用于生物产物的纯化和分离处理组合件(pasta)的制作方法
【专利摘要】本发明揭示能够在生物反应周期期间或结束时捕捉并纯化经表达的生物产物的组合件，其中结合树脂保持与生物反应器的内容物隔开，从而允许捕捉、收获并纯化所述生物反应器中的生物产物；本发明另外提供移出不合需要的代谢产物的手段，并提供色谱柱的有效装载。
【专利说明】用于生物产物的纯化和分离处理组合件(PASTA)
【背景技术】
[0001]生物反应器用于使哺乳动物细胞培养物生长，在生物反应器中所述细胞生产细胞外组分，如抗体或重组蛋白。生物反应器还用于病毒生产。进行分离工艺以便从生物反应器浓缩并纯化所需组分，所述组分可例如适用作治疗剂或诊断剂。生物反应器是主要提供液体的混合和气化以便使目标生物培养物生长的复杂机械装置；这一步骤之后是若干个另外的单元工艺，包括细胞的分离、过滤以便减小营养培养基的体积、装载至色谱柱上以及若干个纯化步骤。近几年，已经提高了对以短周转时间生产多种目标生物产物的认识，尤其是当它是关于抗击恐怖主义相关需求所需要的产物时；这还包括对快速开发和制造疫苗和抗体的需求。
[0002]当前的方法需要较大的资金投资以及冗长并缓慢的工艺来制造这些产物。对建立生产目标生物产物以便减少制造步骤并减少药物制造和发现的成本的制造方法的需求在很大程度上未得到满足。
[0003]组合目标生物产物的制造过程中的所有步骤，即从在整个操作期间保持关闭的同一容器中使细胞生长以便分泌目标生物产物到分离目标生物产物并纯化所述目标生物产物的系统将改变开发并制造目标生物药的方式。这将最适合于产物需要快速制造的情形，如在反恐怖主义行动中，以及当保护公众防御流行病时，因为这一系统将允许快速展开制造。
[0004]关于在生物反应器内组合药物的分离和纯化的方面是新颖的并具颠覆性的技术。虽然生物反应器广泛用于使细胞生长的目的，但它们的作用可以扩大为包括可以在生物反应器内完成的其它工艺。
[0005]对开发用于表达目标生物产物并使其与营养培养基中的其它组分分离并且在生物反应器内组合表达与分离的步骤的制造方法的需求未得到满足，所述方法是通过在生物反应器内使目标生物产物与树脂结合、丢弃营养培养基和洗脱目标生物产物呈浓溶液形式来实现；这将除去目标生物产物的分离和纯化过程中的至少三个步骤，即过滤或离心以移出细胞培养物，进行超滤以减小体积，以及通过从生物反应器进行选择性洗脱来纯化目标生物产物；最后一步使用利用生物反应器作为色谱柱。
[0006]生物药制造过程中未被注意的其它问题在于需要从生物反应器移出不合需要的代谢物以便增强细胞培养物的生长；用于移出这些组分的方法将提高生产率。
[0007]生物药制造过程中未被注意的另一个问题在于纯化步骤中，其中结合树脂被装载至色谱柱上且在装载过程中通常会被浪费。需要设计出一种将使结合树脂完全地容纳在安置于色谱柱中的壳套内从而减少装载过程中所遭遇的损失的组合件。
【发明内容】
[0008]本发明一方面提供一种用于制备多种目标生物产物的方法。所述方法包含在生物反应器中以传统方式表达目标生物产物，接着在表达期间或在表达周期结束时向所述生物反应器中添加树脂以捕捉所述目标生物产物。树脂容纳于软管中，所述软管可以从生物反应器中移出并且安置于色谱柱中。或者，在所述方法涉及首先完成目标生物产物的表达的情况下，允许软管留在生物反应器中，且使用各种缓冲液直接从生物反应器洗脱纯形式的目标生物产物。
[0009]本发明还传授一种再充装用过的树脂因此允许重复使用树脂从而降低目标生物产物的总制造成本的方法。
[0010]捕捉目标生物产物和生物反应过程中可能形成的代谢物在目标生物产物对重组细胞有毒性时或在生物反应器中较高浓度的目标生物产物不利地影响表达工艺的生产率的情况下通常是有用的。
[0011]本发明还提供用于在生物反应周期中移出不合需要的代谢物的技术以及用于将树脂装载于色谱柱中的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明的侧截面图。
【具体实施方式】
[0013]一方面，本发明提供一种用于目标生物产物和生物反应器中的生物反应代谢物的纯化和分离处理组合件(PASTA)，使得捕捉这些组分的树脂保持与生物反应器的内容物隔开以便允许分离树脂与生物反应器的内容物。
