新型RNAi前体及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了高效引发RNAi的新型RNAi前体分子及其制备方法和应用。所述RNAi前体从5′端到3′端依次为：长1nt的5′端未配对区域；长15nt-17nt的5′端配对区域；长3nt-9nt的顶端环区域；长15nt-17nt的3′端配对区域，所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域；长1nt-6nt的3′端未配对区域；以及任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，所述RNAi前体产生的siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。本发明RNAi前体加工生成单链siRNA的效率显著提高，对靶基因的抑制效率更高；脱靶作用更弱；毒性低。
【专利说明】新型RNAi前体及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及新型的RNAi前体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(smallinterfering RNA, siRNA)介导的RNA降解现象,最初在秀丽线虫中被发现,此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展,并名列2002年十大科学进展之首。2006年,Craig Mello和Andrew Fire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技 术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratory syncytial virus infect1n)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wet age-related macular degenerat1n)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(Hepatitis B)、实体瘤(solid tumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychia congenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。
[0003]RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶III (RNApolymerase III)启动子，如 H1,U6 等转录产生的 shRNA(short hairpin RNA)。shRNA 被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。这种基于RNA聚合酶III的shRNA表达载体转录效率高，且能在大多数种类的组织细胞中表达。构建成病毒载体，比如慢病毒和腺病毒载体等后，可以用于感染原代细胞等用普通方法难以转染的细胞，从而达到沉默靶基因的目的。因此，shRNA载体技术得到广泛应用，有多个公司开发了相应的shRNA载体用于商业化应用，这是通常所说的第一代RNAi载体技术。
[0004]RNAi已经成为大多数生物和医学实验室日常都需要使用的技术，但目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括:(I)效率不高。往往需要设计5个shRNA或siRNA才能保证有1_2个能对靶基因达到70%以上的抑制效果。(2)脱革G作用(off-target)严重。由于siRNA可以通过与mRNA部分互补配对(类似miRNA的作用方式)，从而非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。这种作用方式不只局限于Ago2蛋白，其它不具有切割活性的Argonaute蛋白，例如哺乳动物中的Agol、3、4,也可以引起脱革巴作用，并且siRNA中除了发挥功能的guide strand(引导链)以外，另一条互补链(称为passenger strand,过客链)也会产生脱祀作用。(3)对细胞内源miRNA具有较强的非特异性竞争作用。由于siRNA在加工成熟以及行使功能时，需要利用参与miRNA途径的蛋白因子，比如Dicer, exportin-5以及Ago2等,所以必然会对内源的miRNA产生竞争,影响内源miRNA的正常加工和功能。研究表明，长期高表达shRNA会对成年小鼠肝脏造成损伤并致死【I】。
[0005]综上所述，本领域急需毒副作用低，对靶基因的抑制效率高以及产生成熟siRNA效率高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种可以引发RNA干扰(RNAi)的新型RNAi前体分子(saRNA, Single-stranded Ago2-processed interfering RNA)及其制备方法和应用，所述RNAi前体对靶基因的抑制效率更高、脱靶作用更弱、毒性低，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。
[0007]在第一方面，本发明提供一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5'端到3'端依次具有以下区域:
[0008](a) 5'端未配对区域，所述5'端未配对区域长度为Int ;
[0009](b)5'端配对区域，所述5'端配对区域长度为15nt_17nt ;
[0010](c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt_9nt ；
[0011](d)3'端配对区域，所述3'端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5'端配对区域与3'端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp ；
[0012](e)3'端未配对区域，所述3'端未配对区域长度为lnt_6nt ;以及
[0013](f)任选的与3'端未配对区域相连的3'端核酶区，其中，
[0014]所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5'端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。
