N末端和/或C末端的序列上的缺失。87.权利要求86的多核苷酸，其中在所述N末端或所述C末端上的缺失不超过萤火虫营光素酶序列的15个残基。88.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含任选包含插入的环状变换桡足动物安光素酶的可读框，所述插入包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，其中所述变换在桡足动物萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，并且其中所述插入在桡足动物萤光素酶序列中对修饰耐受的不同的残基上或区域中。89.权利要求88的多核苷酸，其中所述变换在对应曲萤萤光素酶的残基43-53、残基63-73、残基79-89、残基95-105、残基105-115、残基109-119、残基121-131或残基157-168的区域中。90.权利要求23或33的方法，其中所述混合物、宿主细胞、发光的检测或测定、或其任何组合是在约3(TC-约47°C。91.权利要求31的方法，其中所述宿主细胞、样品、发光的检测或测定、或其任何组合是在约30。C-约47°C。92.权利要求74的方法，其中所述细胞、活性的检测或测定、或其任何组合是在约30。C-约47°C。93.权利要求23、31或33的方法，其中所述宿主细胞用所述多核苷酸稳定转染。94.权利要求74的方法，其中所述细胞用所述载体稳定转染。95.—种检测或测定细胞中的目的分子的存在或活性的方法，其包括a)提供包含具有载体的细胞的发光反应混合物，所述载体具有包含经修饰的萤光素酶的可读框的核酸序列，其中所述经修饰的营光素酶相对于相应未修饰的萤光素酶包含插入，所述插入在萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述插入相对于相应未修饰的萤光素酶包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，其中所述经修饰的萦光素酶的活性是可检测的，并且其中所述混合物是在约3(TC-约47°C;和b)检测或测定所述混合物中的发光，从而检测或测定所述细胞中的所述分子的存在、量或活性。96.权利要求95的方法，其中所述经修饰的萤光素酶是曱虫营光素酶。97.权利要求96的方法，其中所述经修饰的曱虫萤光素酶是萤火虫萤光素酶。98.权利要求96的方法，其中所述经修饰的曱虫萤光素酶是叩头虫萤光素酶。99.权利要求95的方法，其中所述经修饰的萤光素酶是环状变换萤光素酶。100.权利要求95的方法，其中所述插入是环状核苷酸结合位点。101.权利要求95的方法，其中所述混合物进一步包含一种或多种测试试剂。102.权利要求101的方法，其中将所述混合物中的所述发光与缺乏所述一种或多种测试试剂的相应混合物中的发光比较。103.权利要求95的方法，其中使所述混合物处于约5。/qC02的条件。104.—种鉴定直接或间接改变经修饰的曱虫营光素酶中的异源序列活性的试剂，其包括a)使包含表达经修饰的萤光素酶的细胞的发光反应混合物与一种或多种试剂接触，其中所述经修饰的萤光素酶由具有核酸序列的载体编码，所述核酸序列包含经修饰的萤光素酶的可读框，其中所述经修饰的萤光素酶相对于相应未修饰的萤光素酶包含异源序列，所述异源序列在萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述异源序列相对于相应未修饰的萤光素酶包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，其中所述经修饰的萤光素酶的活性是可检测的，并且其中所述混合物是在约30。c-约47°c;和b)鉴定所述一种或多种试剂是否改变所述经修饰的甲虫萤光素酶的活性。105.权利要求104的方法，其中所述经修饰的萤光素酶是曱虫萤光素酶。106.权利要求105的方法，其中所述曱虫萤光素酶是萤火虫安光素酶。107.权利要求105的方法，其中所述甲虫萤光素酶是叩头虫萤光素酶。108.权利要求95或105的方法，其中所述细胞用所述载体稳定转染。109.权利要求104的方法，其中所述异源序列是环状核苷酸结合位点。110.权利要求104的方法，其中对所述混合物处于约5%C02的条件。