[0014]另一方面，本发明提供一种含有树脂的组合件，其中所述组合件较长的长度(由于其较小的直径)允许PASTA内部的树脂与生物反应器中经表达的产物有效地接触。PASTA可以具有可变的尺寸，且通过简单地切掉适合长度以及简单地通过热封再连接各种长度来订定尺寸。通过将树脂封固于网壳中，树脂在其处理过程中的损失也得以减少。包含多孔管的PASTA具有经设计以将树脂持留在壳体内部的开孔口，网的最佳开孔将为约50μ，因为所使用的大多数树脂具有大于50 μ的平均直径尺寸；然而，在使用较精细树脂的那些情况下，相应地减小壳体的网格尺寸。值得注意的是为了允许树脂快速平衡，需要最大程度地曝露于营养培养基，因此选择将持留树脂的最大网格尺寸是合乎需要的。在大多数情况下，软管壳将为直径小于5_的尼龙(nylon)网管。PASTA将被装配成各种长度，在从几厘米到数百米的范围内，且网壳以约50到10mm的固定间隔密封；这一固定间隔密封是为了保持树脂隔离在壳体内因此减少与生物反应器中的营养培养基的接触所必需的。这一密封容易地通过使用基于热或感应方法(后者为优选的方法)操作的密封棒实现。
[0015]还推荐在使用PASTA之前，将其在水中洗涤以移出任何较小的树脂粒和可能在PASTA装配过程中产生的其它碎片。在如下文所提出的在生物反应过程中使用PASTA的情况下，PASTA优选地通过Y射线灭菌；或者，其以药学上洁净的状态使用以避免污染目标产物。在过程中移出PASTA的情况下，建议将PASTA的一端留在生物反应器外部以允许它可以通过拉出生物反应器而移出。或者，可以将线附接到PASTA;然而，因为PASTA是窄管，所以当PASTA的一端被留在生物反应器外部时未曝露的树脂是最少的且其实践起来更好。在需要较长或较短长度的PASTA的情况下，其可以容易地通过简单地切掉软管来形成，无需密封末端，因为壳体经间隔式密封；其将仅招致容纳在被切割的隔室内的树脂损失；此树脂可以加以收集且在之后使用以使损失最少。类似地，当需要较长长度时，可以通过将多个较短长度热封在一起而将其连接装配。预想在商业生产环境中，PASTA将保持被卷拢成卷盘且当需要时，拉开并切割成所需长度。PASTA卷盘可保持在液体中防止树脂污染且在将其引入到生物反应器中之前加以洗涤。
[0016]又一方面，本发明提供一种用于在生物反应器中制造经纯化的目标生物产物的方法，通过在表达周期结束时使用PASTA或通过周期性地从生物反应器移出经表达的目标生物产物接着在生物反应器外部对其进行纯化来实现。
[0017]先参看图1，包含PASTA的柔性多孔管I的优选实施例的侧截面图，所述柔性多孔管用密封端2和3并且沿管的长度以预定距离4密封来持留树脂5。
[0018]使用本发明中所主张的PASTA预想了两种不同类型的制造方法。首先，在完成目标生物产物的表达步骤后将PASTA安置在生物反应器内部。此时，目标生物产物已完全表达且以溶液形式存在于用于在生物反应器中表达目标生物产物的营养培养基中。本发明的PASTA包含容纳有适量树脂的管，所述树脂能够结合生物反应器中以溶液状态存在的目标生物产物。所用树脂的量通过首先确定生物反应器中目标生物产物的浓度且然后由树脂的理论结合能力来确定。举例来说，单克隆抗体和融合蛋白结合约30-50mg/mL的蛋白质A树脂；因此对于1000L的批量来说，其中表达量为约1G/L(例如对于融合蛋白依那西普(etanercpt)或单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)来说)。因此为了结合1000G蛋白质，所需树脂的量为约20到33升。这一量的树脂的成本为约300，000美元到500，000美元。这是巨大的金额，但鉴于蛋白质A树脂可以重新使用数百次，因此总工艺成本并不高。所用PASTA的长度将取决于PASTA中树脂的直径和密度。举例来说，20L树脂将容纳于约250米直径为约5mm的PASTA和约65米直径为约1mm的PASTA中。应了解，对于1000L的批量来说，生物反应器的尺寸为约2，000L,因此添加20-33L的体积将不影响生物反应器内部的总体积。在添加PASTA之后，生物反应器以伴以持续气化的混合模式操作，因为常见到停止气化引起蛋白质降解。大体上基于来自试验性研究的预定时间，经常性地测试营养培养基。当生物反应器中依那西普或利妥昔单抗的浓度降低至小于lmg/L或另一此类端点时，捕捉目标生物产物的过程视为完成。此时，为制造商提供了用于纯化这些蛋白质的若干选择。理想的解决方案为使用生物反应器作为纯化色谱柱。