[0015]在优选的实施方式中，所述siRNA的核苷酸序列位于所述双链区域和顶端环区域的第I到第22位之间。
[0016]在优选的实施方式中，所述siRNA的长度为22nt_30nt。
[0017]在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt_6nt。
[0018]在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。
[0019]在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体包含与3'端未配对区域相连的3'端核酶区。
[0020]在另一优选的实施方式中，所述核酶选自:HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶等；优选地，所述核酶是HDV核酶。
[0021]在优选的实施方式中，所述RNAi前体由Ago2选择性加工产生成熟的siRNA。
[0022]在优选的实施方式中，所述RNAi前体是化学合成的。
[0023]在第二方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明第一方面所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本发明第一方面所述的RNAi前体。
[0024]在第三方面，本发明提供一种构建物，所述构建物包含本发明第二方面所述的表达盒。
[0025]在第四方面，本发明提供一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物。[0026]在第四方面，本发明提供一种产生siRNA的方法，所述方法包括:
[0027]I)将本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞；和
[0028]2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。
[0029]在优选的实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。
[0030]在优选的实施方式中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。
[0031]在第五方面，本发明提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括:
[0032]将本发明第一方面所述 的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞。
[0033]在第六方面，本发明提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含:
[0034]I)本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和
[0035]2)适合将I)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；
[0036]所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。
[0037]在优选的实施方式中，所述组合物还包含Ago2蛋白。
[0038]在第七方面，本发明提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒,所述试剂盒包括:
[0039]I)容器，所述容器中装有本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和
[0040]2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。
[0041]在第八方面，本发明提供本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。
[0042]在第九方面，本发明提供本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。
[0043]在第十方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含:
[0044]a)本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和
[0045]b)药学上可接受的载体。
[0046]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1显示了传统shRNA和本发明saRNA的结构特征及其差异。
[0048]图2显示了用于检测不同RNAi前体对靶基因沉默效率的报告基因系统。[0049]图3: (a)显示了荧光素酶报告基因实验检测RNAi前体双链区长度对siRNA的表达和抑制活性的影响；(b)显示了 Northern blot检测不同双链区长度的siRNA前体(13bp-23bp)产生siRNA的量及其长度；(c)显示了荧光素酶报告基因实验检测不同大小的顶端环对siRNA表达和抑制活性的影响；(d)显示了 Northern blot检测不同大小顶端环的siRNA前体(3nt-9nt)产生siRNA的量。
[0050]图4:显示了 Northern blot检测Ago2基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)中，RNAi前体双链区长度对siRNA表达的影响。
[0051]图5: (a)显示了化学合成的双链siRNA (双链siGP)、shRNA (shGP)以及saRNA(saGP)结构示意图；(b、c)显示了报告基因实验以及Northern blot检测化学合成的双链siGP、shGP以及saGP在细胞内的加工情况。
[0052]图6: (a)显示了荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA和saRNA表达和抑制活性的影响；(b)显示了 Northern blot检测HDV核酶对shRNA和saRNA加工产生成熟单链siRNA效率的影响。
