具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法

具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码所述多肽的分离多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。
【专利说明】具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
[0001]序列表的引用
[0002]本申请含有计算机可读取形式的序列表，所述序列表通过引用的方式结合在此。
[0003]发明背景
发明领域
[0004]本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0005]本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。
[0006]相关技术说明
[0007]本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0008]洗涤剂工业已经在洗涤剂制剂中应用不同的酶超过30年，最常使用的酶包括各自适应于去除各种类型污溃的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。除了酶之外，洗涤剂组合物典型地包括复杂的成分组合。例如，大部分清洁产品包括表面活性剂系统、漂白剂或助洗剂。尽管当前洗涤剂复 杂，但是仍需要开发包含新酶和/或酶掺混物的新洗涤剂组合物。
[0009]传统上，在升高的温度进行洗涤并且选择熟知的洗涤剂在较高温度(典型地在40°C -60°C的范围内)进行洗涤。
[0010]关注于改善洗涤过程以便使得它们更为环境友好的增加导致全球范围内倾向于降低洗涤时间、PH和温度、减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。
[0011]因此存在着在较低温度洗涤的需求以及因此对于在低温具有高性能的洗涤剂蛋白酶的需要。
[0012]本发明涉及这些和其他重要目的。
[0013]发明简述
[0014]本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，所述分离多肽选自由以下多肽组成的组:
[0015](a)与SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽；
[0016](b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等-高严格性条件下与(i)SEQ IDNO:1或3的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链杂交；
[0017](c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列一致性；
[0018](d)包含SEQ ID N0:2或4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体；和
[0019](e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。
[0020]本发明还涉及分离多肽，所述分离多肽包含选自下组的催化结构域，该组由以下各项组成:
[0021](a)与SEQ ID NO: 2的氨基酸150至413具有至少60%序列一致性的催化结构域[0022](b)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸在中等严格性条件下与(i)SEQID NO:1的核苷酸729至1520、(ii)编码SEQ ID NO:1的催化结构域的cDNA序列，或(iii)
(i)或(ii)的全长互补链杂交；
[0023](c)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少60%序列一致性；
[0024](d)催化结构域的变体，所述催化结构域包含SEQ ID NO: 2的催化结构域的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入；和
[0025](e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域片段。
[0026]在另一个实施例中，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，所述分离多肽包含以下基序:
[0027]His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(SEQ ID NO: 13)
[0028]其中Xaa是任何天然氨基酸并且(Xaa)6意指6个连续氨基酸，其中每个氨基酸可以是任何天然氨基酸
[0029]或在所述基序内的最后8个氨基酸当中包含一个或两个置换的相应基序。
[0030]本发明还涉及包含本发明多肽的组合物，特别是包含本发明蛋白酶的洗涤剂组合物，如用于衣物或用于手工或自动洗碗的洗涤剂组合物。
[0031]本发明还涉及使用包含本发明多肽的组合物洗涤纺织品的方法并且涉及用于清洁硬质表面的方法。
[0032]本发明还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸-26至-1或SEQ ID NO:4的氨基酸-160至-132或由其组成、编码前肽的多核苷酸，所述前肽包含SEQ ID NO: 2的氨基酸I至143或SEQ ID NO:4的氨基酸-131至-1或由其组成或编码信号肽和前肽的多核苷酸，所述信号肽和前肽分别包含SEQ ID NO: 2的氨基酸-26至-1及I至143或SEQ ID NO:4的氨基酸-160至-132及-131至-1或由其组成，所述多核苷酸的每一种与编码蛋白质的基因可操作地连接；涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并且涉及产生蛋白质的方法。
[0033]序列表概述
[0034]SEQ ID NO:1是从芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)NN018132分离的S8蛋白酶的DNA序列。
[0035]SEQ ID NO: 2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
[0036]SEQ ID NO: 3 是从 Bacillus borgouniensis 分离的 S8 蛋白酶的 DNA 序列
[0037]SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。
[0038]SEQ ID N0:5是来自具有登录号EMBL:GQ891986的树形类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)的 S8 蛋白酶的 DNA 序列。
[0039]SEQ ID N0:6是具有登录号SWISSPR0T:D0EVD2的树形类芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸公开序列。 [0040]SEQ ID NO:7和8是用于扩增芽孢杆菌物种NN018132的引物
[0041]SEQ ID N0:9 和 10 是用于扩增 Bacillus borgouniensis 的引物
