专利名称：单核苷酸多态性rs6871626在检测麻风病易感基因中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单核苷酸多态性rs6871626在检测麻风病易感基因中的应用。
背景技术：
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组(如疾病易感性)，药物基因组(药效、药物代谢差异和不良反应)和群体进化等研究中具有重大意义。目前已有多种方法可用于SNP检测，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单 链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片(张小燕等。用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理。中国生物工程杂志。2005，25(11):52 56)。麻风病是一种由麻风分枝杆菌感染所致的慢性传染病，在发展中国家这仍然是一个严重的健康问题，每年全球新发病例数为250000。主要侵犯皮肤和外周神经，并导致不可逆性的神经功能损害和慢性致畸致残。这已被证明在麻风的流行中环境因素和宿主遗传因素起着至关重要的作用，估计遗传因素高达57%。世界卫生组织的方案把麻风病的临床表现分为结核型和瘤型，分别对应了 Thl (细胞介导)和Th2 (体液介导)组织的人体的免疫应答。麻风病多样性的临床表现反映出人体对同种病原体的两种截然不同的免疫应答，这就说明遗传易感性在麻风发病中的重要性。遗传研究的结果表明遗传与麻风易感性和其临床亚型的病情进展都有关联。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供单核苷酸多态性rs6871626在麻风病方面的新用途。本发明所提供的新用途是下述I) -9)中的至少一种I)检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；2)检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；3)检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备筛查麻风病患者产品中的应用；
4)检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备检测麻风病易感性产品中的应用；5)人基因组中的单核苷酸多态性在制备检测麻风病易感基因的产品中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs6871626的DNA序列多态性；6)人基因组中的单核苷酸多态性在制备鉴定或辅助鉴定麻风病易感基因的产品中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs6871626的DNA序列多态性；7)人基因组中rs6871626的多态性在制备筛查麻风病患者产品中的应用；8)人基因组中rs6871626的多态性在制备检测麻风病易感性产品中的应用；9)包括检测人基因组中rs6871626多态性的物质的产品，为a)_d)中的任一种产品
a)检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，b)鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，c)筛查麻风病患者产品，d)检测麻风病易感性产品。 在本发明的实施例中，所述麻风病具体为中国汉族及少数民族人群麻风病。Rs6871626是人染色体5q33上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(A/C，在其互补链上则为T/G)。所述rs6871626基因型是AA、AC或CC。所述AA是rs6871626位点为A的纯合型，所述CC是rs6871626位点为C的纯合型，所述AC是rs6871626位点为A和C的杂合型。所述检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型具体可为检测rs6871626的核苷酸种类。实验证明，rs6871626在由5503个麻风病患者组成的病例群体和由4971个正常人组成的病例对照群体的P值是3. 95X 10_18，相对危险度是O. 75，说明rs6871626是与麻风病相关的单核苷酸多态性。实验证明，rs6871626的三个基因型中，CC基因型的个体在正常人群体中的比例是45. 5%，明显低于麻风病患者群体中的比例51. 5%。在实际应用中，可将检测rs6871626的多态性的物质与其它物质(如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质)联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。其中，检测人基因组中rs6871626的多态性的物质可为通过下述至少一种方法确定rs6871626的多态性所需的试剂和/或仪器DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。本发明的一个实施例中，采用PCR引物扩增包括rs6871626在内的基因组DNA片段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，对得到的延伸产物的序列进行检测，确定rs6871626的多态性和基因型。所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs6871626在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列I和序列2所示的单链DNA。所述延伸引物根据人基因组中rs6871626上游(不包括该SNP位点)设计，所述延伸引物的最后I位核苷酸对应于人基因组中rs6871626的前I位核苷酸，如所述延伸引物具体可为序列表中的序列5所示的单链DMNA，当然也可将序列5所示的单链DNA按照人基因组中rs6871626的下游序列延长一个以上核苷酸，或按照人基因组中rs6871626的下游序列缺失一个以上核苷酸，只要能使该单碱基延伸引物的3'末端延伸出rs6871626位点的核苷酸即可。本发明在一个来自中国人群的样本(5503个麻风病患者和4971个健康者)中发现rs6871626是与麻风病相关的单核苷酸多态性。可将检测rs6871626的多态性的物质与其它物质(如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质)联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。