[0053]图7: (a、b)显示了荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA和saRNA表达和抑制活性的影响；(c、d)显示了 Western blot检测shRNA以及saRNA在HEK293细胞中沉默内源基因IaminC和p53的效果；(e、f)显示了 Northern blot检测细胞内用传统shRNA和所述新型saRNA载体表达siRNA CsiLC和sip53)的效率和加工情况。
[0054]图8: (a、b)显示了免疫沉淀(IP)过表达的Agol、2、3并检测其与shRNA和saRNA及其加工产物的结合情况；(c、d)显示了免疫沉淀(IP)细胞内源的Agol、2并检测其与shRNA和saRNA及其加工产物的结合情况。 [0055]图9显示了比较传统shRNA与带有核酶的saRNA (saRNA-RZ)的脱靶作用(分别针对siGP、siLC以及sip53三个siRNA)的报告基因实验结果。
[0056]图10显不了 shRNA和saRNA中passenger strand产生的脱祀作用的报告基因实
验结果。
[0057]图11: (a)显示了 shRNA和saRNA对miRNA加工和功能的影响；(b)显示了用小RNA深度测序方法检测saRNA-RZ对细胞内源miRNA表达谱的影响。
[0058]图12: (a)显示了 saRNA表达盒示意图；(b)显示了 saRNA及其表达盒应用于慢病毒载体的示意图。
[0059]图13显示了 Western blot检测shRNA以及saRNA慢病毒表达载体对内源p53基因的沉默效果。
【具体实施方式】
[0060]发明人经过广泛而深入的研究，发现了具有特殊结构的RNAi前体，与传统的shRNA相比具有不同的加工成熟和作用机制，对靶基因具有更高的抑制效率；脱靶作用更弱；毒副作用低，从而能更好地应用于科学研究和疾病治疗。在此基础上完成了本发明。
[0061]术语定义
[0062]本文所用的术语“ RNAi ”(RNA interference, RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解同源mRNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscript1nal gene silencing, PTGS)、共抑制(cosuppress1n)及 RNA 介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。
[0063]本文所用的术语“siRNA”(Smallinterfering RNA, siRNA)是指一种小 RNA 分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer (RNA酶III家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。
[0064]本文所用的术语“RNAi前体”是指可以在哺乳动物细胞中加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer、Ago2或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA,进而实施RNAi。类似地，本文所用的术语“表达盒”是指包含本发明RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的RNAi前体；而本文所用的术语“构建物”是包含所述表达盒的构建物。
[0065]本文所用的术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由细胞内源的RNA聚合酶III (RNA polymerase III)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5_6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时,该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer和Ago2等蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。然而，在动物整体水平对shRNA毒性的研究表明，长期高表达shRNA会对成年小鼠肝脏造成损伤，导致小鼠死亡。目前认为造成毒性的主要原因是由于shRNA在加工成熟以及行使功能时需要利用miRNA途径的蛋白因子，如Dicer和exportin-5 (参与将分子输送出细胞核的蛋白因子)等。过量shRNA会对细胞内源miRNA的加工和功能产生非特异性竞争作用，造成毒性。从而为基于shRNA的RNAi技术在科研和基因疗法的开发前景蒙上了阴影。
[0066]本文所用的术语“miRNA”(micr0RNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个祀基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式,最原始的是pr1-miRNA ；pr1-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA,即miRNA前体,长度大约为50-90个核苷酸；pre_miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。
[0067]本文所用的术语“核酶(ribozyme) ”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指具有催化活性的RNA分子，即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一 RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多，有的能够切割RNA、有的能够切割DNA，有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。
[0068]本领域技术人员鉴于本发明的教导，不难理解，本发明可利用各种核酶，包括但不限于，HDV核酶、发夹状核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)等。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该RNAi前体的核苷酸序列都可以加在该RNAi前体的Y或:V端。
[0069]saRNA
