专利名称：家蚕表皮蛋白BmCP231启动子及其重组表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种组织特异性启动子及其表达载体和应用。
背景技术：
家蚕在天然条件下产出的丝纤维是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。蜘蛛与家蚕具有相似的纺丝体，但其产出的丝纤维却较蚕丝具有更强的硬度和更出色的韧性。丝纤维在生物体内的形成是一个极其复杂的过程，至今都没有获得完全阐明。现有的合成纤维都是人工模拟昆虫天然产丝的过程，在体外进行合成，但其力学性能还远不能和蜘蛛丝纤维进行对比。如果能使家蚕高效、特异地产出大量优质的类蜘蛛丝纤维，对于优质纤维材料的获取具有非常重要的意义。家蚕前部丝腺是向列型液晶形成的场所，离子强度对丝纤维的形成具有重要作用。利用家蚕前部丝腺特异启动子过量表达外源蛋白例如家蚕前部丝腺的某些离子通路蛋白，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕表皮蛋白启动子及其重组表达载体和应用，该启动子可以使外源蛋白在家蚕前部丝腺特异性表达，利用该启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
I、家蚕表皮蛋白BmCP231启动子，由SEQ ID No. I中第I位至第1457位核苷酸组成， 或者由SEQ ID No. I中第I位至第1511位核苷酸组成。2、含有所述家蚕表皮蛋白BmCP231启动子的重组表达载体。进一步，所述重组表达载体为pBac[BmCP231-表达基因-SV40，3xP3EGFP]， 是将由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框 [BmCP231-表达基因-SV40]插入穿梭载体pSLfall80fa的多克隆位点中，获得重组载体 pSL[BmCP231-表达基因-SV40]，再用Asc I从载体pSL[BmCP231_表达基因-SV40]中切下 [BmCP231-表达基因-SV40]片段，与同样经Asc I酶切的载体pBac [3xP3_EGFPafm]连接， 即得。进一步，所述表达基因为红色荧光蛋白DsRed基因。3、所述家蚕表皮蛋白BmCP231启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。本发明的有益效果在于本发明利用蛋白质组学手段鉴定到一个在家蚕前部丝腺特异并且高量表达的表皮蛋白BmCP231，对其启动子序列进行了克隆，并以DsRed基因为代表基因构建了由BmCP231启动子调控的DsRed表达载体，将该表达载体显微注射入家蚕体内获得了转基因家蚕，对该转基因家蚕的研究发现，BmCP231启动子驱动DsRed在家蚕前部丝腺特异表达，因此，BmCP231启动子可以作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用。利用BmCP231启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维，从而本发明为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能打下了基础，而本发明提供的含有 BmCP231启动子的重组表达载体为上述研究提供了有力的工具。
图I为含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕不同时期在白光和荧光照射下的照片，其中a和b分别为白光和荧光照射下的卵，c和d分别为白光和荧光照射下的成虫，e和 f分别为白光和荧光照射下的五龄第五天的家蚕，g和h分别为白光和荧光照射下的家蚕茧壳。图2为转基因家蚕的丝腺解剖图，其中a和b分别为白光和荧光照射下的无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕丝腺，c和d分别为白光和荧光照射下的含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕丝腺，e和f分别为白光和荧光照射下的非转基因家蚕大造丝腺。图3 为转基因家香的 Southern blot 分析，其中 I 为 Tran 2K plus DNA Marker, 2为经Bgl II酶切的非转基因家蚕大造蚕蛾DNA，3为经Bgl II酶切的无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕Gl代蚕蛾DNA，4为经Bgl II酶切的含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕 Gl代蚕蛾DNA，5为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因(阳性对照)。图4为转基因家蚕在前部丝腺特异表达DsRed的Western blot分析,其中I为无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕前部丝腺蛋白，2为含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕前部丝腺蛋白，3为非转基因家蚕大造前部丝腺蛋白。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。一、家蚕表皮蛋白BmCP231启动子的克隆
根据家蚕基因组数据库中序列nscaf2986，分别设计两对上下游引物。设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列如下
