专利名称：快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法
技术领域：
本发明属于与生物工程领域，尤其是一种可保证筛选准确度、减少筛选工作量，提高筛选效率的快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称ALA)又名S-氨基乙酰丙酸、S-氨基戊酮酸，其用途非常广泛，已应用于农业和医学等领域。如作为光活化绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂而应用于农业领域；在医学上已被应用于癌症的光动力学治疗和诊断上，另外，还可作为治疗痤疮的外用药及生发剂。Nishikawa等以NTG (亚硝基胍，CH4N4O)重复诱变红假单胞菌属的类球红细菌( o而如cter
而s)并通过对类球红细菌生长条件的控制，增大了 5-氨基乙酰丙酸的产量；日本科莫斯石油公司也是利用变异的类球红细菌iRhodebacter sphaeroides、来制取5_氨基乙酰丙酸，极大的提高了产量。提高5-氨基乙酰丙酸产量的关键是对高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的筛选，现有的筛选方法是通过摇瓶培养菌株后进行筛选，但由于诱变育种的盲目性及诱变产生的优良生产性状不易保持，增大了诱变育种筛选的难度，使得筛选工作量大，筛选效率低。·
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可保证筛选准确度、减少筛选工作量，提高筛选效率的快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法。本发明的技术解决方案是:一种快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法，依次按照如下步骤进行:
a.将经过诱变处理的用以生产5-氨基乙酰丙酸的类球红细菌IRhodobactersphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32°C培养后稀释制成IO3^lO4个/ml的菌悬液，涂平板培养至生成菌落；
b.挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于深孔板各孔中的液体培养基中培养36 48h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分别为甘氨酸15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,继续培养24h ;所述液体培养基为每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸钠3.Sg,磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.053g,硫酸锰1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培养是在恒温微孔快速振荡器上，30 32°C，黑暗，振荡15(Tl80r/min培养；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的质量浓度为1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。本发明操作简单，不仅筛选准确度高于现有技术，而且缩短了筛选周期，保留了突变菌株的突变性状，可减少筛选工作量，提高筛选效率，可以应用于高通量、大规模筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。
图1为本发明实施例1的96深孔板筛选直方图。
具体实施例方式实施例1:
a.将经过物理或(和)化学诱变处理(处理方法同现有技术)的用以生产5-氨基乙酰丙酸的类球红细菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32°C培养后稀释制成IO4个/ml的菌悬液，涂平板静置培养，31°C黑暗培养4天，平板上生成菌落； b.挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于96深孔板的96个孔中的液体培养基中培养40h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，每升培养基中加入量为甘氨酸30mmol,琥拍酸30 mmol,乙酰丙酸45mmol,继续培养24h ;所述液体培养基为每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸钠3.Sg,磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵0.Sg,硫酸镁 0.2g，氯化钙 0.053g，硫酸锰 1.2X10_3g，尼克酸 1.0X10_3g，VB1 1.0Xl(T3g，酵母膏2.0g，生物素1.0X10_5g ;所述培养的条件是在恒温微孔快速振荡器上，32°C，黑暗，振荡170r/min 培养；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的质量浓度为1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。实施例2:
a.将经过物理或(和)化学诱变处理(现有技术)的用以生产5-氨基乙酰丙酸的类球红细菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32°C培养后稀释制成IO3个/ml的菌悬液，涂平板静置培养，32°C黑暗培养4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于96深孔板的96孔中的液体培养基中培养48h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量为甘氨酸15mmol/L，琥拍酸20 mmol/L,乙酰丙酸30mmol/L,继续培养24h ;所述液体培养基为每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸钠3.8g,磷酸氢二钾0.5g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸铵0.8g,硫酸镁0.2g,氯化钙0.053g,硫酸锰1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培养的条件是在恒温微孔快速振荡器上，32°C，黑暗，振荡180r/min培养；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的质量浓度为1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。实施例3:
a.将经过物理或(和)化学诱变处理(现有技术)的用以生产5-氨基乙酰丙酸的类球红细菌GWotZo如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，31°C培养后稀释制成IO4个/ml的菌悬液，涂平板静置培养，32°C黑暗培养4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于96深孔板96孔中的液体培养基中培养36h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量为甘氨酸45mmol/L，琥拍酸40 mmol/L,乙酰丙酸60mmol/L,继续培养24h ;所述液体培养基为每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸钠3.8g,磷酸氢二钾0.5g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸铵0.8g,硫酸镁0.2g,氯化钙0.053g,硫酸锰1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素
1.0X 10_5g ;所述培养的条件是在恒温微孔快速振荡器上，30°C，黑暗，振荡150r/min培养；
c.向每孔中加入0.1ml IM的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的体积浓度为1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。Ehrlich显色剂为现有技术，即2%的对-二甲氨基苯甲醛的醋酸溶液和0.1ml质量浓度16%的高氯酸。本发明实施例1的96深孔板筛选直方图如图1所示，从图1中可以看出，G12菌液的553nm分光光度值为0.340，为96孔菌液中的最大值。将96孔中菌液配制成相同浓度，按照现有技术方法生产5-氨基乙酰丙酸，结果表明G12菌液所生产ALA浓度为33.1 mg/L,为高产5-氨基乙酰丙酸诱变菌株。以G组为例，G组的12株菌液试验如表1:
表I G组12株菌产5-氨基乙酰丙酸的浓度(单位:mg/L)
权利要求
1.一种快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法，依次按照如下步骤进行: a.将经过诱变处理的用以生产5-氨基乙酰丙酸的类球红细菌iRhodobactersphaeroides) (CICC No: 10278)用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32°C培养后稀释制成IO3^lO4个/ml的菌悬液，涂平板培养至生成菌落； b.挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于深孔板各孔中的液体培养基中培养·36 48h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分别为甘氨酸·15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,继续培养24h ;所述液体培养基为每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸钠3.Sg,磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾·0.5g，硫酸铵0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.053g,硫酸锰1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培养是在恒温微孔快速振荡器上，·30 32°C，黑暗，振荡15(Tl80r/min培养； c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的质量浓度为1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。··
全文摘要
本发明公开一种可保证筛选准确度、减少筛选工作量，提高筛选效率的快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法，是将一株类球红细菌通过物理或化学方法诱变处理后，无菌生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32℃培养后，稀释菌悬液涂平板；从平板上挑单个菌落到无菌的96孔深孔板的对应孔中，32℃，黑暗，振荡培养48h，加前体和琥珀酸，再培养24h；ALA微量显色法(深孔板法)检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。
文档编号C12N15/01GK103232993SQ20131003091
公开日2013年8月7日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者庄国宏, 宋涛, 张琪 申请人:大连三仪动物药品有限公司