[0070]本发明提供一种具有莖环结构的RNAi前体，saRNA (jingle-strandedAgo2-processed interfering RNA)。发明人发现本发明saRNA生成的单链siRNA对革巴基因的单位分子抑制效率远远高于现有技术的shRNA，而脱靶作用和细胞毒性显著低于现有技术的shRNA。本发明的saRNA由RNA聚合酶III (RNApolymerase III,简称pol III)转录产生或由化学方法合成，直接被细胞内的Ago2选择性加工产生成熟的单链siRNA，而不依赖于Dicer蛋白。
[0071]本发明的saRNA从5'端到3'端依次具有以下区域:5'端未配对区域，5'端配对区域，顶端环区域、3'端配对区域，3'端未配对区域以及与3'端未配对区域相连的任选的3'端核酶区；其中，所述5'端未配对区域长度为Int;所述5'端配对区域与3'端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp ;所述顶端环区域长度为3nt-9nt ;所述3'端未配对区域长度为lnt_6nt ;与靶基因序列互补配对的核苷酸序列位于saRNA双链区和顶端环的第I到第22位之间。
[0072]在优选的实 施方式中，本发明saRNA中顶端环长度为4nt_6nt，更优选4nt。
[0073]此外，本领域技术人员应该明白，本文所述的的配对包括核苷酸碱基的G:C、C:G、A:U和U:A配对，还包括G:U和U:G配对。
[0074]除了单位分子抑制效率比传统的shRNA高，本发明saRNA的脱靶作用(off-target)比shRNA低。本文所用的术语“脱祀作用”是指siRNA对与其序列部分互补配对的mRNA的表达产生抑制作用的现象，其作用机制与miRNA通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达的机制相类似【2】。saRNA脱靶作用较小原因之一是只有具备RNaseIII核酸内切酶活性的Ago2蛋白(即RNAi中发挥沉默功能的主要蛋白)才能对saRNA进行加工并产生具有功能的单链siRNA，而没有RNaseIII核酸内切酶活性的Agol、Ago3和Ago4蛋白不能产生成熟的单链siRNA,也就不会产生由Agol、Ago3和Ago4导致的脱革巴作用；而shRNA由Dicer加工后产生的siRNA可以同时与Agol、Ago2、Ago3和Ago4蛋白结合，所有这四种Ago蛋白都会产生脱靶作用。发明人在HEK293细胞中同时过表达传统的shRNA (shGP)或带有核酶的saRNA (saGP-RZ)以及带有flag标签的Agol、Ago2和Ago3蛋白(细胞中Ago4表达量很低),并通过flag抗体免疫共沉淀富集Ago蛋白，然后通过Northern blot检测进入不同Ago蛋白的小RNA种类。实验结果显示,shGP加工产生的siRNA既能和Ago2结合，也能够和Agol和Ago3结合；saGP_RZ被核酶切割后产生的siRNA前体形式(未被加工的RNAi前体没有抑制活性)可以与Agol、Ago2和Ago3结合，但成熟的siRNA产物只能在Ago2中检测到(图8a、8b)。针对细胞内源的Agol和Ago2的免疫共沉淀实验也显示相同的结合情况(图8c、8d)。
[0075]本文所用的术语“passenger strand (过客链)”是指在双链siRNA中与有功能的单链siRNA(与祀基因序列完全互补配对,也称为guide strand,引导链)互补配对的另一条单链RNA。passenger strand不参与沉默祀基因,但同样可以结合Ago蛋白，通过与细胞内的其它mRNA序列部分或完全互补配对，非特异性抑制其它基因的表达，从而导致脱靶作用。
[0076]发明人还发现，当本发明saRNA结构的3'末端还连接有核酶编码序列，例如丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis Delta Virus Ribozyme,简称HDV核酶)时,可以进一步显著提高用DNA载体表达的saRNA加工产生的siRNA量及其对靶基因的抑制效率。
[0077]因此，在优选的实施方式中，本发明saRNA结构的Y末端与核酶相连。所述核酶包括但不限于:HDV核酶、发夹状核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerheadribozyme)等；优选地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该RNAi前体的核苷酸序列都可以加在该RNAi前体的5'或3'端。
[0078]在RNA聚合酶III启动子的驱动下，saRNA和HDV核酶序列被一同转录出来，HDV核酶在saRNA的3'末端特异性位点发生自切割，产生的saRNA可以进一步有效地被Ago2识别并加工。Northern blot结果显示，这种带有HDV核酶的saRNA的加工效率明显高于不带HDV核酶的saRNA，产生了更多的成熟单链siRNA，显著提高了对靶基因的抑制效率(图6b、图 7e、7f)。
[0079]本领域技术人员鉴于本发明的教导，不难理解，本发明可利用各种核酶，包括但不限于，HDV核酶、发夹状核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)等，只要所述核酶能在本发明saRNA的3'末端特异性位点发生自切割，从而产生所述saRNA。在优选的实施方式中，本发明利用的核酶是HDV核酶。所述HDV核酶是一种具有催化活性的RNA分子，能在动物细胞体内形成具有活性的高级结构，高效催化所在的RNA发生自切割。
[0080]鉴于本发明以及现有技术的教导，本领域技术人员还应明白，虽然本发明实施例中采用转录的方法产生本发明的saRNA，但本发明的saRNA还可采用其它方法，例如化学合成的方法获得。可如文献【3】和【4】所述方法化学合成本发明的saRNA，或者还可由提供多核苷酸化学合成服务的公司，例如IDT、Dharmacon等公司获得本发明的saRNA。
[0081]在本发明saRNA的基础上，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明saRNA的编码序列，以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本发明的saRNA，经Ago2蛋白加工后产生成熟的siRNA。
[0082]在表达盒的基础上，本发明进一步提供一种构建物，所述构建物包含上述表达盒。
[0083]本发明还提供一种细胞，所述细胞包含本发明的saRNA或表达盒或构建物。
[0084]本发明还提供了一种产生siRNA的方法，所述方法包括:
