专利名称：一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品过敏源甲壳类基因的快速检测技术，适合于食品过敏源甲壳 类基因成分的定性检测。
背景技术：
食品过敏是食品引起的机体对免疫系统的异常反应，多因人体对某些外来食品成 分的反应过火或对某些蛋白质以及某些食品成分缺乏消化能力所致。常见的食品过敏与免 疫球蛋白E有关；而致敏物即为某些蛋白。食品过敏目前还没有很好的治疗手段。常见的 易过敏食品有甲壳类、花生、树坚果、鸡蛋、牛奶、小麦制品、豆制品等，其中甲壳类海鲜食 品是最严重的过敏源之一。近年来针对聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术在甲壳类基 因检测方面得到的应用，是目前甲壳类食品过敏源基因检测的主要方法，目前国内外市场 上已经有了关于甲壳类食品过敏源基因检测试剂盒，但是其检测都需要数目较多且价格昂 贵的一系列仪器，尤其不适合于现场快速检测与基层单位的广泛应用；且容易造成假阳性 等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、灵敏、快速地检测食品过敏原甲壳类基因的恒 温扩增检测试剂盒及其检测方法，适合于现场快速检测。本发明提供一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒，包括如下部分a) DNA 裂解液pH8. 0、浓度为lOmmol/L的Tris-HCl缓冲液，含有质量浓度为1 %的chelex树脂；b)恒温扩增反应液包含正向外围引物、反向外围引物、两条探针、一条交叉扩增引物、 1 X ThermoIbuffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA 聚合酶和无菌双蒸水；其中所述的正向外围引物序列为5，-GATTAAGTTACTTTAG-3，；所述的反向外围引物序列为5，-GATTTAAAGGTCGAACAG-3，；所述的两条探针的序列分别为5’ -TTCAACATCGAGGTCGC-3’ 和 5，-TGTCGATATGAACTCTC-3，，其中一条探针的5，端标记生物素(Biotin)，另外一条探针5， 端标记 FitC(FitC)；所述的交叉引物为5，-TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT-3，；所述的IXThermol buffer 含有摩尔浓度为 20mM 的 Tris_HCl、10mM 的 KClUOmM 的(NH4) 2S04、2mM 的 MgSO4 以及质量浓度为 0. 的 Triton X-100，pH 8. 8。所述恒温扩增检测试剂盒，还包含阳性对照模板，该阳性对照模板为含有甲壳类 食品过敏源16S rRNA基因片段的质粒。
本发明还提供用所述恒温扩增检测试剂盒检测食品过敏原甲壳类基因的方法，包 括下列步骤a)用DNA裂解液从待检测的标本中提取DNA ；b)将步骤a)提取的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在 58°C下扩增反应80分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，其中，阳性 对照模板为含有甲壳类食品过敏源16S rRNA基因，所述阴性对照模板为无菌双蒸水；c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置(申请号=200610109620. 4)中 进行检测，15min以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲壳类食品 过敏源核酸。本试剂盒的工作原理在本发明提供本试剂盒中，有两条外围引物，一条交叉引物引物和两条检测探针。 本试剂盒中的5条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置 换DNA合成不断的自我循环。步骤b)的扩增反应中包含两个阶段第1阶段为起始阶段，任何一条引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时， 另一条链就会解离，变成单链。交叉引物可与本身置换出来的单链形成互补结构，形成发夹 状结构的单链，该结构为基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段，以发夹状结构为模板，两条探针可以与发夹状结构中 的环结合，开始链置换合成反应，解离出的由探针扩增出来的单链可以重新解链成为扩增 的模板。同时两条探针可以形成一个双链杂交复合物。当扩增出目的序列时，由于该目的序列上同时标记了 Biotin和FitC，因此试纸条 的检测线上呈阳性。在本发明提供的食品过敏源甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应 条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检 测试纸条检测系统相结合，建立了食品过敏源甲壳类核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂 盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测甲壳类食品过敏源的要求。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1.特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；
2.反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；
3.整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会
4.满足高通量和低通量的样品检测；
5.整个反应过程不需要复杂的仪器。
6.检测成本大大降低，适于检测一线或基层单位的应用。
图1表示本发明试剂盒用于检测食品过敏源甲壳类核酸的灵敏度。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。实施例1食品过敏源甲壳类核酸的恒温扩增检测试剂盒组成与配制一 .试剂盒组成a) DNA提取试剂(裂解液):10mmol/L的Tris-HCl (ρΗ8· 0)，其中含有质量浓度为 的chelex树脂；b)反应液两条外围引物(0.05μπιΟ1)，两条探针(0. δμπιο )，和一条交叉引物 (0. 5 μ mol)，1 X Thermol buffer, MgSO4 (6mmol)，dNTPs 溶液(0. 4mmol)，Bst DNA 聚合酶 (IOU)和无菌双蒸水组成。两条外围引物包括正向外围引物序列为5，-GATTAAGTTACTTTAG-3’，反向外围引物序列为5，-GATTTAAAGGTCGAACAG-3，。交叉引物5，-TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT-3，。两条探针的序列为分别为“5，-TTCAACATCGAGGTCGC-3，” 和 “5，-TGTCGATATGAACTCTC-3，”，其中一条探针的5，端标记生物素(Biotin)，另外一条探针 5’端标记FitC(异硫氰酸荧光素)。