[0042]SEQ ID NO: 11是芽孢杆菌物种NN018132的融合片段
[0043]SEQ ID NO: 12 是 Bacillus borgouniensis 的融合片段[0044]SEQ ID NO: 13 至 SEQ ID NO:49 是基序序列。
[0045]定义
[0046]蛋白酶活性:术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而催化酰胺键或蛋白质水解的蛋白酶解活性(EC3.4.21.)。用于确定蛋白酶活性的几种测定法是本领域可获得的。出于本发明的目的，可以使用Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自Megazyme)或在Suc-AAPF-pNA测定法中确定蛋白酶活性，如本申请的实例部分中所述。 [0047]本发明的多肽具有SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%和至少100%的蛋白酶活性。
[0048]分离多肽:术语“分离多肽”意指相对于如在自然界中发现的这种多肽的通过人工修饰的多肽，由此它已经完全或部分地与在自然界中与该多肽一起发现的至少一种其他化合物分离。在一个方面，该多肽是至少1%纯的，例如至少5%纯的，至少10%纯的，至少20%纯的，至少40%纯的，至少60%纯的，至少80%纯的，并且至少90%纯的，如通过SDS-PAGE所测定。
[0049]分离的:术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境下的物质。分离的物质的非限制性实例包括(I)任何非天然存在的物质，(2)下述任何物质，包括但不限于任何酶、变异核酸、蛋白质、肽或辅因子，其中所述物质至少部分地从在自然界中与该物质结合的一种或多种或所有天然存在的组分移除；(3)相对于在自然界中发现的这种物质被人工修饰的任何物质；或(4)下述任何物质，其中相对于与该物质天然结合的其他组分，通过增加该物质的量修饰所述物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然结合的启动子更强的启动子)。
[0050]基本上纯的多肽:术语“基本上纯的多肽”意指按重量计含有最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%和最多0.5%与该多肽天然或重组结合的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该多肽是至少92%纯的，例如至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%、至少99.5%纯的、和100%纯的。本发明的多肽优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
[0051]成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸144至418。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至275。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸I至283。
[0052]前肽:术语“前肽”意指与成熟多肽一起翻译的并且在成熟多肽释放之前被切割并获得蛋白酶活性的多肽。在一个方面，前肽是SEQ ID N0:2的氨基酸I至143、SEQ ID NO:4的氨基酸-131至-1或SEQ ID NO:6的氨基酸-128至-1。
[0053]信号肽:术语“信号肽”意指与成熟多肽和前肽一起翻译的短多肽并且该前肽是存在的。信号肽位于已翻译多肽的N端中并负责该多肽的分泌。通常，信号肽在多肽跨膜如质膜或内质网膜转运过程中被去除。
[0054]信号肽是本领域熟知的，并且已经开发了用于预测信号肽的几种方法，例如，预测SEQ ID NO: 2 的氨基酸-26 至-1、SEQ ID NO:4 的氨基酸-160 至-132 和 SEQ ID NO:6 的氨基酸-158至-129是信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering) 10:1-6)]。
[0055]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸711至1535，SEQID NO: 3的核苷酸581至1405或SEQ ID NO: 5的核苷酸475至1323。
[0056]序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“序列一致性”描述。
[0057]出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch), 1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度，如在 EMBOSS 软件包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite (EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包)，Rice 等人，2000，TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行的。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版)替代矩阵。将Needle标记的“最长一致性”(使用_ nobrief?选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下:(相同残基XlOO)/ (比对的长度-在比对中的空位总数)
[0058]出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch), 1970，上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间序列一致性的程度，如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000，上文)的Needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EDNAFULUNCBINUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。将Needle标记的“最长一致性”(使用-nobrief选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下:(相同脱氧核糖核苷酸XlOO)/ (比对的长度-在比对中的空位总数)
[0059]片段:术语“片段” 意指使得一个或多个(几个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中所述片段具有蛋白酶活性。在一个方面，片段含有至少200个氨基酸残基(例如，SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸160至360)、至少230个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸150至380)和至少260个氨基酸残基(例如，SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸150至410)。