[0085]I)将本发明的saRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞；和
[0086]2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。
[0087]在优选的实施方式中,所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中获得产生的siRNA。
[0088]在优选的实施方式中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。
[0089]本发明还提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括:
[0090]将本发明的saRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞。
[0091]本发明还提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含:
[0092]I)本发明的saRNA或表达盒或构建物；[0093]2)适合将I)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；
[0094]所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。
[0095]在一优选例中，所述组合物还包含Ago2蛋白。
[0096]本发明还提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0097]I)容器，所述容器中装有本发明的saRNA或表达盒或构建物；和
[0098]2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。
[0099]本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含:
[0100]a)本发明的RNAi前体或表达盒或构建 物；和
[0101]b)药学上可接受的载体。
[0102]本发明的优点:
[0103](I)与现有的shRNA载体相比，本发明saRNA载体产生siRNA的单位分子抑制效率更闻;
[0104](2)本发明saRNA载体的脱靶作用显著低于现有shRNA ；
[0105](3)本发明saRNA载体对细胞内源包括miRNA在内的小RNA的影响较小，毒性低；
[0106](4)本发明的saRNA为利用RNAi技术选择性沉默靶基因表达提供了比传统shRNA更好的选择，在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大的潜力。
[0107]实施例
[0108]材料与方法
[0109]1.质粒构建
[0110]本发明实施例中用到的shRNA或saRNA瞬时表达载体构建时都是将T4PNK加磷处理，然后将变性、退火后的DNA双链分子(含shRNA或saRNA序列)插入瞬时表达载体中Hl启动子下游的BamH I和Hind III两个限制性内切酶位点之间得到的。以实施例6中所用到的 saGP 为例，构建时将正向引物 5' -gatccaacttcagggtcagcttgccgtcaagctgaccctgaagtcattttttggaaa-3' (SEQ ID NO:1)与反向弓丨物5' -agcttttccaaaaaatgacttcagggtcagcttgacggcaagctgaccctgaagttg-3' (SEQ ID NO: 2)(构建其它 shRNA 或 saRNA 表达盒所需的具体序列参见表1)作如上T4PNK加磷以及变性、退火处理后插入瞬时表达载体中Hl启动子下游的BamH I和Hind III两个限制性内切酶位点之间。实施例中所用到的瞬时表达载体序列为:ggtaccatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccggaaaagcttagatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaa gctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata(SEQ ID NO:3)，其中下划线所示序列为BamH I和Hind III位点。
[0111] 带有HDV核酶的saRNA表达盒是通过PCR的方法在saRNA的3丨端加上HDV核酶，然后酶切并插入到瞬时表达载体中Hl启动子下游的BamH I和Hind III两个限制性内切酶位点之间得到的，也可以在saRNA与HDV核酶之间引入其它的酶切位点以便于saRNA表达盒的构建。以实施例6中所用到的saGP-RZ表达盒为例，其序列为:atffgcafgtcgcfafgigffctgggaaa/caccaiaaacgtgaaatgtct/tggnttigggaatciiaiaagifcfgfafg
agaccxwfcggafccmcttcagggt€ngmgc€gtcmgctgaccctgaagt€mssccsscatsstcccasc
ctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggacccactttttt (SEQ ID N0:4)，其中斜体字所示为Hl启动子序列；黑体字所示为saGP序列；下划线示出HDV核酶序列；tttttt为转录终止序列。PCR所用的正向引物序列为5' -acgtggatccaacttcagggtcagcttgccgtcaagctgaccctgaagtcatggccggcatggtcccagcct-3' (SEQ ID NO: 5),反向弓 I物序列为 5' -atctaagcttttccaaaaaagtgggtcccattcgcca-3f (SEQ ID NO:6)(构建其它带有HDV核酶的shRNA或saRNA表达盒所需的具体序列参见表1)，将PCR产物用BamH I和Hind III两个限制性内切酶双酶切后插入到瞬时表达载体中Hl启动子下游的BamH I和Hind III位点之间，就可以获得最终用于表达saRNA的质粒。
[0112]针对siRNA的报告基因载体构建时都是将T4PNK加磷处理，然后变性、退火后的
DNA双链分子(含siRNA靶序列)插入萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)基因3丨UTR
的Nhe I和Xba I两个限制性内切酶位点之间得到的。以siGP的报告基因载体为例，构建
时将正向引物 5' -ctagctctacggcaagctgaccctgaagttcaaatt-3! (SEQ ID NO:7)与反向
