专利名称：Ura3缺陷型毕赤酵母x-33菌株的构建及应用的制作方法
技术领域：
一株乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶(urU)缺陷型毕赤酵母(P. pastoris)X-33菌 株的构建及利用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
酵母嘧啶核苷酸的从头生物合成以谷氨酰胺为原料，经多步生物催化生成乳清昔 酸(OMP)，再由OMP脱羧酶催化脱羧生成尿苷酸(UMP)，后者进一步催化生成尿苷三磷酸 (UTP)和胞苷三磷酸(CTP)。酵母的AMP脱羧酶(URA!3)通常由ura3基因编码，是嘧啶生物 合成所必需的酶；若OMP脱羧酶功能缺失，嘧啶生物合成途径将中断，在没有外源尿嘧啶补 给条件下酵母无法存活。乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因ura3做为一种选择性标记 基因，常用于酿酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母和裂殖酵母等酵母菌的遗传操作或遗传操作 系统的构建。一般来讲，通过部分或全部缺失ura3基因可构建乳清酸核苷_5’ -磷酸脱羧酶功 能缺失的工程菌株，即尿嘧啶营养缺陷型菌株；而ura3基因连接到载体的适当位置后，就 可以作为负向选择标记基因进行遗传操作。或用于向尿嘧啶营养缺陷型菌株中引入新基 因，构建各种下程菌株。而且，工程菌株构建时不要求载体携带的ura3基因来源于相同微 生物种属。毕赤酵母表达系统具有像原核生物生长速度快、便于基因操作、成本低廉、便于大 规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核细胞的大部分翻译后加工修饰功能(如糖 基化过程等)，已广泛用于各种蛋白的表达，因而用毕赤酵母细胞生产药用蛋白日益引起人 们的青睐。毕赤酵母X-33是^vitrogen公司推出的野生型没有转化过任何基因的毕赤酵 母原始菌株为甲醇快速利用型，耐受性比较好，转化率和表达量相对而言较高被广泛应用 于外源蛋白的表达。因此构建X-33的ura3基因缺陷性菌株对各种药用蛋白工程菌的开发 以及进一步的X-33工程化改造如糖基化改造提供了很好的平台。
发明内容
本发明的目的在于构建得到ura3基因缺陷型的X-33(AUra3)菌株。本发明构建 获得URA3突变菌株的方法如下.1)URA3基因的同源置换DNA片段的构建根据GenBank (AF321098)中报道的毕赤 酵母URA3(orotidine-5’-Phosphate decarboxylase)基因序列设计两对寡核苷酸引物。以 X-33菌株基因组为模板，用引物URA5F、URA5R和URA3F、URA3R，分别PCR扩增URA3基因两 端同源臂片段URA5，和URA3，，各700bp、600bp左右。然后以URA5，和URA3，为模板，URA5F 和URA3R为引物，用重叠PCR扩增URA3基因同源置换DNA片段URA 5，-3，，约1300bp。引 物序列分别为URA5F 5' -ATTTGCGGCCGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC-3’URA3R 5' -ATTTGCGGCCGCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG-3’
URA5R :5’ -CAATTGATCCCCTGTACATACTTGTAATTAGGTATCTATCCCTTTGATCAGGTT-3’URA3F :5’ -AACCTGATCAAAGGGATAGATACCTAATTACAAGTATGTACAGGGGATCAATTG-3'2)敲除毕赤酵母X-33的URA3基因，构建营养缺陷型菌株将URA3基因两端同 源臂融合片段URA5，-3，电击转入X-33感受态细胞，涂布含有5-F0A和尿嘧啶的MD培养 基(YNB1. ；34%，葡萄糖 2%，琼脂粉 1. 5%，尿嘧啶 100ug/mL，5-F0A lmg/mL)上，30°C培养 3-5d。挑选上述培养基上长出的单菌落，用牙签分别点种于MD培养基(YNBl.34%，葡萄糖 2%，琼脂粉1. 5% )和MDU培养基(YNB1. 34%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%,尿嘧啶IOOug/ mL)上，30°C培养3-5d，然后选择在MDU培养基上生长良好而在MD培养基上不能生长的菌 株，反复筛选三轮至性状稳定，提取基因组用URA3基因两端引物URA5F、URA3R进行PCR鉴 定，筛选出X-33 ( Δ ura3)菌株。本发明获得的毕赤酵母X33菌种经过多次传代，遗传性状稳定。同时 X-33 ( Δ ura3)菌还可以用于进一步的工程化改造，从而获得更适合生产各种药用蛋白的酵 母工程菌。
图1重叠PCR得到的URA3基因同源置换DNA片段M =DNA分子量标准；1 重叠PCR得到的URA3基因同源置换DNA片段。图 2P.pastoris X-33 ( Δ ura3)菌株的鉴定。M :DNA分子量标准；1 野生型P. pastor is X-33以URA5F和URA3R为引物的PCR 结果；2 :P. pastor is X-33 ( Δ ura3)以 URA5F 和 URA3R 为引物的 PCR 结果。
具体实施例方式实施例一URA3基因的克隆及其同源置换DNA片段的构建从毕赤酵母X_33基因组PCR扩 增的URA3基因两端同源臂片段URA5，、URA3，和融合同源臂片段分别为0. 7kb,0. 6kb和 1. 3kb(图1)。测序结果表明各序列、及融合顺序均正确。实施例二URA3基因的敲除和鉴定URA5’ _3’融合同源臂片段电击转入酵母后，与基因组 中的URA3基因发生双交换同源重组，置换掉URA3基因编码框中约700bp的序列。而未 发生同源重组的菌株由于携带URA3基因不能在含有5-F0A的培养基上生长，因此可以在 含5-F0A和尿嘧啶的MD培养基上筛选出ura3缺失菌株。挑选经过表型鉴定且性状稳定 的菌株，用外部引物URA5F和URA3R进行基因组PCR鉴定，野生型X-33菌的URA3基因大 小为2043bp，因此扩增产物为2000bp左右；ura3缺失菌的URA3基因编码框中约700bp 的序列被置换掉，扩增产物应为1300bp左右，电泳结果与预期一致(图2)，说明筛选的为 P.pastorisX-33(Δura3)。
权利要求
1.一种 P. pastoris X-33 的 OCHl 缺陷型菌株。
2.根据权利要求1所述基因工程菌，其构建方法为采用同源重组敲除URA3基因。
3.权利要求1或2在以利用URA3基因作为选择标记，构建各种工程菌株方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷型毕赤酵母(P.pastoris)X-33菌株的构建及利用，属于生物工程技术领域。该下程菌株P.pastoris X-33(Δura3)是通过采用同源重组敲除目的基因的方法而获得。该菌株可以利用URA3基因作为选择标记，构建各种工程菌株。而且，工程菌株构建时不要求载体携带的ura3基因来源于相同微生物种属。同时提供了一个对X33后续的工程化改造如糖基化改造提供了更好的平台菌株，具有非常大的潜在应用前景。
文档编号C12N15/09GK102120966SQ201010580120
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者张大成, 朱瑞宇, 许永利, 金坚, 陈蕴, 雷楗勇 申请人:江南大学