这容易地通过首先排出营养培养基(在以上实例中为约1000L)以及悬浮细胞(最有可能是中国仓鼠卵巢细胞)来实现。生物反应器将有可能具有排放口，如果没有，可以创建一个以适应进行生物反应器的这一特殊使用。这一步骤即刻避免了蛋白质纯化过程中成本最高的步骤之一:移出细胞及减小营养培养基的体积，且节省了上文给出的特定实例中约48小时的加工时间。这一阶段仅设备成本节省就将达到数百万美元。现在感兴趣的蛋白质以与所用蛋白质A树脂结合的形式存在且容纳于装置内部。此时，可以关闭生物反应器的排放口且向生物反应器填充足够的液体以覆盖将沉降在生物反应器底部的PASTA。这一液体(最有可能是水)将具有将不会使依那西普或利妥昔单抗与蛋白质A的结合瓦解的pH和传导性。在此阶段添加液体的目的在于移出可能留在PASTA内的任何粘附细胞或其它粒子碎片。在允许混合足够的时间之后，以与早先步骤中移出营养培养基类似的方式排出液体。现在可以向生物反应器填充将引起与蛋白质A结合的除所选蛋白质以外的物质的结合瓦解的缓冲液以浸没PASTA[更好的选择是选择将刚好开始瓦解目标蛋白质的结合但只达到不明显水平的缓冲液]。在混合预定时间之后排出这一缓冲液。在此阶段，可以开始最后一步纯化，其中缓冲液的pH和电解质浓度将完全瓦解结合[理想地小于100% ]，且在混合之后，收集这一缓冲液作为如依那西普或利妥昔单抗的经纯化的目标蛋白质的浓溶液。基于先前的试验性研究，所描述的三个步骤可以组合得到两个步骤。上文所述的制造如依那西普或利妥昔单抗的目标蛋白质的方法是将大大节省所有类型的目标生物药的制造成本的有效工艺。仅仅除去传统设备中的下游加工成本，制造商在设备成本、设备验证成本、长时间加工和不可避免的降解和产率损失(其在每个下游工艺中是常见的)方面将节省数百万美元。本发明现在提供了改变游戏规则的用以制造目标生物药的解决方案，其可以容易地由公司和机构以用于制造这些目标生物产物的较少预算提供，并且允许更快地开发药物。
[0019]上文所述的用于制造目标生物产物的方法呈现了本发明的一个优选实施例。然而，上文所述的操作的资金成本可以通过修改本发明来显著地降低。让我们假定制造商能够提供以上实践中所用树脂蛋白质A成本的仅仅十分之一；在此情况下，将修改方法使得一次添加PASTA中所需树脂的5%，且当其与结合5%目标蛋白质的营养培养基平衡时，移出PASTA且立即用代表5%树脂的新鲜PASTA(已经接触缓冲液以移出所结合的目标蛋白质的PASTA)更换。接着将移出的PASTA放入另一个容器，其中将其浸没在缓冲溶液中以执行上文所述的清洁和纯化。此时，PASTA准备再用于生物反应器中；保持两组各具有5%树脂的PASTA允许连续的纯化工艺且尽管其将耗费较长时间，但这将必定降低操作的初始资金成本。值得注意的是在多种情况下，树脂成本不会高到对于蛋白质A所提到的那样，且在一些情况下树脂甚至可以在使用一次后就丢弃。然而，本发明为制造商提供了基于工艺的可负担能力的方法选择。
[0020]在目标生物产物的制造方面存在众多其它领域的改良，其中两项容易地由本发明解决。举例来说，本发明用于移出不合需要的代谢物以便改良目标蛋白质的表达，且在另一个实例中，本发明用于装载下游色谱柱以便减少一般在使用损失的树脂色谱柱装载过程中发生的损失。
[0021]上文所述的优选实施例关于其中目标生物表达工艺先结束的实例；然而，仍存在许多其它工艺，其中由于经表达的目标生物品对包含表达引擎(express1n engine)的细胞的毒性或在产物不稳定的情况下或甚至在较高产物浓度降低表达所述目标生物产物的细胞的生产率的情况下，持续地移出所述经表达的目标生物产物是关键的。目前，本领域中可用的唯一选择是滤出营养培养基(将生产细胞留在生物反应器中)并将其更换为新鲜培养基；由此从生物反应器移出目标生物产物。移出营养培养基需要大规模的过滤工艺，这使目标生物产物曝露于污染中且需要高度谨慎并操纵所述工艺，从而使得其实行起来成本极高。本发明提供了一种用于持续不断地从生物反应器移出目标生物产物的理想解决方案。这通过从工艺开始时或在目标生物药表达的特定阶段开始，周期性地或持续地安置含有所需树脂的PASTA来实现。使PASTA在生物反应器中平衡，接着从生物反应器中移出并用新鲜PASTA更换。接着可以对移出的PASTA进行如第一实施例中所述用于清洁和纯化的类似处理，且再使用PASTA，从而使工艺中所用树脂的成本降到最低。目标蛋白质一经移出，就可以向营养培养基中补充营养元素。在一个理想的实施例中，制造商将能够设计树脂的组成，所述树脂还将从营养培养基移出任何代谢物，如果这些代谢物的积聚对表达的效率不利的话。所述PASTA可以独立于预期捕捉目标生物产物的PASTA，使用特异性结合代谢物的树脂制备，在此类情况下，可以使用多个PASTA。