[0060]序列:术语“子序列”意指使得一个或多个(几个)核苷酸从成熟多肽的5’和/或3’末端缺失的多核苷酸；其中所述子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一个方面，子序列含有至少600个核苷酸(例如，SEQ ID NO: 1、3或5的核苷酸759至1361)，例如至少700个核苷酸(例如，SEQ ID NO: 1、3或5的核苷酸731至1431)和至少780个核苷酸(例如，SEQID NO: 1、3或5的核苷酸731至1514)。
[0061]等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然发生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0062]分离的多核苷酸:术语“分离的多核苷酸”意指相对于如在自然界中发现的这种多核苷酸的通过人工修饰的多核苷酸，由此它已经完全或部分地与在自然界中与该多核苷酸一起发现的至少一种其他化合物分离。在一个方面，分离的多核苷酸是至少1%纯的，例如至少5%纯的，更是至少10%纯的，至少20%纯的，至少40%纯的，至少60%纯的，至少80%纯的，至少90%纯的，并且至少95%纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或它们的任何组合。
[0063]基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因修饰多肽生产系统内部的形式下的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%和最多0.5%与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90%纯的，例如至少92%纯的，至少94%纯的，至少95%纯的，至少96%纯的，至少97%纯的，至少98%纯的，至少99%纯的，以及至少99.5%纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
[0064]编码序列:术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的界限通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以ATG起始密码子或替代的起始密码子如GTG和TTG开始并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
[0065]cDNA:术语“cDNA”意指可以通过逆转录从获自真核细胞的成熟剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，所述前体在作为成熟剪接的mRNA出现之前经一系列步骤(包括剪接)加工。
[0066]核酸构建体:术语“核 酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子从天然存在的基因分离或经修饰以含有处于本来在自然界中不存在的形式的或为合成的核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。
[0067]控制序列:术语“控制序列”意指为编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。每个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是天然或外来的或彼此是天然或外来的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以配有接头，目的在于引入促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点。
[0068]可操作地连接:术语“可操作地连接”意指其中将控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适宜位置处使得控制序列指导编码序列表达的构型。
[0069]表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0070]表达载体:术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，所述DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且与导致其表表达的另外的核苷酸可操作地连接。
[0071]宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。[0072]变体:术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变(即，一个或多个(几个)氨基酸残基置换、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。置换意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
[0073]低严格性条件:对于至少100个核苷酸长度的探针，术语“低严格性条件”意指按照标准DNA印迹程序在42°C于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50°C使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
[0074]中等严格性条件:对于至少100个核苷酸长度的探针，术语“中等严格性条件”意指按照标准DNA印迹程序在42°C在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55°C使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
[0075]高严格性条件:对于至少100个核苷酸长度的探针，术语“高严格性条件”意指按照标准DNA印迹程序在42°C在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65°C使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
[0076]清洁组合物:术语“清洁组合物”和“清洁制剂”是指用于从待清洁的物品去除所不希望的的化合物的组合物，所述物品如织物、地毯、餐具(包括玻璃器具)、隐形眼镜、硬质表面如瓦面、锌表面、地面和桌面、毛发(香波)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱口液、牙膏)，等等。该术语涵盖针对具体类型所需的清洁组合物和产品形式(例如，液体组合物、凝胶组合物、颗粒组合物或喷雾组合物)所选择的任何材料/混合物，只要该组合物与组合物中所用的金属蛋白酶和其他酶相容即可。通过考虑待清洁的表面、物品或织物和针对使用期间的清洁条件的组合物的所需形式而容易进行清洁组合物材料的具体选择。这些术语进一步指适于对任何物体和/或表面清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。这些术语意在包括，但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬质表面清洁制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属柜台顶面(counter top)和窗户；地毪清洁剂；烤箱清洁剂、织物清新剂；织物柔软剂和纺织品与衣物预除斑剂(pre-spotters)以及餐具洗涤剂)。