引物 5' -ctagaatttgaacttcagggtcagcttgccgtagag-3! (SEQ ID NO:8)(构建其它报告基
因载体所需的具体序列参见表2)作如上T4PNK加磷以及变性、退火处理后插入萤火虫荧光
素酶基因3' UTR的Nhe I和Xba I两个限制性内切酶位点之间。其中所用到的萤火虫荧
光素酶报告基因(含 3' UTR)的序列为:atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattc
tatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaat
tgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaag ctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccg
gtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacag
tatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagc
tcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtc
acatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcact
gatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattct
cgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcac
ggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaaga
gctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgcca
aaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaa
gtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcage
tattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttg
tggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtcc
ggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagctta
ctgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctc
ccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgac
gccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgt
cgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccg
gaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaattctag
tgaattcgtttcggaccccacctcccaatcccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggaga
gagagacagagacagatccattcgattagtgaacgggatctcggctagettatcatctagagtcggggcggccggcc
gcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgcttta
tttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgc
attcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggta，
其中下划线所示序列为Nhe I和Xba I位点。当然，本领域普通技术人员知晓，还可以利用其它报告基因，例如GFP蛋白基因。
[0113]具体实施例中所用到的siRNA序列如下:
[0114]siGP5/ -AACTTCAGGGTCAGCTTGCCGT-3' (SEQ ID NO:9)
[0115]siLC5/ -AGTTCTTCTGGAAGTCCAGTTC-3' (SEQ ID NO:10)
[0116]sip535/ -ATACACATGTAGTTGTAGTGGA-3' (SEQ ID NO:11)
[0117]siBACE15/ -ACTGTCCACAATGCTCTTGTCA-3' (SEQ ID NO:12)
[0118]sipl55/ -ATAACCGTTACAATTGCTCTCA-3' (SEQ ID NO:13)
[0119]2.细胞培养及报告基因实验
[0120]本发明所有实验案例中用到的HEK293细胞都是生长在含10%胎牛血清的DMEM培养基(购自GIBCO公司)中并于37°C、5%C02的环境下培养。所有针对HEK293细胞的瞬时转染实验都是使用Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)转染试剂并按其说明进行操作。突光素酶活性的检测米用Dual-Glo luciferase assay system(购自Promega公司)并在BERTHOLD LB940仪器上进行操作。
[0121]3.Northern blot 实验
[0122]本发明所有涉及Northern blot的实验案例中，细胞总RNA的提取都是使用Trizol试剂(购自Tak ara公司)并按其说明进行操作。所使用的凝胶系统是含SM尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶，电泳电压采用500V。杂交及洗膜系统都是采用罗氏公司的Northernblot系统并按其说明进行操作，杂交温度为50°C，所使用的探针是3'端带地高辛修饰的与目的siRNA序列完全互补配对的DNA序列(购自生工生物工程公司)。底物显色反应是采用的CDP-star系统(购自ABI公司)并按其说明进行操作
[0123]4.Western blot 实验