图I为rs2058660的关联区域。 左侧纵轴显示为SNP的P值，右侧纵轴显示为重组率，横轴显示其物理位置。各区域中SNP与本实验阳性SNP位点rs2058660的相关系数(r2)用不同颜色标记，箭头指示的为本实验的阳性SNP rs2058660、区域中P值最小SNP位点以及以往报道过的SNP，P值最小的SNP位点rsl916307、以往报道与哮喘相关的位点rs3771166均与本实验阳性SNP位点rs2058660无关联，与乳糜泻相关的位点rs917997、rsl3015714与阳性位点强关联(r2 >0.8)。重组率的估算基于千人基因组中中国及日本人群样本。图中注释的基因源于(http://genome, ucsc. edu/)。图2为rs6871626的关联区域。左侧纵轴显示为SNP的P值，右侧纵轴显示为重组率，横轴显示其物理位置。各区域中SNP与本实验阳性SNP位点rs6871626的相关系数(r2)用不同颜色标记，箭头指示的为本实验的阳性SNP rs6871626、区域中P值最小SNP位点以及以往报道过的SNP，P值最小的位点rsl422877以及与克罗恩氏病相关的rsl0045431，多发性硬化症相关的rs2546890，银屑病相关的rs2546890、rs3213094、rs2082412,关节病型银屑病相关的rsl2188300，强直性脊柱炎相关的rs6556416均与阳性SNP位点rs6871626无关联(r2 < O. 01)。重组率的估算基于千人基因组中中国及日本人群样本。图中注释的基因源于(http://genome, ucsc.edu/)ο
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、rs6871626是与麻风病相关的单核苷酸多态性2009年发明人所在研究小组采用全基因组关联研究(GWAS)在中国汉族人群中发现了麻风病的7个易感基因(CCDC122，C13orf31, N0D2, TNFSF15, HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5个基因以N0D2为中心建立起一个信号通路(Zhang, F.R.，Huang, W.，Chenj S，Μ.，Sun, L. D.，Liuj H.，Li，Y.，Cuij Y.，Yanj X. X.，Yang, Η.Τ. , Yang, R. D. et al. (2009)Genomewide association study of leprosy. N. Engl.J. Med.，361，2609-2618.)，2011 年继 GffAS 后又发现了 2 个麻风易感基因(IL23R 和 RAB32)(Zhang, F. , Liu, H. , Chen, S. , Low, H. , Sun, L. , Cui, Y. , Chu, T. , Li, Y. , Fu, X. , Yu, Y. etal. (2011)Identification of two new loci at IL23R and RAB32that influence)。麻风病作为一类多个微效基因共同起作用的复杂性疾病，目前发现的9个易感基因位点仅是其易感基因谱的冰山一角，更多的麻风易感基因尚待进一步发现。候选基因及SNP的选择发明人通过PUBMED 的 GWAS 官网(http://www. genome, gov/26525384)，查阅了 12个⑶(克罗恩病)的GWAS研究和2个UC (溃疡性结肠炎)的GWAS研究。从中选出位于118个基因上的155个与⑶或UC或两者相关的SNPs (ρ〈5. 0Χ1(Γ8)。排除位于MHC区域的7个SNP和15个位于5个已知的麻风易感基因(N0D2，TNFSFl5, IL23R, C130RF31和LRRK2)上的SNPs。剩余的133个SNPs，包括75个CD的相关SNPs，54个UC相关的SNPs，41个IBD(MM266600)(⑶和UC)相关的SNPs。这些点将在来自中国人群的4个独立样本中被验证。
伦理声明本研究通过了山东省医学科学院皮肤病与性病学研究机构伦理委员会批准，所有麻风病患者及健康对照者均签署了知情同意书。研究对象来自中国人群的四个独立样本，这四个独立样本中共有4971名麻风病患者，5503名健康对照者。他们均为无血缘关系的独立个体。临床分型、家族史情况及发病年龄等信息通过病历采集。样本均通过标本的质控。麻风病患者的诊断至少由两名皮肤科专家同时确诊(临床依据包括爪形手、畸形足及病理依据等)。健康对照者均无麻风家族史及其他面议疾病病史。其中，中国麻风病患者的诊断标准是符合下述4条中的2条或2条以上，或符合第3条者确立诊断1、皮损伴有感觉障碍及闭汗，或有麻木区；2、周围神经受累，表现为神经干粗大伴相应功能障碍；3、皮损组织切片或组织液涂片查到麻风杆菌；4、病理可见特征性改变。健康对照者的诊断标准无麻风病史及其他传染病病史，无其他自身免疫性疾病病史及家族史。表I显不了样本1-4的基本信息。表1、4971名中国麻风病患者和5503名健康对照者的基本情况
权利要求
1.检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。
2.检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。
3.检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备筛查麻风病患者产品中的应用。
4.检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备检测麻风病易感性产品中的应用。
5.人基因组中的单核苷酸多态性在制备检测麻风病易感基因的产品中的应用，其特征在于所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs6871626的DNA序列多态性。
6.人基因组中的单核昔Ife多态性在制备鉴定或辅助鉴定麻风病易感基因的广品中的应用，其特征在于所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs6871626的DNA序列多态性。
7.人基因组中rs6871626的多态性在制备筛查麻风病患者产品中的应用。
8.人基因组中rs6871626的多态性在制备检测麻风病易感性产品中的应用。
9.含有检测人基因组中rs6871626多态性的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品 a)检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品； b)鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品； c)筛查麻风病患者产品； d)检测麻风病易感性产品。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于所述检测人基因组中rs6871626的多态性的物质含有扩增包括rs6871626在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物。
全文摘要
本发明公开了单核苷酸多态性rs6871626在检测麻风病易感基因中的应用。本发明所保护的一个技术方案是检测人基因组中rs6871626的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs6871626的多态性的物质与其它物质(如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质)联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。
文档编号C12Q1/68GK102876794SQ201210375609
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者刘红, 刘健, 张福仁 申请人:山东省皮肤病性病防治研究所