专利名称：：一株产凝乳酶的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株产凝乳酶的枯草芽孢杆菌QL-2(BacillussubtilisQL-2)，该菌株分离自奶酪中，现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是M208023，其发酵液富含凝乳酶并具有良好的凝乳作用，具有用于凝乳酶工业生产的潜力。
背景技术：
：干酪富含多种营养成分，容易消化吸收，又不易致肥，因此被营养学家奉为理想的食品，誉之为"奶黄金"[1]。凝乳酶是干酪生产中凝固牛乳的关键性酶制剂[2]，它是一种酸性蛋白酶。凝乳过程可分为两步第一步是酶专一性地水解乳中K-酪蛋白多肽链的105106位苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键，形成稳定的副K-酪蛋白及亲水性的糖巨肽；第二步是当总的K-酪蛋白被水解掉约85C/a寸，在Ca+存在下通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝固的乳，从而使变化的凝乳酶、酪蛋白胶粒发生沉淀[3'4]。凝乳酶来源广泛，可从动物、植物及微生物中得到。传统的凝乳酶来源于小牛皱胃(第4胃)中提取的皱胃酶[5]，但随着世界奶酪产业不断发展壮大，每年宰杀大量小牛以获得凝乳酶的方法显然是与现代工业发展极不协调的；植物性凝乳酶可从木瓜、菠萝、无花果属植物、红花等植物中提取[6]，但其蛋白水解能力强，并且受时间、地域、生长周期长等条件限制，难以发展；目前发现有40余种微生物可生产一定活力的凝乳酶，这些微生物主要是放线菌、细菌和真菌等[7]。自1964年，ArimaW发现毛霉属微小毛霉(Mucorpusillus)可以产生高活力凝乳酶后，许多科学家对其展开了大量研究。中科院微生物所的钱世均等人[9]从19株毛霉中筛选出一株微小毛霉菌株，完成了菌种培养、酶提取和纯化，发现经纯化后，纯酶的凝乳活力与蛋白水解活力的比值大大提高，且完全没有纤维素活性。并对其产生的凝乳性蛋白酶进行了纯化和酶学性质的研究。郭光远等人[1<)]在对云南不同地区放线菌区及资源的考察过程中，对所分离到的2502株放线菌、真菌、细菌进行了凝乳酶产生菌的筛选，结果发现放线菌中链霉菌属(Str印tomyces)、小单胞菌属(Micromonospora)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)等和9.8%的真菌及8.8%细菌中都有一定的产酶活力。目前在国际上的微生物凝乳酶主要是由米黑毛霉生产的[11]。本发明中所涉及的一株枯草芽孢杆菌QL-2，其发酵液富含凝乳酶，且凝乳活性较高，而且生长周期短，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高较以前的产凝乳酶微生物具有较大的优势。枯草芽孢杆菌是常见的非致病菌，利用其发酵所产的凝乳酶适合工业化生产奶酪。参考文献杜琨，张亚宁.干酪的营养价值及研究动态[J].中国食物与营养，2005，10:45-46.SatyendraKGarg，BhavdishNjohri.FoodReviewsInternational[J].1994.10(3):313-355.井乐罡.凝乳酶及其在干酪生产中的应用[J].中国畜产与食品，1997，2:78-79.[4]郭本恒.乳品化学[M].北京中国轻工业出版社，2001.刘振民，刘辉等.酒药中凝乳酶菌株筛选及产酶条件研究[J].食品与发酵工业，2000，27(5):8-lite]张红梅，刘钟滨.凝乳酶的研究进展[J].同济大学学报(医学版)，2004，25(3):254-257.周俊清，林亲录，赵谋明.微生物源凝乳酶的研究进展[J].中国食品添加剂，2004，2:6-9.Arima，K，andIwasaki，S.MilkCoagulatingEnzyme"MicrobialRennet"andMethodofPreparationThereof.UnitedStatedPaptent，3，151，039.钱世均，张纯青，矫庆华等.微小毛霉凝乳酶的纯化和性质[J].微生物学报，1989:272-277.郭光远，姜成林，马俊.微生物凝乳酶的研究I.菌株的筛选、发酵、制备及毒性[J].微生物学通报，1988，15(5):207-210.GATucker,LJWood(英)著.李雁群，肖功年译.酶在食品加工中的应用[M].中国轻工业出版社，2001.