[0022]上文所揭示的优选实施例仅仅描述了有限数量的本发明应用。熟悉制造目标生物产物领域的人员将会发现本发明的许多其它用途，且这些用途都通过引用的方式纳入到本文中。
[0023]常见实施例
[0024]在第一实施例中，本发明提出了一种用于在生物反应器内制造纯化形式的目标生物药的方法，其通过将经表达的目标生物产物捕捉在装有能够结合所述目标生物产物的树脂的PASTA中来实现。
[0025]在第二实施例中，本发明提出了一种用于使用生物反应器作为传统色谱柱来纯化目标生物产物的制造方法，使用各种缓冲液从所述生物反应器洗脱出所述目标生物产物。
[0026]在第三实施例中，本发明提出了一种用于提高在生物反应器中表达的目标生物产物的产率的方法，其通过允许在所述目标生物产物被表达时周期性地将其移出来实现。
[0027]在第四实施例中，本发明提出了一种用于在生物反应器内将目标生物产物与营养培养基和目标生物培养物分离的方法，其不需要对营养培养基进行离心以移出目标生物培养物，以及将营养培养基过滤以减小其体积。
[0028]在第五实施例中，本发明提出了一种用于在生物反应器中纯化目标生物产物的方法，其中，使目标生物产物选择性地结合至树脂并对其进行洗脱逐步履行与通常在色谱柱中履行的相同功能。因此，在这种情况下，生物反应器充当色谱柱。
[0029]在第六实施例中，本发明提供了一种实质上降低重组药物制造成本的手段，其通过除去一些成本最高及耗时的步骤来实现。
[0030]在第七实施例中，本发明提供了一种制造毒性目标生物物质的手段，所述毒性目标生物物质会损害生产其的细胞培养物。
[0031]在第八实施例中，本发明提供了一种提高生产率的手段，其通过持续地从生物反应器移出经表达的目标生物产物来实现。
[0032]在第九实施例中，本发明提供了一种通过使含有捕捉树脂的PASTA再循环从而使用少量所述树脂的手段，其实质上降低了生物产物纯化的成本。
[0033]在第十实施例中，本发明提供了一种针对生产生物产物的灌注方法的代替方法；代替更换营养培养基，本发明可以用于移出不合需要的代谢物，且当使用PASTA用于此目的时，向营养培养基中补充新鲜的损失到PASTA中的营养和组分。此应用降低了污染生物反应器的风险，降低了成本并提高了生产率。
[0034]在第十实施例中，本发明提供了一种用于移出生物反应中不合需要的代谢物以便提高所用细胞培养物的生产率的方法，且这是通过在生物反应周期期间引入PASTA且不合需要的代谢物一经移出就回收PASTA并再使用它来实现。
[0035]在第十一实施例中，本发明提供了一种用于装载色谱柱以进行纯化的有效方法，其通过将PASTA缠绕成卷盘达到与色谱柱的直径相等的高度来实现。因为卷盘的高度保持与色谱柱的高度相等，所以实现了适贴配合(snug fit)。在卷盘的侧板中打孔允许洗脱溶剂自由移动。由此防止纯化工艺期间树脂显著损失。
[0036]现有技术
[0037]本发明预期将生物反应器转变成一类分离型生物反应器。在过去，能够在生物反应器内分离产物的膜式生物反应器(MBR, membrane b1reactor)方面已经取得实质性进展。MBR工艺是到二十世纪六十年代末商业规模的超滤(UF)和微滤(MF)膜刚可用就引进。最初工艺是由道尔奥立弗公司(Dorr-Olivier Inc.)引进并组合了活性污泥生物反应器与交叉流膜过滤循环的使用。此工艺中所用的平板膜是聚合物膜且孔径在0.003到0.01 μ m范围内。虽然更换常规活性污泥工艺的沉降槽的想法是吸引人的，但是由于膜的成本高，产物(三级流出物)的经济价值低以及因膜积垢而引起的潜在的性能快速丧失，所以难以证明使用此种工艺为适当的。因此，集中于获得高通量，因此必需以高交叉流速率在显著能量损耗(约10kWh/m3产物)下抽吸混合液体悬浮固体(MLSS,mixed liquor suspendedsolid)以便减少积垢。由于第一代MBR的经济性较差，所以其只应用于具有特殊需求的利基领域(niche area)，例如隔离的活动房屋停放场或滑雪场。
