专利名称：一个高喹啉降解基因及其应用的制作方法
一个高喹啉降解基因及其应用
背景技术：
喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，用途极其广泛，是多种医药、农产品、染料等生产中的重要原料和溶剂。但是喹啉及其衍生物可致癌、致畸、致突变，且难于生物降解，是环境中的严重污染物。环境中的喹啉主要来自煤气、化石燃料加工、煤焦油残余物和木材保存设施。此外，喹啉及其衍生物还是焦化废水、石油废水、制药废水等多种工业废水中的难降解有机污染物成分。有学者分别对2种焦化废水的有机物组成进行了分析，指出喹啉类化合物的含量居有机污染物的第二。由于喹啉含有1个电负性很强的氮原子使得其水溶性增强，因此这类化合物更易在环境中扩散和持久存在。已有调查发现在木馏油污染场所附近的地下水和土壤中喹啉及其羟基喹啉的浓度高达数个mg/L。除此之外，喹啉及其衍生物还存在于城市空气、烟草烟雾、海水和鱼的组织中，因此寻找有效去除喹啉的方法具有十分重要的意义。污染物的去除方法很多，大致分为物理法、化学法和生物法。物理法和化学法虽然去除效率高，但是成本高，容易产生二次污染。生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，现已成为污染治理技术中的首选方案之一。决定生化处理工艺成功、有效、适用的因素，除了工艺条件和操作管理外，用于污染物降解、转化等过程的功能基因的重要作用也是显而易见的。喹啉降解途径主要分为有氧代谢和厌氧代谢，其降解途径多种多样，但是对于喹啉降解特性及降解途的研究还停留在理论阶段。由于喹啉本身属于难降解有机杂环化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，因此，克隆能够稳定有效降解喹啉的基因是工作量更为巨大且困难的事情。目前对喹啉降解基因知之甚少，无法提供序列上的参考和方法上的借鉴，无法预测喹啉降解基因，只能通过工作量惊人的筛选和验证，实际很难完成。本发明人经过长期的大量而艰苦实验筛选和验证，意外地发现了一个具有高喹啉降解能力的新基因，该高喹啉降解能力还可以用于多种微生物，具有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供对喹啉具有高降解性的新基因，该基因编码下述(a)或 (b)所代表的蛋白质
(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)、与SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予高喹啉降解活性的蛋白质。编码上述(a)所述的蛋白质的基因是编码由SEQ ID No :2代表的氨基酸序列组成的赋予高喹啉降解活性的蛋白质的基因(命名为purDl)。purDl是从恶臭假单胞菌 (.Pseudomonas ^wiiVa) KT-ql-116中克隆得到的。KT-ql-116为本发明人从北京市肖家河污水处理厂活性污泥中经初筛和复筛等大量的实验得到的对喹啉具有高降解活性的恶臭假单胞菌，该菌株已于2008年12月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通卫生中心，保藏号为CGMCC No. 2790。目前报道的喹啉降解最大浓度为500mg/L，本发明的purDl及其编码蛋白赋予微生物的降解活性不仅能够降解500mg/L的喹啉，最大降解浓度能够达到850 mg/L。本发明对喹啉类污染物的治理具有非常重要的实际应用价值。本发明使用的“高喹啉降解”术语是指对喹啉的降解浓度高于500mg/L，优选降解浓度为500mg/L 850 mg/L，更优选浓度为700 mg/L 850 mg/L。编码上述(b)所述的蛋白质的基因是编码这些蛋白质的基因，这些蛋白质与SEQ ID No 2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸(比如1-5或 1-12个)的氨基酸序列组成，且赋予高喹啉降解活性。在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得编码本发明(a)或(b)氨基酸序列的核苷酸序列。另外，可通过如定点诱变技术等合成与突变体具有相同功能的本发明的突变体基因。本发明的另一个目的是提供了一种获得具高喹啉降解活性的微生物的方法将本发明的基因或含有本发明基因的重组体导入微生物，使其具有高喹啉降解活性。本发明所述的重组体是指包含根据本发明基因的重组载体。通过将根据本发明的基因导入合适的载体获得根据本发明的重组载体。上述重组载体还包含外源基因或外源 DNA片段。用于插入根据本发明基因的载体不受任何的限制，只要该载体可以在宿主中复制，优选为本领域常用的克隆载体和表达载体。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