231-F 5' -ttgtcgacgcttcacggcagaaatag-3' (SEQ ID No. 2,下划线部分为 Sal I 酶切位点)；
231-R1 :5’ -RaaRatcttRctRtRRttRttRaR-3’ (SEQ ID No. 3,下划线部分为 Bgl II 酶切位点)；
231-R2 5'-gaagatctgctcccataagcggcagccaaaaggcaagaaaaggttaccaacttgagggccatt gctgtggttgttgag-3’ (SEQ ID No. 4,下划线部分为 Bgl II 酶切位点)。以五龄第三天的大造基因组DNA为模板，采用引物231-F和231-R1扩增无信号肽BmCP231启动子片段(序列如SEQ ID No. I中第I位至第1457位核苷酸所示)，采用引物231-F和231-R2扩增含信号肽BmCP231启动子片段(序列如SEQ ID No. I中第I位至第 1511位核苷酸所示)。PCR反应条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性40秒，52°C退火 40秒(无信号肽BmCP231启动子片段)或60°C退火40秒(含信号肽BmCP231启动子片段)，
472°C延伸I. 5分钟，共24个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收纯化目的片段，再克隆入载体PMD19-T Simple (TaKaRa)，分别获得重组载体 PMD19-无信号肽BmCP231和pMD19_含信号肽BmCP231。二、BmCP231启动子调控的DsRed表达载体的构建
分别将重组载体PMD19-无信号肽BmCP231和pMD19_含信号肽BmCP231用Sal I和 Bgl II双酶切，回收无信号肽BmCP231启动子片段和含信号肽BmCP231启动子片段，再与同样经Sal I和Bgl II双酶切的载体pSL[MCS-DsRed-SV40]进行连接，分别获得重组载体 pSL[无信号肽 BmCP231-DsRed-SV40]和 pSL[含信号肽 BmCP231-DsRed_SV40]。所述载体 pSL[MCS-DsRed-SV40]系参照文献方法(Horn and ffimmer, 2000)，利用 pSLfall80fa 克隆穿梭载体，采用两步克隆法构建而得，具体构建方法见中国专利申请20110423280. 3。分别将重组载体pSL[无信号肽BmCP231-DsRed-SV40]和pSL[含信号肽 BmCP231- DsRed_SV40]用Asc I酶切，回收无信号肽BmCP231-DsRed_SV40片段和含信号肽 BmCP231-DsRed-SV40片段，再与同样经Asc I酶切的载体pBac [3xP3_EGFPafm]进行连接， 分别获得重组载体PBac [无信号肽BmCP231-DsRed-SV40，3xP3EGFP]和pBac [含信号肽 BmCP231-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]。所述载体 pBac [3xP3_EGFPafm]系参照文献方法(Horn and ffimmer, 2000)构建而得。三、BmCP231启动子调控的DsRed表达载体转基因家蚕的获得
分别将重组载体PBac [无信号肽BmCP231-DsRed-SV40，3xP3EGFP]和pBac [含信号肽 BmCP231-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]与编码piggyBac转座酶的转基因辅助载体pHA3PIG等摩尔比混合，通过显微注射入已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2飞小时，GO代)中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25°C催青至孵化，孵化的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，获得的卵期第7天的蚕卵(Gl代)在宏观体视荧光显微镜(Olympus MVX10)下利用波长为46(T490nm的激发光检测绿色荧光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性个体(图I a-d)，即获得无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231 启动子转基因家蚕。随机选取无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕Gl代蚕蛾和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕Gl代蚕蛾，分别提取基因组DNA进行Southern blot检测，结果如图3所示，EGFP的插入拷贝数均为I个，DsRed与EGFP处在同一个转座子区域中，其插入拷贝数也均为I个，表明携带DsRed的piggyBac转座元件在无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕的基因组中均发生了 I次转座事件。四、BmCP231启动子调控的DsRed表达载体在转基因家蚕前部丝腺的特异表达
I、荧光观察DsRed在转基因家蚕中的时期与组织特异性