[0038]1989年，山本(Yamamoto)和同事将膜浸没于生物反应器中的想法使得MBR取得了突破。直到那时，MBR被设计成分离装置位于反应器外部(侧流MBR)且依赖高跨膜压(TMP, high transmembrane pressure)以维持过滤。由于膜直接浸溃于生物反应器中，因此浸没式MBR系统通常优于侧流配置，尤其对于家庭污水处理。浸没式配置依赖粗气泡曝气(coarse bubble aerat1n)以产生混合并限制积垢。浸没式系统的能量需求可能比侧流系统低多达2个数量级，且浸没式系统在较低通量下操作，需要较大膜面积。在浸没式配置中，曝气被视为影响工艺的水力和生物性能的主要参数之一。曝气维持固体悬浮，冲刷膜表面且为生物质供氧，从而产生较佳的生物降解能力和细胞合成。
[0039]近期MBR开发中的其它关键步骤为接受适度通量(第一代通量的25%或小于25% )，以及使用两相气泡流来控制积垢的想法。在浸没式配置情况下获得的较低操作成本以及膜成本的稳定降低促进了 MBR工厂设立从90年代中期开始发生指数式增加。从那时起，引进MBR设计和操作方面的进一步改良且将其合并到较大型工厂中。虽然早期MBR在长达100天的固体停留时间(SRT, solid retent1n time)下操作使得混合液体悬浮固体高达30g/L，但近期趋势是应用较短的固体停留时间(约10-20天)，产生更加可控的混合液体悬浮固体(MLSS)含量(10-15g/L)。借助于这些新的操作条件，MBR中的氧传递和抽吸成本有减少的趋势且整体维护得到简化。现在可购得一系列MBR系统，其中大多数使用浸没式膜，但一些外部模块也可得；这些外部系统也使用两相流来控制积垢。典型的水力停留时间(HRT, hydraulic retent1n time)在3小时与10小时之间。根据膜配置，对于MBR应用主要应用空心纤维和平板膜。
[0040]虽然浸没式膜的能量使用更有利，但对于侧流配置，特别是在工业应用中仍然有市场。为了便于维护，侧流配置可以安装在工厂建筑物中的低水平面上。膜更换可以不用专门设备进行，且个别槽的深度清洁可以在其它槽正常操作期间进行而无需从装备中移出膜模块。
[0041]因此，继续研究侧流配置，在此期间发现全尺寸工厂可以较高通量操作。这在近几年在开发低能量系统下达到高潮，所述低能量系统合并有更完善的操作参数控制以及周期性回洗，由此使得能够在低至0.3kffh/m3产物的能量使用下进行可持续操作。
[0042]阿尔贡(Argonne)科学家(www.anl.gov)最近使用电力来输送有机酸使其远离生物催化剂跨过离子交换膜并进入浓缩室，这与用于处置酸的正常代谢过程非常类似。为了以成本有效的方式提供电，研究人员转向电去离子(EDI)。EDI是用于生产高纯度水的已确立的商业技术。先前，阿尔贡科学家修改EDI以使得其可用于化学和农业产品的脱盐。为了实现这一目的，研究人员将松散的离子交换树脂珠粒模制成多孔树脂薄片，使得能够以高能量效率捕捉各稀释水平下的电荷盐和酸并且与常规加工相比显著减少废物流。这成为阿尔贡分离型生物反应器的基础。研究人员还认识到，虽然酶直接固定在膜上提供优良的产物分离，但酶密度不足限制了整体性能。为了增加密度，科学家将酶固定技术整合到多孔树脂薄片中并形成可以有效地生产并移出有机酸的材料。当阿尔贡设计其分离型生物反应器时，研究人员将酶捕捉树脂珠粒合并到树脂薄片中。经固定的生物催化剂将糖转化为目标酸，且产物被电输送到浓缩物通道中。这导致在无缓冲或中和作用下发生的反应。阿尔贡的固定技术还允许原位剥离和更换降解的酶而无需拆开系统。
[0043]然而，所揭示的每种类型的膜分离型生物反应器利用了迫使目标生物产物跨过膜的类似原理。本发明的显著不同之处在于提供能够容纳能够结合目标生物产物的树脂的PASTA，持留所述树脂的膜除了保持树脂与生物反应器中的大量液体分离以及防止较大规模的生物体或细胞接触树脂之外不具有特定功能。本发明中的分离功能由非特异性的非电驱动的反应提供。