[0077]洗涤剂组合物:除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒或粉末形式的通用或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体(HDL)型洗涤剂；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢型餐具洗涤剂，尤其是那些高泡类型的餐具洗涤剂；机洗餐具洗涤剂，包括家庭和机构用途的各种片状、颗粒、液体和漂洗助剂类型的机洗餐具洗涤剂；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”、预处理型添加剂。`
[0078]术语“洗涤剂组合物”和“洗涤制剂”用来指预期在用于清洁污染物体的洗涤介质中使用的混合物。在一些实施例中，该术语用来指洗涤织物和/或衣物(例如，“衣物洗涤剂”)。在可替代的实施例中，该术语指其他洗涤剂，如用来清洁餐具、刀叉等等的那些洗涤剂(例如“餐具洗涤剂”)。并不期望使本发明限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。预期的是，除了根据本发明的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶之外，该术语涵盖含有例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或络合剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、悬污剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化物、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂及荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂的洗涤剂。
[0079]织物:术语“织物”包括任何纺织材料。因此，该术语意在包括服装，以及织物、纱线、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织材料。
[0080]纺织品:“纺织品”指机织物，以及适于转化成或用作纱线、机织物、针织物和无纺织物的短纤维和长丝。该术语包括由天然纤维以及合成(例如，制造的)纤维制成的纱线。“纺织材料”是针对纤维、纱线中间体、纱线、织物和从织物所制成的产品(例如，服装和其他物品)的一般术语。
[0081]非织物洗涤剂组合物:术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物和个人清洁组合物。
[0082]酶的有效量:术语“酶的有效量”指为了实现特定应用(例如，确定的清洁组合物)中所需要的酶活性 而必需的酶量。这样的有效量由本领域普通技术人员容易地确定并且以许多因素为基础，所述因素例如是所用的特定酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成、以及是否需要液体或干燥(例如颗粒状、棒状)组合物，等等。术语“金属蛋白酶的有效量”指前文所述的(例如，在确定的洗涤剂组合物中)实现所希望的酶活性水平的金属蛋白酶的量。
[0083]洗涤性能:术语“酶的洗涤性能”指相对于未向该组合物添加酶的情况，酶向洗涤剂提供另外的清洁性能的贡献。在有关洗涤条件下比较洗涤性能。通过它们在适当的测试条件下去除某些代表性污溃的能力合宜地测量酶的洗涤性能。在这些测试系统中，可以按这样的方式控制其他相关因素如洗涤剂组成、洗涤剂浓度、水硬度、洗涤力学，时间、PH和/或温度，使得在某一市场细分中对于家庭应用典型的条件被模仿。
[0084]水硬度:如在此使用的术语“水硬度”或“硬度”或“dH”或“。dH”指德国硬度。I度被定义为每升水10毫克氧化钙。
[0085]有关洗涤条件:术语“有关洗涤条件”在此用来表示在洗涤剂市场细分中在家庭中实际使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型和水硬度。
[0086]改善的特性:术语“改善的特性”用来表示与不具有酶时实施的相同过程相比，在特性方面获得了更好的最后结果。在本发明过程中优选地改善的示例性特性包括洗涤性能、酶稳定性、酶活性和底物专一性。
[0087]改善的洗涤性能:术语“改善的洗涤性能”用来表示在有关洗涤条件下与无酶或与参考酶相比，从洗涤的物品(例如，织物或餐具和/或刀叉)中去除污溃方面获得更好的最后结果，或用来表示基于重量，相对于无酶或参考酶，需要较少的酶以获得相同的最后结果。在这种情况下，改善的洗涤性能也可能是以较短的洗涤时间获得相同的效果，例如污溃去除效果，例如，这些酶在测试的条件下更快地产生它们的效果。术语“剩余的洗涤性能”用来表示基于重量，酶的洗涤性能是在有关洗涤条件下相对于另一种酶的至少80%。
[0088]酶去污力:术语“酶去污力”或“去污力”或“去污作用”在此定义为与无酶的相同洗涤剂相比，酶可以向洗涤剂增加的有利作用。可能由酶提供的重要去污益处是污溃去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、阻止或减少在洗涤过程中释放的污垢再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，其中所述纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。对于酶去污力益处而言，不直接与催化性污溃去除或阻止污垢再沉积相关的纺织品护理益处也是重要的。这类纺织品护理益处的实例是阻止或减少染料从一种织物转移至另一种织物或相同织物的另一个部分(一种又称作染料转移抑制或抗回染的作用)、去除来自织物表面的突出或破损纤维以降低起球趋势或除去已经存在的毛球或绒毛(一种又称作抗起球的作用)、改善织物柔软度、织物的颜色澄清和去除在织物或服装的纤维中夹带的颗粒状污垢。酶促漂白作用是另外的酶去污益处，其中催化活性通常用来催化漂白组分如过氧化氢或其他过氧化物的形成。
[0089]抗再沉积:如在此所用的术语“抗再沉积”描述了减少或阻止溶解或悬浮于洗涤液中的污垢再沉积到清洁的物体上。再沉积可以在一个或多个洗涤周期之后(例如，为变灰色、黄化或其他变色)见到。
[0090]辅助材料:术语“辅助材料”意指针对具体类型所需的清洁组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)所选择的任何液体、固体或气态物质，其中这些物质还优选地与该组合物中所用的金属蛋白酶相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“紧凑”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。