[0124]本发明所涉及的Western blot实验都是采用含SDS的10%的聚丙烯酰胺凝胶系统，针对P53基因的鼠源单克隆抗体(购自Sigma公司)采用1:1000比例稀释并使用，针对IaminC基因的兔源多克隆抗体(购自B1world Technology公司)采用1:500比例稀释并使用，针对β -actin基因的鼠源单克隆抗体(购自CoWin B1tech公司)采用1:2000比例稀释并使用。底物显色反应采用Immun-Star HRP chemiluminescence试剂盒(购自Thermo公司)并按其说明进行操作。
[0125]5.免疫共沉淀实验
[0126]本发明所涉及的免疫共沉淀实验是采用的EZview Red Ant1-FLAG Affinity Gel系统(购自Sigma公司)并按其说明进行操作。细胞内源的Agol和Ago2的免疫共沉淀实验是采用的兔抗Agol以及Ago2的抗体(购自MBL Internat1nal Corporat1n公司)并按其说明进行操作。
[0127]6.慢病毒包装及感染实验
[0128]本发明中慢病毒的包装是采用VSVG/AR8.91系统，将三种质粒(pCMV_VSV_G、PCMV Δ R8.91以及载体质粒)按照一定比例混合并转染HEK293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收取含慢病毒颗粒的细胞上清并用0.45 μ m的滤膜(购自Sigma公司)过滤。获得病毒后感染目的细胞(本发明采用HEK293细胞)，同时在细胞培液中加入8 μ g/mL的Hexadimethrine bromide (购自Sigma公司),病毒感染后24小时，换成含I μ g/mL的puromycin (购自Sigma公司)的培液进行药物筛选。六天后,裂解细胞并做Western blot。[0129]7.小RNA深度测序实验
[0130]本发明所涉及的小RNA深度测序实验中细胞总RNA的提取采用Trizol试剂(购自Takara公司)并按其说明进行操作。小RNA的建库采用Illumina公司的小RNA建库系统并按其说明进行操作。
[0131]表1 shRNA和saRNA表达盒序列
[0132]
[0133]
【权利要求】
1.一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5'端到3'端依次具有以下区域: (a)5,端未配对区域，所述5'端未配对区域长度为Int; (b)5'端配对区域，所述5'端配对区域长度为15nt-17nt; (c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt-9nt； (d)3'端配对区域，所述3'端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5'端配对区域与3'端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp ； (e)3/端未配对区域，所述3'端未配对区域长度为lnt-6nt;以及 (f)任选的与3'端未配对区域相连的3'端核酶区，其中， 所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5'端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt-6nto
3.如权利要求2所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。
4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体包含与:V端未配对区域相连 的3'端核酶区。
5.如权利要求4所述的RNAi前体，其特征在于，所述核酶选自:HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶等；优选地，所述核酶是HDV核酶。
6.一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体。
7.—种构建物，所述构建物包含权利要求6所述的表达盒。
8.—种细胞,所述细胞包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物。
9.一种产生siRNA的方法，所述方法包括: 1)将权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物转入哺乳动物细胞；和 2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。
10.一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括: 将权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物转入哺乳动物细胞。
11.一种组合或组合物,所述组合或组合物包含: 1)权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和 2)适合将I)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂； 所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。
12.—种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括: 1)容器，所述容器中装有权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和 2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。
13.权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。
14.权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含: a)权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和 b)药学上可接受的载体。
【文档编号】C12N15/10GK104031916SQ201310068534
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2013年3月4日
【发明者】吴立刚, 尚仁福, 徐蓓英 申请人:中国科学院上海生命科学研究院