随机选取无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕，于胚胎发育后期开始进行连续的荧光检测，结果发现，在蚁蚕时就可以观察到前部丝腺发出红色荧光，之后随着转基因家蚕的发育，红色荧光越来越强，当家蚕发育到五龄第三天时，红色荧光可以直接透过家蚕的表皮被观察到(图I e，f)0将五龄第一天的无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕进行解剖后发现，红色荧光是从前部丝腺发出且无性别差异，而在其它组织如中肠、生殖腺等中没有观察到红色荧光，在转基因家蚕的茧壳中也没有观察到红色荧光(图I g, h)。将无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕、含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕与非转基因家蚕的丝腺进行解剖后发现，只有在无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕的前部丝腺中才能检测到红色荧光(图2)。2、RT-PCR检测DsRed基因在转基因家蚕中的时期与组织特异性
分别取自五龄起蚕时期至蛹期第二天的转基因家蚕个体，以及五龄第三天转基因家蚕的各组织样品，在液氮中快速研磨并提取总RNA，反转录成cDNA，采用DsRed基因特异引物[DsRed-F :5，-atggtgcgctcctccaagaacg-3，(SEQ ID No. 5) ;DsRed_R : 5’ -ctacaggaacaggtggtggc-gg-3’ (SEQ ID No. 6)]进行 RT-PCR 检测，以 Actin3 为对照。 PCR反应条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性15秒，65°C退火30秒，72°C延伸I分钟，共24个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，DsRed基因在含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕中的表达情况一致，时期检测显示DsRed基因自五龄起蚕时期至上蔟12小时均高量表达，而自上蔟12小时后表达量急剧下降；在组织特异性方面，DsRed基因只在转基因家蚕的前部丝腺表达。3、Western blot检测DsRed在转基因家蚕前部丝腺中的表达
分别取五龄第三天的无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕、含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕和非转基因家蚕的前部丝腺，在液氮中快速研磨溶于8mol/L尿素缓冲液中，4°C放置I小时，离心取上清，测定总蛋白浓度，再与5X加样缓冲液混合，100°C变性 10分钟，进行10% SDS-聚丙稀酰胺胶凝胶电泳，电泳完毕后，以Anti-DsRed抗体为一抗、 Tubulin抗体为内参照抗体进行Western blot分析。结果如图4所示，DsRed在无信号肽 BmCP231启动子转基因家蚕和含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕的前部丝腺中均有表达，而在非转基因家蚕前部丝腺中没有表达；从表达量上看，含信号肽BmCP231启动子转基因家蚕前部丝腺中的DsRed表达量高于无信号肽BmCP231启动子转基因家蚕。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.家蚕表皮蛋白BmCP231启动子，其特征在于，由SEQID No. I中第I位至第1457位核苷酸组成，或者由SEQ ID No. I中第I位至第1511位核苷酸组成。
2.含有权利要求I所述家蚕表皮蛋白BmCP231启动子的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为 pBac[BmCP231-表达基因-SV40, 3xP3EGFP]，是将由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框[BmCP231-表达基因-SV40]插入穿梭载体 pSLfall80fa的多克隆位点中，获得重组载体pSL[BmCP231_表达基因-SV40]，再用Asc I 从载体pSL[BmCP231-表达基因-SV40]中切下[BmCP231_表达基因-SV40]片段，与同样经 Asc I酶切的载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接，即得。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达基因为红色荧光蛋白 DsRed基因。
5.权利要求I所述的家蚕表皮蛋白BmCP231启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。
全文摘要
本发明公开了一个家蚕表皮蛋白BmCP231启动子，由SEQ ID No.1中第1位至第1457位核苷酸组成，或者由SEQ ID No.1中第1位至第1511位核苷酸组成；该启动子可以驱动外源蛋白在家蚕前部丝腺特异表达，可作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用；本发明还公开了含有该启动子的重组表达载体，为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能提供了有力的工具。
文档编号C12N15/113GK102604954SQ20121008589
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者夏庆友, 王峰, 王鑫, 衣启营, 赵萍, 马三垣 申请人:西南大学