发明内容本发明所涉及的产凝乳酶细菌为枯草芽孢杆菌QL-2(BacillussubtilisQL-2)，是由奶酪中分离的菌株。现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号M208023。本发明所述的产凝乳酶的枯草芽孢杆菌QL-2的培养方法如下液体培养把菌株接种于NA(牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母浸膏lg、蒸馏水lOOOml、pH7.0)液体培养基中，在28-3(TC温度下，转速120r/m的摇床上培养28-32h;固体培养NA(牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母浸膏lg、蒸馏水1000ml、PH7.0)液体培养基中加1.0-1.5%的琼脂粉，制成平板，接种菌株，于28-3(TC培养箱中培养2天。本发明所述的产凝乳酶的枯草芽孢杆菌QL-2的特征如下(1).形态特征菌体为杆状，周生鞭毛；少数产芽孢，中生，椭圆型，孢囊膨大；革兰氏染色阳性。(2).培养特征该菌株在NA培养基上3(TC培养2天，菌落乳白色，圆形，边缘整齐，中央隆起如馒头状，光滑，不易挑起，不产生可溶性色素，有异味。(3).菌株的生化特征接触酶阳性，兼性好氧生长，VP反应阳性，VP液中产酸PH值小于6.0，水解酪蛋白，蔗糖产生还原糖，产生果聚糖，水解淀粉、明胶，不水解酪氨酸。(4).菌株的生理特性可利用葡萄糖产酸不产气，可利用蔗糖、麦芽糖、肌醇、甘露醇、可溶性淀粉、乙酸钠，不利用半乳糖。最适生长PH在89之间，10%的氯化钠中可生长，最适生长温度为37'C。(5).遗传学特征扩增与测序引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492r:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'517f:5'-CCAGCAGCCGCGGTAAT-3'提取QL-2菌株的总DNA，用引物27f和1492r进行PC財广增该菌株的16SrDNA基因，用引物27f，1492r，517f，进行测序，该菌株的16SrDNA基因序列为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>1381ACCCCGAAGTTTCCGGTTGCAAGG(6).枯草芽孢杆菌QL-2的发酵液富含凝乳酶并具有良好的凝乳作用。具有用于凝乳酶工业生产的潜力。具体实施例方式实施例l从奶酪中用稀释平板法分离枯草芽孢杆菌QL-2:(1)制备奶酪稀释液称取奶酪5g，迅速倒入带玻璃珠的45ml无菌水中，摇床上振荡20min，静置使澄清，即成为10—^勺悬液。无菌操作吸取其上清液O.5ml加入4.5ml无菌水中即为10—2稀释液。如此重复，用无菌水稀释为1(T3、10—4、10—5、10—6、10^共7个浓度。(2)培养各稀释度加入冷至455(TC的灭菌的酪蛋白水解平板(取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中或用50mL脱脂牛奶，另称l.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至455(TC时，将两液混匀倒平板即成)，立即混匀，制成平板。倒置恒温箱内3(TC培养。(3)挑取单菌落23天后，待平板上长出菌落后，挑取周围有透明圈的单菌落于30ml灭菌的NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，酵母浸膏l.Og，水1000ml，PH7.0)液体培养基中，摇床上3(TC恒温振荡培养。(4)纯化采用平板划线分离法纯化，将摇瓶培养物划线于NA固体培养基上进行分离。涂平板检验直至获得纯培养，获得枯草芽孢杆菌QL-2。该菌培养物在NA固体培养基上呈乳白色，菌落圆形，中央隆起，边缘较光滑，中央湿润易挑取。(5)保藏纯化的枯草芽孢杆菌QL-2采用甘油-2(TC保存。实施例2枯草芽孢杆菌QL-2的特征鉴定(1).菌体形态观察和染色反应将枯草芽孢杆菌QL-2接种于NA固体培养基中恒温培养适合时间后染色镜检。包括简单染色、革兰氏染色(结晶紫草酸胺染色法)、鞭毛染色(硝酸银染色法)、荚膜染色(湿墨水法)、芽孢染色(改良的Schaeffer-Fulton氏染色法)。染色结果枯草芽孢杆菌QL-2为杆状细菌，G+，鞭毛周生，每个菌体上着生有816根鞭毛，其长度约为菌体的12倍；有荚膜；少数产芽孢，中生，芽孢囊膨大。(2).环境因素对枯草芽孢杆菌QL-2的影响02对枯草芽孢杆菌QL-2的影响采用深层琼脂法来测定02对枯草芽孢杆菌QL-2生长的影响，在装有葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂深层培养基(pH7.0)的试管中接入枯草芽孢杆菌QL-2，28。C恒温箱内静置培养48h后开始连续观察其生长状况，直至结果清晰为止。结果显示枯草芽孢杆菌QL-2在表面及接近表面处都生长，为好氧或兼性厌氧菌。温度对枯草芽孢杆菌QL-2的影响制备NA琼脂平板，使凝固后的培养基厚度为一般培养基的1.52倍。将枯草芽孢杆菌QL-2涂平板，各取两套平板倒置于4。C、15°C、30°C、37°C、45°C、50°C、55。C及60。C条件下保温48h，观察其生长状况。由下表看出，枯草芽孢杆菌QL-2的最适生长温度为37。C，45'C以上的温度下仍可正常生长，为高温微生物。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>"一"表示不生长，"+"表示生长较差，"++"表示生长一般，"+++"表示生长良好。