111.权利要求95或104的方法，其中所述经修饰的营光素酶是经修饰的珊瑚虫萦光素酶。112.权利要求40的多核苦酸，其中所述插入包括丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶的肽底物。113.权利要求40的多核苷酸，其中所述插入包括磷酸丝氨酸肽结合结构域、磷酸苏氨酸肽结合结构域、或磷酸酪氨酸肽结合结构域。114.一种包含核酸序列的多核苦酸，所述核酸序列包含环状变换萤光素酶的可读框，所述环状变换萤光素酶包含异源氨基酸序列，所述异源氨基酸序列包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶的肽底物，所述萤光素酶在其中相应的未变换萤光素酶对修饰耐受的位点上或区域中进行变换，并且其中所述环状变换萤光素酶的活性是可检测的。115.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含环状变换萤光素酶的可读框，所述环状变换萤光素酶包含异源氨基酸序列，所述异源氨基酸序列包含磷酸丝氨酸肽结合结构域、磷酸苏氨酸肽结合结构域、或磷酸酪氨酸肽结合结构域，所述萤光素酶在其中相应的未变换萤光素酶对修饰耐受的位点上或区域中进行变换，并且其中所述环状变换萤光素酶的活性是可检测的。116.权利要求114或115的多核苷酸，其中所述萤光素酶是珊瑚虫萤光素酶。117.权利要求114或115的多核苷酸，其中所述萤光素酶是曱虫萦光素酶。118.—种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的十足目动物萤光素酶的可读框，所述经修饰的十足目动物萤光素酶相对于相应未修饰的十足目动物萤光素酶包含插入和十足目动物萤光素酶序列的笫一个片段，其中所述第一个片段具有所述相应未修饰的成熟的十足目动物萦光素酶的至少35个邻接氨基酸残基，其中所述插入在成熟的十足目动物萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述经修饰的十足目动物萤光素酶的活性由十足目动物萦光素酶序列的笫二个片段增加，所述第二个片段对应于相应未修饰的成熟的十足目动物萤光素酶的不同的至少35个邻接氨基酸残基，其中所述插入包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列。119.一种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列包含经修饰的十足目动物萤光素酶的可读框，其中所述经修饰的十足目动物萤光素酶相对于相应未^f奮饰的十足目动物萤光素酶包含内部插入，所述插入在成熟的十足目动物萤光素酶序列中对修饰耐受的残基上或区域中，其中所述插入相对于相应未修饰的成熟的十足目动物萤光素酶包含与目的分子直接或间接相互作用的氨基酸序列，并且其中所述经修饰的十足目动物萤光素酶的活性是可检测的。120.权利要求118的多核苷酸，其中所述第一个片段具有至少45-至少85个残基。121.权利要求119的多核苷酸，其中所述插入在对应刺虾萤光素酶的残基45-55或残基79-89的区域中。122.—种测定天然蛋白质中对修饰耐受的一个或多个位点的方法，其包括在可能具有包括二级结构的天然结构的蛋白质中鉴定所迷蛋白质的所述氨基酸序列中的一个或多个残基，所述残基在具有多个亲水性残基的区域中，所述区域在所述天然蛋白质结构中不太可能形成二级结构。全文摘要提供了作为分子传感器的经修饰的萤光素酶蛋白质，所述分子包括cAMP、cGMP、钙、其螯合剂、激酶或磷酸酶。还提供了任选包含一个或多个异源氨基酸序列的环状变换珊瑚虫萤光素酶蛋白质和十足目甲壳类动物萤光素酶蛋白质，所述异源氨基酸序列中的至少一个与目的分子直接或间接相互作用。进一步提供了包含一个或多个异源氨基酸序列的插入的经修饰的珊瑚虫萤光素酶蛋白质和十足目甲壳类动物萤光素酶蛋白质，所述异源氨基酸序列中的至少一个与目的分子直接或间接相互作用。文档编号C12N9/02GK101473031SQ200780020577公开日2009年7月1日申请日期2007年4月2日优先权日2006年4月3日发明者B·宾科夫斯基,F·范,K·V·伍德,M·G·伍德,S·维达尔申请人:普罗美加公司