图1是pBBRlMCS-purDl转化突变体D得到高喹啉降解菌株。KT_ql_116是正对照，广8为Dp广8，E为突变体E，作为负对照。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中的溶剂均为水，具 nT#jAL ((Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell,
David W. ,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。MM2 降解培养基=Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1 g/L，微量元素液 5. 0ml/L ；其中每 1000ml 微量元素液包括 CaCl2 · 2H20 0. 0004g, FeSO4 · 7H20 0. 04g, MnSO4 · 4H20 0. 04g, ZnSO4 · 7H20 0. 02g, CuSO4 · 5H20 0. 005g, CoCl2 · 6H20 0. 004g, NaCl 1. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 005g。灭菌冷却后添加喹啉终浓度为300mg/L。1/10LB固体培养基酵母粉0.5g/L，蛋白胨1 g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L ；灭菌后冷却至60°C后添加喹啉终浓度为200mg/L。LB液体培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。如需要，在以上培养基中添加相应的抗生素。卡那霉素终浓度5(^g/ml，庆大霉素终浓度30μβ/πι1。实施例1、高喹啉降解基因purDl的获得
一、降解菌/^ewi/offloaas putida KT-ql-116 Tn5突变体文库的建立 本发明人从北京市肖家河污水处理厂活性污泥中经初筛和复筛等大量的实验得到的对喹啉具有高降解活性的恶臭假单胞菌KT-ql-116，应用Tn5转座复合体技术建立细菌转座突变体文库的方法克隆高喹啉降解基因purDl。Tn5 Transposome是购自Epicentre公司的 EZ: :TN<Kan_2>Tnp Transposome Kit。1.降解菌Aei/i/offloaas putida KT-ql-116电转化感受态的制备
挑取KT-ql-116单菌落接种到20mlLB中，过夜培养。接种5ml培养液接种到250mlL中， 210rpm，30。C摇菌。菌液OD6tltl=L 1左右时停止摇菌，冰上放置lh。4。C，3000rpm离心lOmin， 去废液后用200ml冰冷的ddH20漂洗2遍，同样条件离心后去废液，用300mM蔗糖30ml漂洗 2遍，离心后用300mM蔗糖和10%甘油混合液漂洗1遍，离心后用lml300mM蔗糖和10%甘油混合液悬浮，分装40μ1/管，液氮快速冷冻后，放置在_80°C冰箱中。2.电转化获得突变体
采用MicroPuiser 生产电转化仪，40μ1感受态中加入 μ Tnp Transposome,电压 2. 5kV,时间 4. 4ms，加入 ImlLB 培养基，30°C, 200rpm 复苏 2h。3.突变体的获得
将复苏完的菌涂布在LB固体培养基平板上，30°C恒温培养箱中培养2天。将单菌落划线到1/10LB固体培养基筛选突变体。30°C培养15小时，观察突变体周围培养基颜色变化情况。根据颜色变化筛选Ae^/o^was putida KT-ql-116喹啉降解功能丧失的突变体。 1/10LB固体培养基为浅白色，若突变体降解喹啉会使培养基变成褐色，没有颜色变化者为喹啉降解功能缺失的突变体。挑取不能使培养基变色的菌，此菌即为^ewiZ0ffl0Z7aiS putida KT-ql-116喹啉降解菌的功能丧失突变体。共获得8株突变体，分别命名为A、B、C、D、E、F、 H、I。二、利用反向PCR获得Tn5插入序列的侧翼序列根据Τη5提供的序列，设计两对PCR引物，引物序列如下 Tn5 upl 5' -CGCAGA CGCAGACCGATACCAGGATCTTG-3‘， Tn5 downl 5' -GTAACCATGCATCATCAGGAGTACG-3‘；
Tn5 up 5' -GGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACG-3‘，
Tn5 down 5 ‘ -CATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACG-3‘
利用Tn5 upl和Tn5 downl、Tn5 up和Tn5 down扩增其侧翼序列。侧翼
序列连接T载体后测序。根据侧翼序列进一步设计引物a-Fl和a-Rl，序列如下
a-Fl 5' -TATACCACCGTCTATGAAACCG-3‘
a-Rl 5' -GATGAATCCGTAGATCACCAGA-3‘
用PCR扩增的高喹啉降解候选基因。获得的候选基因命名为purDl，由1083个核苷酸组成，如SEQ ID No 1所示；purDl编码的蛋白质由360个氨基酸组成，如SEQ ID No 2所