[0044]关于分离型生物反应器的设计和操作的现有技术未提到本发明的概念。关于用于目标生物科学中的分离型生物反应器的主要参考文献为2004年11月19日申请的美国专利申请案10/9393，642，其中揭示了一种分离型生物反应器。因此，其为一种分离型生物反应器，其包含阳极和阴极；多个反应室，各具有入口和出口且各包括具有离子交换树脂的多孔固体离子交换薄片，反应室各交插在阳离子交换膜和阴离子交换膜之间或阳离子或阴离子交换膜和双极性交换膜之间；多个产物室，各具有入口和出口且由阳离子或阴离子交换膜与一个反应室隔开；用于在反应室入口和出口之间输送材料和用于在产物室入口和出口之间输送产物的再循环机构；和用于在阳极和阴极之间供应电位从而使得离子在腔室之间输送的机构，借此在可电离的有机产物(包括产物离子)的生产期间每个反应室中滞留或产生的相对离子与带相反电荷的离子组合以形成分子，一些或所有分子被输送到反应室入口，同时产物离子被输送到相邻的产物室中以便与带相反电荷的离子组合以形成产物，从产物室出口排出的产物流持续地再循环至产物室入口以便增加产物流中产物的浓度。此申请案中所描述的所有特征对于本发明来说都不具有实质性，且此申请案中未揭示本发明的基本特征。
[0045]2007年4月5日申请的美国专利申请案11/732，992揭示了一种多孔固体离子交换薄片，其包含生物分子:捕捉树脂和离子交换树脂的组合从而在所述薄片内形成含有+2价过渡金属阴离子的带电捕捉树脂。此外，此申请案主张了一种分离型生物反应器，其包含阳极和阴极；多个反应室，其中至少一些由多孔固体离子交换薄片形成，所述多孔固体离子交换薄片具有生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合从而在所述薄片内形成带电捕捉树脂且具有固定在所述带电捕捉树脂上的经基因标记的生物分子，内部具有带电捕捉树脂的所述多孔固体离子交换薄片各交插在阳离子交换膜和阴离子交换膜之间；和用于在阳极和阴极之间供应电位的机构。这些揭示内容与本发明都不具有共性且此申请案中未叙述本发明的基本特征。
[0046]2007年12月11日颁予的美国专利7，306，934揭示了一种用于固定生物分子的多孔固体离子交换薄片，所述薄片包含含有+2价过渡金属阳离子的生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合。所述专利进一步揭示了一种分离型生物反应器，其包含阳极和阴极；多个反应室，其中至少一些由多孔固体离子交换薄片形成，所述多孔固体离子交换薄片具有生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合且具有固定在所述生物分子捕捉树脂上的经基因工程改造标记的生物分子，所述多孔固体离子交换薄片各交插在阳离子交换膜和阴离子交换膜之间；和用于在阳极和阴极之间供应电位的机构。本发明不依赖此专利中揭示的任何特征，此专利中也未叙述本发明的任何特征。
[0047]2011年9月21日颁予的美国专利7，799，548主张一种从生物反应器中的多孔固体离子交换薄片原位剥离经基因标记的生物分子的方法，所述薄片具有生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合从而在所述薄片内形成带电捕捉树脂且具有固定在所述生物分子捕捉树脂上的经基因标记的生物分子，所述方法包含使生物反应器中的多孔固体离子交换薄片与剥离流体在一定温度下接触一段时间足以从中剥离至少一些经基因标记的生物分子。此专利另外主张了从生物反应器中的多孔固体离子交换薄片原位剥离经基因标记的生物分子，此后使经基因标记的生物分子再生至所述多孔固体离子交换薄片上的方法，所述薄片具有生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合从而在所述薄片内形成带电捕捉树脂且具有固定在所述生物分子捕捉树脂上的经基因标记的生物分子，所述方法包含使生物反应器中的多孔固体离子交换薄片与剥离流体在一定温度下接触一段时间足以从中剥离一些经基因标记的生物分子，此后使生物反应器中剥离的多孔固体离子交换薄片与有效量的经基因标记的生物分子在一定温度下接触一段时间足以将经基因标记的生物分子固定在带电捕捉树脂上。本发明不依赖此专利中揭示的任何内容，此专利中也未揭示本发明的任何基本特征。