渗透压对枯草芽孢杆菌QL-2的影响制备含0.85%、5%、10%、15%、20X及25XNaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板。将枯草芽孢杆菌QL-2涂平板，28'C恒温箱内培养。4d后观察并记录含不同浓度NaCl平板上枯草芽孢杆菌QL-2的生长情况。由下表看出，枯草芽孢杆菌QL-2不能在15X的盐浓度下生长，它不属于嗜盐细菌。表2渗透压对QL-2生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>"一"表示不生长，"+"表示生长较差，"++"表示生长一般，"+++"表示生长良好。pH对枯草芽孢杆菌QL-2的影响制备pH3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的NA液体培养基。无菌操作接种等量的枯草芽孢杆菌QL-2过夜培养物，保证各培养瓶中接入的菌液浓度一致。130rpm/min，3(TC下振荡培养24h后，测定培养物的0D600值。由下表看出，枯草芽孢杆菌QL-2的生长最适pH在89之间，而且它在碱性环境中的生长状况明显好于酸性环境。表3pH对枯草芽孢杆菌QL-2生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.枯草芽孢杆菌QL-2的生理生化反应以全自动微生物鉴定系统VITEK32及配套需氧芽孢杆菌鉴定卡(BAC卡)进行生化特性鉴定，共检测31项生化指标。表4枯草芽孢杆菌QL-2的生化鉴定结果需氧芽孢杆菌鉴定卡BAC<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注生化指标縮写全称参考VITEK需氧芽孢杆菌鉴定卡(BAC卡)使用说明。补做H202反应，呈阳性。明显符合枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的特征c4、16SrDNA寡核苷酸序列分析扩增与测序引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492r:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'517f:5'-CCAGCAGCCGCGGTAAT-3'提取QL-2菌株的总DNA，用引物27f和1492r进行PC財广增该菌株的16SrDNA基因，用引物27f，1492r，517f，进行测序，该菌株的16SrDNA基因序列为:1381ACCCCGAAGTTTCCGGTTGCAAGG通过Internet网(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast/blast.cgi)，用BLAST软件将枯草芽孢杆菌QL-2的16SrDNA序列与GenBank中已知序列进行比较。结果表明枯草芽孢杆菌QL-2与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的序列同源性达99%，实施例3枯草芽孢杆菌QL-2产凝乳酶的活性及其发酵液的凝乳活性(1).枯草芽孢杆菌QL-2产凝乳酶的活性将枯草芽孢杆菌QL-2在3(TC120rpm振荡培养24h的培养物接种到NA液体培养基(30m1/250ml三角瓶，接种量为1:30)中，30°C120rpm摇床上振荡培养。培养24小时后，离心用上清液测定其凝乳酶活性，其发酵液凝乳酶活性达到最高44.4SU。2.枯草芽孢杆菌QL-2发酵液中凝乳酶的含量以Maxiren凝乳酶为标准品，做凝乳酶浓度与凝乳酶活性的标准曲线。根据枯草芽孢杆菌QL-2培养30h时的发酵液凝乳酶活性计算出凝乳酶的含量为5100mg/L。权利要求权利要求1本发明为一株产凝乳酶的枯草芽孢杆菌QL-2(BacillussubtilisQL-2)，该菌株分离自奶酪中，其发酵液具有良好的凝乳作用，现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M208023；2.根据权利要求l所述的枯草芽孢杆菌QL-2，其特征在于(1)形态特征菌体为杆状，周生鞭毛；少数产芽孢，中生，椭圆型，孢囊膨大；革兰氏染色阳性；(2)培养特征该菌株在NA培养基上3(TC培养2天，菌落乳白色，圆形，边缘整齐，中央隆起如馒头状，光滑，不易挑起，不产生可溶性色素，有异味；(3)菌株的生化特征接触酶阳性，兼性好氧生长，VP反应阳性，VP液中产酸PH值小于6.0，水解酪蛋白，蔗糖产生还原糖，产生果聚糖，水解淀粉、明胶，不水解酪氨酸,；(4)菌株的生理特性可利用葡萄糖产酸不产气，可利用蔗糖、麦芽糖、肌醇、甘露醇、可溶性淀粉、乙酸钠，不利用半乳糖，最适生长PH在89之间，10%的氯化钠中可生长，最适生长温度为37'C;(5)菌株的16SrDNA基因序列为3.根据权利要求l和2所述的一株枯草芽孢杆菌QL-2，其特征在于该菌株的发酵液富含凝乳酶并具有良好的凝乳作用，具有用于凝乳酶工业生产的潜力。全文摘要本发明涉及一株产凝乳酶的枯草芽孢杆菌。该菌株分离自奶酪中，现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是M208023，名称为枯草芽孢杆菌QL-2(BacillussubtilisQL-2)。其发酵液富含凝乳酶并具有良好的凝乳作用。具有用于凝乳酶工业生产的潜力。文档编号C12R1/125GK101434927SQ200810301109公开日2009年5月20日申请日期2008年4月14日优先权日2008年4月14日发明者刘河涛,洋李,李红玉申请人:李红玉;兰州大学