5不。实施例2、pBBRlMCS-purDl使突变菌株D具高喹啉降解活性一、pBBRlMCS-purDl 载体的构建
把克隆得到的PurDl连接到T-easy Blunt载体上，经测序无误后，用HindIII和XbaI 双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，回收PurDl片段后待用。用HindIII和)(baI双酶切广宿主质粒pBBRlMCS-5，然后用1%琼脂糖凝胶电泳，回收pBBRlMCS_5载体片段。取8μ1 purDl片段和 μ 处理好的pBBRlMCS-5，加入连接酶0. 5Pl，buffer μ ，16°C连接过夜。将连接产物转化到五cWi，菌落PCR检测单克隆，选取检测正确的克隆测序，选取测序正确的克隆，得到 pBBRlMCS-purDl。二、pBBRlMCS-purDl 转化突变菌株 D
突变菌株D是上述实施例1获得一个喹啉降解功能丧失的恶臭假单胞菌突变体， 我们用pBBRlMCS-purDl转化突变菌株D来验证候选基因purDl是否能使转基因微生物具有高喹啉抗性。同时，这也是一个功能互补实验，使得实施例1的实验更具有逻辑性和严谨性。用KT-ql-116电转化感受态的制备方法制备突变菌株D的电转化感受态。采用 MicroPuiser 电转化仪，在40μ1突变菌株D的感受态中加入 μ pBBRlMCS-purDl质粒， 电压2. 5kV，电击4. %is，然后加入ImlLB液体培养基，30°C, 200rpm条件复苏池。将复苏完的菌液涂布含庆大霉素和卡那霉素的LB平板培养基，30°C温箱培养2天，获得单克隆。三、pBBRlMCS-purDl转化菌株具有高喹啉降解活性
将所有的单克隆划线培养后，接种的MM2培养基中，检测pBBRlMCS-purDl的转化菌株是否具有高喹啉降解活性。我们一共检测了观80个单克隆，获得了 8株具有高喹啉降解活性的单克隆，分别命名为Dpl、Dp2、Dp3、Dp4、Dp5、Dp6、Dp7和Dp8。MM2液体培养基为浅白色，若菌株能够降解喹啉，培养基变成褐色；培养基颜色没有变化的为不具喹啉降解活性的菌株。Dpi、在MM2培养基中培养15小时候颜色变化见图1，与突变菌株D相比，Dpl、Dp2、 Dp3、Dp4、Dp5、Dp6、Dp7和Dp8菌株的颜色都变深，同KT-ql-116的颜色相似，这表明我们确实获得了具有高喹啉降解活性的菌株。实施例3、Dp2对喹啉的生物降解实验
我们进一步研究了 Dp2的喹啉的生物学降解实验。将Dp2菌株接种于含有不同浓度喹啉的MM2液体培养基中，喹啉浓度分别为500 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/ L、850 mg/L,900mg/L, 25°C，200rpm,振荡培养。结果发现，除900mg/L的情况下，菌体没有生长以外，其它待试培养基中都不同程度的增殖。菌体在喹啉浓度分别为500 mg/L、650 mg/ L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L 禾口 850 mg/L 的情况下生长 40. 5h、64h、124h、142h、153h 和16 时，菌液0D600都可达到0. 7^0. 8，而这些培养基中的喹啉被降解完全。以上结果表明，Dp2菌体可以以喹啉为唯一碳源、氮源和能源生长，而且可以很好的耐受和降解浓度高达850mg/L的喹啉，并且在此浓度下发生很好的增殖，生物量较高活细胞数可达106 107cfu/mlo该实验结果证明purD基因转化微生物能使其具有高喹啉降解活性，这对污染物的降解具重要的意义。
权利要求
1.编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及(b)、与SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予喹啉降解活性的蛋白质。
2.赋予喹啉降解活性的蛋白质，其由权利要求1所述的基因编码。
3.重转载体，其包含权利要求1所述的基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其中重组载体还包含外源基因或外源DNA片段。
5.经转化的微生物细胞，其具有如权利要求3或4所述的重组载体并具有高喹啉降解活性。
全文摘要
本发明公开了一个对喹啉具有高降解性的新基因purD1。实验证明，将purD1基因转化微生物能使该微生物获得对喹啉的降解活性。purD1及其编码蛋白赋予微生物的降解活性最大降解浓度能够达到850mg/L。本发明对喹啉类污染物的治理具有非常重要的实际应用价值。
文档编号C12N15/63GK102206653SQ20111010384
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月25日 优先权日2010年5月20日
发明者乔琳, 夏勉, 徐海英 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司