IXThermol buffer 的组成20mM 的 Tris-HCl (pH 8. 8)，IOmM 的 KCl，IOmM 的 (NH4)2S04,2mM 的 MgS04，质量浓度为 0. 的 Triton X-100。所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。c)阳性对照含有食品过敏源甲壳类16S rRNA基因[NCBI gene bank number C000219-1 (367-509)]的pUCm_Teasy载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。该载体的制备步骤利用两条外围扩增引物以河虾的基因组DNA模板进行PCR扩 增获得目的基因；用PR0MEGA的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩 增产物连接到质粒中；将连接后的产物转化到大肠杆菌DH5 α中，然后将该大肠杆菌DH5 α 进行培养并进行质粒提取。用分光光度计测A26tl定量并稀释至IO6拷贝/ μ L，-20°C保存。d)阴性对照无菌超纯水。实施例2用本发明试剂盒检测食品过敏源甲壳类核酸的具体方法a)用DNA裂解液从待检测的标本中提取DNA 在标本试管中加入40 μ L的DNA提 取试剂，再往标本试管中加0. 5-0. Ig的虾片标本，直接沸水浴lOmin，IOOOOg离心5min，上 清液为标本DNA。b)取标本DNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在58°C进行扩增反应80min， 其中标本DNA4 μ 1，反应液16 μ L ；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15min以后判读结 果。当样本中含有食品过敏源甲壳类核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒不同批次之间的检测 结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性 好，且对样本的检测仅仅需要2小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1 个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，减少了人力的浪费，节 约了综合检测成本。实施例3用本发明试剂盒检测食品过敏源甲壳类核酸的专一性
按照实施例2的方法检测带鱼、跳鱼、水蟾、青鱼、草鱼、龙虾、小虾米、蛤利、米虾、 青蟹、河虾、罗氏沼虾、对虾、河蟹是否含有甲壳类食品过敏源核酸。其结果如下表 注“ _ ”表示阴性，“ + ”表示阳性从上表测试结果可见，用本发明试剂盒检测食品过敏源甲壳类核酸具有很强的专一性。实施例4用本发明试剂盒检测甲壳类食品过敏源核酸的灵敏度提取河虾的DNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为IO4拷贝/μ L、103拷贝/μ L、 IO2拷贝/ μ LUO1拷贝/ μ L，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测甲壳 类食品过敏源核酸的灵敏度。结果如图1所示，图中1-4分别表示IO4拷贝/ μ L、103拷贝/ μ L、IO2拷贝/ μ L、 10拷贝/ μ L，5是阴性对照，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很 高的灵敏度，可以满足快速检测甲壳类食品过敏源的要求。
权利要求
一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒，其特征是包括如下部分a)DNA裂解液pH8.0、浓度为10mmol/L的Tris HCl缓冲液，含有质量浓度为1％的chelex树脂；b)恒温扩增反应液包含正向外围引物、反向外围引物、两条探针、一条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中所述的正向外围引物序列为5’ GATTAAGTTACTTTAG 3’；所述的反向外围引物序列为5’ GATTTAAAGGTCGAACAG 3’；所述的两条探针的序列分别为5’ TTCAACATCGAGGTCGC 3’和5’ TGTCGATATGAACTCTC 3’，其中一条探针的5’端标记生物素，另外一条探针5’端标记FitC；所述的交叉引物为5’ TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT 3’；所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X 100，pH 8.8。
2.根据权利要求1所述的食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒，其特征是包 含阳性对照模板，该阳性对照模板为含有甲壳类食品过敏源16S rRNA基因片段的质粒。
3.—种权利要求1的食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒检测食品过敏原 甲壳类基因的方法，其特征是包括下列步骤a)用DNA裂解液从待检测的标本中提取DNA；b)将步骤a)提取的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在58°C下 扩增反应80分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，其中，阳性对照模 板为含有甲壳类食品过敏源16S rRNA基因，所述阴性对照模板为无菌双蒸水；c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15min以后判读结果，当 试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲壳类食品过敏源核酸。
全文摘要
本发明提供一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及检测方法。该试剂盒，包括DNA裂解液和恒温扩增反应液；所述恒温扩增反应液包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、一条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；本发明还提供用所述试剂盒检测食品过敏原甲壳类基因的方法，包括下列步骤用DNA裂解液从待检测的标本中提取DNA；进行扩增反应；检测。该检测方法准确、灵敏，能够快速地检测食品过敏原甲壳类基因，适合于现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101899501SQ20101010838
公开日2010年12月1日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者吴亚君, 吴斌, 尤其敏, 张睿, 徐高连, 杨海荣, 沈崇钰, 石建华, 祝长青, 胡林, 蒋原, 袁飞, 邵景东, 陈颖 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心;中国检验检疫科学研究院食品安全研究所;杭州优思达生物技术有限公司