[0091]污溃去除酶:如在此所用，术语“污溃去除酶”描述辅助从织物或硬质表面去除污溃或污垢的酶。污溃去除酶作用于特定的底物，例如蛋白酶作用于蛋白质，淀粉酶作用于淀粉，脂肪酶和角质酶作用于脂类(脂肪和油)，果胶酶作用于果胶并且半纤维素酶作用于半纤维素。污溃经常是不同组分的复杂混合物的沉积物，所述沉积物导致材料本身局部变色或在物体上留下粘性表 面，所述粘性表面可能吸引溶解于洗涤液中的污垢，因而导致玷污区域的变色。当酶作用于污溃中存在的特定底物时，酶降解或部分地降解其底物，因而在洗涤过程期间辅助去除与该底物结合的污垢和污溃组分。例如，当叶绿素酶作用于草污溃时，它降解草中的叶绿素组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。
[0092]减少的量:在这种情境下，术语“减少的量”意指该组分的量小于将在参考过程中另外在相同条件下使用的量。在一个优选实施例中，该量减少例如至少5%、如至少10%、至少15%、至少20%或另外如在此所述。
[0093]低洗涤剂浓度:术语“低洗涤剂浓度”系统包括其中小于大约SOOppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。一般认为亚洲(例，如日本)洗涤剂是低洗涤剂浓度系统。
[0094]中等洗涤剂浓度:术语“中等洗涤剂浓度”系统包括其中在大约SOOppm和大约2000ppm之间的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。通常认为北美洗涤剂是中等洗涤剂浓度系统。
[0095]高洗涤剂浓度:术语“高洗涤剂浓度”系统包括其中大于大约2000ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。通常认为欧洲洗涤剂是高洗涤剂浓度系统。
[0096]发明详细说明
[0097]具有蛋白酶活性的多肽
[0098]本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽，其特征在于该蛋白酶具有在低温的高去污力性能并且稳定性不受强螯合剂的存在影响。
[0099]因而，在本发明的方面，涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，所述分离多肽选自由以下多肽组成的组:
[0100](a)与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽；
[0101](b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等严格性条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链杂交；
[0102](c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列一致性；
[0103](d)包含SEQ ID N0:2的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体；和
[0104](e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。
[0105]本发明的另一个方面涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，所述分离多肽选自由以下多肽组成的组:
[0106](a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽；
[0107](b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等严格性条件下与(i)SEQ IDNO: 3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链杂交；
[0108](c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列一致性；
[0109](d)包含SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体；和
[0110](e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。
[0111]本发明还涉及分离多肽，所述分离多肽包含选自下组的催化结构域，该组由以下各项组成::
[0112](a)与SEQ ID NO: 2的氨基酸150至413具有至少60%序列一致性的催化结构域；
[0113](b)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸在中等严格性条件下与(i)SEQID NO:1的核苷酸729至1520、(ii)包含SEQ ID NO:1的催化结构域的基因组DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链杂交；
[0114](c)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少60%序列一致性；
[0115](d)催化结构域的变体，所述催化结构域包含SEQ ID NO: 2的催化结构域的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入；和
[0116](e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域片段。
[0117]本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的分离多肽或催化结构域，其具有蛋白酶活性。在一个方面，该多肽与SEQ ID NO: 2的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨
基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
[0118]本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%，例如至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的分离多肽，其具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ IDN0:4的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
[0119]本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2或其等位基因变体的氨基酸序列或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。本发明的多肽优选地包含SEQ ID N0:4或其等位基因变体的氨基酸序列或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID N0:4的成熟多肽或由其组成。在另一个优选的方面，该多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸144至418或由其组成。在另一个优选的方面，该多肽包含SEQ ID N0:4的氨基酸I至275或由其组成。
[0120]本发明的蛋白酶共有基序HisGly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly,所述基序位于其中大多数其他枯草杆菌蛋白酶具有Ca2+高亲和力结合位点的区域内。本发明的枯草杆菌蛋白酶的环短于具有Ca2+高亲和力结合位点的枯草杆菌蛋白酶中发现的环，这表明该位点在此不存在，参见下文的比对。这也由以下数据表示，所述数据显示它们的性能不受螯合剂如EDTA影响，如在实例3表6中展示。这种基序也发现于来自树形类芽孢杆菌(P.dendriti)的具有SEQ ID NO:6的蛋白酶中。