[0048]2006年11月28日颁予的美国专利7，141，154揭示了一种持续地由低级醇和有机酸制造有机酯的方法，其包含将有机酸或有机盐引入到电去离子(EDI)堆叠中和/或在所述电去离子堆叠中产生有机酸或有机盐，所述电去离子堆叠具有阳极和阴极以及多个反应室，所述反应室各由多孔固体离子交换树脂薄片形成，所述多孔固体离子交换树脂薄片交插在阴离子交换膜之间或阴离子交换膜和阳离子交换膜之间或阴离子交换膜和双极性交换膜之间，提供用于在EDI阳极和阴极之间建立电位的机构，其中至少一些反应室为酯化室及/或生物反应器室及/或容纳有有机酸或盐的室，借此存在于EDI堆叠中的有机酸或有机盐分离成阳离子和阴离子，其中阴离子通过阴离子交换膜(如果需要的话)迁移至关联的酯化室中且与酯化室中的低级醇反应以形成有机酯和水，其中至少一些水分裂成质子和羟基阴离子，其中至少一些羟基阴离子迁移至相邻室中，所述离子迁移通过在EDI阳极和阴极之间建立电位来促进。所述专利另外揭示了一种用于制造有机酯的设备，其包含电去离子(EDI)堆叠，所述电去离子堆叠具有阳极和阴极以及多个反应室，所述反应室各由多孔固体离子交换树脂薄片形成，所述多孔固体离子交换树脂薄片交插在阴离子交换膜之间或阴离子交换膜和阳离子交换膜或双极性膜之间；用于在所述EDI阳极和所述阴极之间建立电位的机构，所述反应室中的至少一些为酯化室或由阴离子交换膜与相邻的生物反应器室隔开的酯化室和/或酸/碱捕捉室，所述生物反应器室各含有能够由在其中流动的可电离的流体形成有机酸或盐的离子交换树脂薄片，所述酯化室各含有能够由低级醇和有机酸或盐的阴离子形成有机酯和水的离子交换树脂薄片、直接供应到所述酯化室或从相邻室供应的阴离子源和供应到所述酯化室的低级醇源，借此当在所述EDI阳极和阴极之间建立电位时，所述酯化室中由水分裂产生的至少一些羟基阴离子迁移跨过所述阴离子交换膜到达相邻室以推动反应持续地产生有机酯。此专利中揭示的特征对于本发明来说都不具有实质性且此专利中未揭示或传授本发明的基本特征。
[0049]概括地说，上文所揭示的现有技术传授了多孔固体离子交换薄片用于固定生物分子的用途，所述薄片包含含有+2价过渡金属阳离子的生物分子捕捉树脂的组合；其还传授了一种分离型生物反应器，其包含阳极和阴极；多个反应室，其中至少一些由多孔固体离子交换薄片(上文)形成，所述多孔固体离子交换薄片具有生物分子捕捉树脂和离子交换树脂的组合且具有固定在所述生物分子捕捉树脂上的经基因工程改造标记的生物分子，所述多孔固体离子交换薄片各交插在阳离子交换膜和阴离子交换膜之间；和用于在阳极和阴极之间供应电位的机构。本发明明显不同于上文所传授的分离型生物反应器。首先，本发明不需要使用电极，或具有+2价过渡金属阳离子的树脂，或固定金属离子亲和色谱法。EDI (电去离子)的使用和标签的特定使用以及用来移出所捕捉的目标生物产物(主要是酶)的溶剂的有限性质使得此专利的传授内容与本发明截然不同。此外，且最显著地，现有技术可能不能和本发明的传授柔性生物反应器的优选实施例一起使用。
[0050]此外，现有技术需要额外的硬件从而使制造目标生物产物的工艺增加了大量成本，而本发明将若干工艺组合成一个而没有增加任何新的成本要素。现有技术还对某些类型的分子具有特异性，而本发明是每种类型的目标生物产物所通用的。
【权利要求】
1.一种用于在生物反应器中表达的生物产物的纯化和分离处理组合件PASTA，其包含柔性多孔管，所述柔性多孔管填充有结合树脂且具有尺寸小于所述结合树脂的尺寸的多个孔并且在两端并沿网管的长度以规则距离密封。
2.根据权利要求1所述的PASTA，其中所述柔性多孔管是由塑料、尼龙和复合材料制成的。
3.根据权利要求1所述的PASTA，其中所述柔性多孔管的直径小于10mm。
4.根据权利要求1所述的PASTA，其中多个孔的尺寸在Iμ到50μ范围内。
5.根据权利要求1所述的PASTA，其中密封所述柔性多孔管的所述规则距离在1mm到10Omm范围内。
6.根据权利要求1所述的PASTA，其中所述树脂包含离子交换树脂、疏水性树脂、亲和树脂或其混合物。
7.根据权利要求1所述的PASTA，其中，其中所述树脂包含蛋白质或肽作为配体。
8.根据权利要求1所述的PASTA，其中所述树脂包含对所述目标生物产物具有特定亲和性的树脂。
9.根据权利要求1所述的PASTA，其中所述树脂包含多种树脂。
10.一种用于在生产周期结束时收获并纯化目标生物产物的方法，其包含: a.在生物反应器中表达所述目标生物产物； b.在生物反应周期结束时在所述生物反应器中安置适当长度的根据权利要求1所述的PASTA以提供预定量的树脂； c.通过混合所述生物反应器的内容物以允许所述目标生物产物与所述PASTA中的所述树脂实质上完全结合来捕捉所述目标生物产物； d.从所述生物反应器移出所述生物反应器中除所述PASTA以外的内容物； e.通过向所述生物反应器中添加能够从所述PASTA中的所述树脂移出所结合的所述目标生物产物的缓冲液来从持留在所述生物反应器中的所述PASTA洗脱所述目标生物产物。