[0121]如通过ClustalWl.83比对3种已知枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID N0:2、4和6所找
到的基序区域。
[0122]
【权利要求】
1.一种具有蛋白酶活性的分离多肽，所述分离多肽选自由以下多肽组成的组: (a)与SEQID N0:2或4的成熟多肽具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、和100%序列一致性的多肽； (b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等严格性条件、中等-高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与(i)SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补链杂交； (c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、和至少95%序列一致性； (d)包含SEQID NO:2或4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体； (e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(C)或(d)多肽的片段；和 (f)具有蛋白酶活性并且进一步包含以下基序的多肽:
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly (SEQ ID NO: 13) 其中Xaa是任何天然氨基酸并且(Xaa) 6意指6个连续氨基酸，其中每个氨基酸可以是任何天然氨基酸； 或在所述基序如选自SEQ ID N0:14至SEQ ID NO:49的基序内的最后8个氨基酸当中包含一个或两个置换的相应基序。`
2.如权利要求1所述的多肽，所述多肽与SEQID NO:2或4的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。
3.如权利要求1或2所述的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格性条件、低-中等严格性条件、中等严格性条件、中等-高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与(i)SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA，或(iii)⑴或(ii)的全长互补链杂交。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:2或4或由其组成。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:2或4的成熟多肽或由其组成。
7.如权利要求6所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQID NO: 2的氨基酸144至418或SEQ ID NO:4的氨基酸I至275。
8.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽是SEQID NO:2或4的片段，其中该片段具有蛋白酶活性。
9.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽包含S8丝氨酸蛋白酶结构域。
10.一种与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的多肽，其中所述多肽包含基序His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val SerGly (SEQ ID NO:13)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中蛋白酶具有在低温的高去污力性能并且稳定性不受强螯合剂的存在影响。
12.—种分离多肽，所述分离多肽包含选自下组的催化结构域，该组由以下各项组成:: (a)与SEQID NO: 2的氨基酸143至418具有至少60%序列一致性的催化结构域 (b)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸在中等-高严格性条件下与(i)SEQID NO:1的核苷酸711至1535、(ii)包含SEQ ID NO:1的催化结构域的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交； (c)由多核苷酸编码的催化结构域，所述多核苷酸与SEQID NO:1的催化结构域具有至少60%序列一致性； (d)催化结构域的变体，所述催化结构域包含SEQID NO: 2的催化结构域的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入；和 (e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(C)或(d)的催化结构域片段。
13.包含如权利要求1-12中任一项所述的多肽的组合物。
14.如权利要求13所述的组合物，所述组合物是洗涤剂组合物，如用于衣物或自动洗碗的组合物。
15.如权利要求14所述的组合物，进一步包含选自以下多种另外的酶之一:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧羟基脂肪酸轻化环氧化酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或任何其混合物。
16.如权利要求13或14所述的组合物，所述组合物包含选自表面活性剂、助洗剂等的一种或多种组分。
17.编码如权利要求1-12中任一项所述的多肽的分离多核苷酸。
18.包含如权利要求17所述的多核苷酸的核酸构建体或表达载体,所述多核苷酸与指导多肽在表达宿主中产生的一个或多个(几个)控制序列可操作地连接。
19.包含如权利要求18所述的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导多肽产生的一个或多个控制序列可操作地连接。
20.产生如权利要求1-12中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括: (a)将处于其野生型形式的产生所述多肽的细胞在有助于产生所述多肽的条件下培养；并且 (b)回收所述多肽。
21.产生如权利要求1-12中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括: (a)将如权利要求19所述的宿主细胞在有助于产生所述多肽的条件下培养；并且 (b)回收所述多肽。
【文档编号】C12N9/54GK103620029SQ201280031274
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年6月22日 优先权日:2011年6月24日
【发明者】M.S.伯彻特, J.W.塔姆斯 申请人:诺维信公司