11.根据权利要求10所述的用于收获并纯化目标生物产物的方法，其中使用不同缓冲液重复步骤(e)。
12.根据权利要求10所述的用于收获并纯化目标生物产物的方法，其中所述PASTA在步骤(d)之后从所述生物反应器移出且装填在色谱柱中以供纯化。
13.一种用于在生产期间收获目标生物的方法，其包含: a.在生物反应器中开始所述目标生物产物的表达周期； b.在所述表达周期的预定阶段在所述生物反应器中安置适当长度的根据权利要求1所述的PASTA以提供预定量的树脂并使所述PASTA的一端可从所述生物反应器的外部接取； c.允许所述PASTA中的所述树脂结合预定量的所述目标生物产物； d.通过牵拉可从所述生物反应器的外部接取的PATA的所述端来从所述生物反应器移出所述PASTA并且将其更换为新鲜的PASTA ； e.将所移出的PASTA浸没在装有能够破坏所述目标生物产物与所述树脂的结合的缓冲液的单独容器中，从所述容器中移出所述PASTA以获得经纯化的目标蛋白质的浓溶液；和 f.在步骤(b)中再使用来自步骤(e)的所述PASTA。
14.根据权利要求13所述的用于收获目标生物产物的方法，其中使用多个PASTA独立于所述目标生物产物移出任何不合需要的生物反应代谢产物。
15.根据权利要求13所述的用于收获目标生物产物的方法，其中向所述生物反应器补充由所述PASTA移出的营养元素。
16.根据权利要求10和13所述的用于收获并纯化目标生物产物的方法，其中所述目标生物产物是使用细菌、酵母、杂交瘤、杆状病毒、哺乳动物细胞或植物细胞产生的。
17.根据权利要求10和13所述的用于收获并纯化目标生物产物的方法，其中所述目标生物广物选自由以下组成的群组:溶解的包涵体、小蛋白、轴基质蛋白、融合蛋白、标签蛋白、激素、甲状旁腺激素、生长激素、促性腺激素、胰岛素、ACTH、泌乳刺激素、胎盘催乳激素、促黑素细胞激素、促甲状腺素、降血钙素、脑啡肽、血管收缩素、细胞激素人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、葡萄糖异构酶、α -淀粉酶、内-β -葡聚糖酶、生长激素GH、IGF-1、IGF-2、PTH、PGE2、TGF-β , TGF- α、bEGF、EGF、PDGF-AB、PDGF-BB、骨保护素(OPG)、骨桥蛋白(OP)、FGF-1、FGF-2、甲状腺激素、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7、VEGF、L25 (OH) 2、维生素D3、降血钙素、IFN- a、IFN- β、IFN- y、OCN (骨钙化素)、ON (骨结合素)、OP-1 (成骨蛋白-1)、NGF、胶原蛋白、纤维结合蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、因子XII1、重组蛋白、重组抗体和重组肽。
18.一种用于在生物反应周期中移出不合需要的代谢物的方法，其包含: a.向生物反应器中添加足够量的根据权利要求1所述的PASTA，其含有能够结合所述生物反应器中的所述不合需要的代谢产物的树脂或树脂混合物； b.在所述生物反应器中实现所需低水平的不合需要的代谢组分后从所述生物反应器移出所述PASTA ； c.使所移出的PASTA与能够移出不合需要的代谢物的缓冲液反应并在步骤(a)中再使用所述PASTA。
19.一种用于用树脂装载色谱柱的方法，其包含: a.缠绕以填充足够量的根据权利要求1所述的PASTA呈具有一定高度和一定侧板宽度的卷盘使得其配合于色谱柱中； b.将所述卷盘插在色谱柱中。
20.根据权利要求19所述的用于装载色谱柱的方法，其中所述卷盘的所述高度和所述卷盘的所述侧板的所述宽度使得其适贴地配合于所述色谱中。
21.根据权利要求19所述的用于装载色谱柱的方法，其中所述侧板经打孔。
【文档编号】C12P1/00GK104169426SQ201280066706
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2011年11月29日
【发明者】沙法拉·K·尼亚齐 申请人:医用蛋白国际有限责任公司