核酸和检测转基因水稻b2a68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻B2A68的旁侧序列所示的核酸。本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该方法包括：（1）使用针对如上所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；（2）检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性引物产生的特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻B2A68或者含有该核酸的衍生系。本发明还提供了一种试剂盒及该试剂盒的用途。通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻B2A68或者含有该核酸的衍生系的检测。
【专利说明】核酸和检测转基因水稻B2A68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种核酸、一种检测转基因水稻的方法、一种试剂盒以及该试剂盒在检测转基因水稻中的应用。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一，人们对其遗传转化和育种利用等方面进行了深入细致的研究。我国在水稻转基因研究领域取得了一系列重大成果，很多转基因水稻品种已被获准进行环境释放和生产性试验，2009年转Bt基因抗螟虫水稻“华恢I号”和“Bt汕优63”获得生产应用安全证书，标志着我国转基因水稻具备了商业化生产的基本条件。为了平衡贸易利益、满足公众关切、控制潜在风险、加强工商监管，许多国家相继建立了转基因生物及其产品的安全评价和标识制度。我国现行对于农业转基因生物的管理依据的是国务院2001年5月23日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》，以及农业部2002年I月5日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》3个配套规章。为了实现对转基因生物及其产品的标识管理，保障转基因产品的有效监管和转基因产业的健康发展，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格要求。
[0003]转基因植物中外源基因在染色体上插入位置的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。目前已有专利和文献报道了多个作物转基因转化体的检测方法，如:张大兵等(2006)建立 了转基因玉米M0M863的品系特异性检测方法；卢长明等(2007)扩增出了转基因油菜Rfl外源插入载体旁侧序列并建立了该转化事件特异性检测方法；谢家建等(2007)利用Tail-PCR、Genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63和科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。
[0004]利用密码子优化的Cry2Aa#基因和Bar基因转化水稻，可以获得抗螟虫、抗除草剂水稻(参考专利申请“密码子优化的Cry2Aa基因与重组载体以及改变作物抗性的方法”，专利申请号201210280832.4)。既抗除草剂、又抗螟虫的转基因水稻将在生产上发挥重要作用。本发明的发明人通过密码子优化的Cry2Aa#基因和Bar基因转化水稻，获得了一个转基因水稻新品系B2A68。然而，由于转化事件具有随机性，所以转基因水稻品系B2A68的外源基因在基因组中插入位置并不清楚、确定。因此，难以实现对转基因水稻品系B2A68的特异性检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种核酸及检测含有该核酸的转基因水稻品系的方法。
[0006]转基因水稻新品系B2A68已经在文献(杂交水稻，2013，28 (I):63-67)中公开，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得，中国科学院亚热带农业生态研究所保证从本发明的申请日起二十年内向公众发放转基因水稻新品系B2A68。
[0007]由于外源基因的随机插入，导致外源基因插入在水稻基因组同一位置的机会几乎没有，所以外源基因序列与水稻基因组序列拼接而成的旁侧序列具有唯一性。因此，旁侧序列的核酸是一种全新的核酸分子，本发明的发明人得到了转基因水稻品系B2A68的旁侧序列的具体序列信息，由此建立的检测方法是检测转基因水稻品系B2A68及其含有该核酸衍生系的特异性方法。
[0008]为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻B2A68的旁侧序列所示的核酸，所述转基因水稻B2A68的旁侧序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段，SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ IDN0.1的第100-141位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
[0009]另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻B2A68或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系，该方法包括:
[0010](I)使用针对如上所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；
[0011](2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物扩增产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻B2A68 或者由B2A68杂交产生的含有该核酸片段的衍生系。
[0012]另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物和/或左侧特异性引物，优选的，所述右侧特异性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ IDN0.17所示的核酸；所述左侧特异性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
[0013]另一方面，本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻B2A68或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系中的用途。
[0014]通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻B2A68或者由B2A68杂交产生的含有该核酸片段的衍生系的检测。
[0015]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0017]图1为转基因水稻B2A68所用载体的T-DNA区域结构及引物位置示意图。
[0018]图2为转基因水稻B2A68通过hiTail_PCR扩增得到的T-DNA右边界侧的旁侧序列片段电泳图。M:lKb plus DNA marker ;1、3、5:B2A68 二级扩增产物;2、4、6:B2A68 三级扩增产物；7:非转基因对照D68 二级扩增产物；8:非转基因对照D68三级扩增产物。
[0019]图3为通过LD-PCR方法获得的转基因水稻B2A68中T-DNA左边界侧的旁侧序列片段电泳图。M:lKb plus DNA marker ；Ck:非转基因对照D68 ;1_11:转基因水稻B2A68。[0020]图4为外源片段在水稻染色体上插入位点及其上下游基因分布图。
[0021]图5为转基因水稻B2A68中T-DNA右边界侧的旁侧序列特异性引物RB-2F/RB-2R检测电泳图。M:1Kb plus DNA marker ；B:空白对照;1、3、5、7、9:转基因水稻B2A68、CD083、B2A4008S、BE7001S、B88S ;2、4、6、8、10:非转基因对照 D68、吉梗 88、4008S、7001S、P88S。
[0022]图6为转基因水稻B2A68中T-DNA右边界侧的旁侧序列特异性引物LB-2F/LB-2R检测电泳图。M:1Kb plus DNA marker ；B:空白对照;1、3、5、7、9:转基因水稻B2A68、CD083、B2A4008S、EB7001S、B88S ;2、4、6、8、10:非转基因对照 D68、吉梗 88、4008S、7001S、P88S。
[0023]图7为右边界特异性引物退火温度优化结果。M:1Kb plus DNA marker ；1:52.0°C；2:52.2°C ；3:52.8°C ；4:53.6°C ；5:54.5°C ；6:55.5°C ；7:56.5°C ；8:57.5°C ；9:58.4°C ；10:59.20C ；11:59.80C ；12:60.(TC。
[0024]图8为左边界特异性引物退火温度优化结果。M:1Kb plus DNA marker ；1:52.0°C；2:52.2°C ；3:52.8°C ；4:53.6°C ；5:54.5°C ；6:55.5°C ；7:56.5°C ；8:57.5°C ；9:58.4°C ；10:59.20C ；11:59.80C ；12:60.(TC。
【具体实施方式】
[0025]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0026] 本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻B2A68的旁侧序列所示的核酸，所述转基因水稻B2A68的旁侧序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段，SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ ID N0.1的第100-141位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
[0027]本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻B2A68或者由转基因水稻B2A68杂交产生的含有如上所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系，该方法包括:
[0028](I)使用针对如上所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；
[0029](2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物扩增所产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻B2A68或者由B2A68杂交产生的含有该核酸片段的衍生系。
[0030]根据权本发明的方法，其中，所述针对SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特异性引物是指能够仅扩增SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段所示的核酸的引物，所述针对SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特异性引物不能够扩增SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段所示的核酸以外的核酸，优选地，所述针对SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特异性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述特异性引物扩增产生的目的片段的长度为307bp。
[0031]根据本发明的方法，其中，所述特异性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQID N0.17所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件可以包括退火温度为55-60°C。
[0032]根据本发明的方法，其中，所述针对SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段的特异性引物是指能够仅扩增SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段所示的核酸的引物，所述针对SEQID N0.6或SEQ ID N0.6的片段的特异性引物不能够扩增SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段所示的核酸以外的核酸，优选地，所述特异性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQID N0.19所示的核酸；所述特异性引物的目的片段的长度为521bp。
[0033]根据本发明的方法，其中，所述特异性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQID N0.19所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件包括退火温度为52-58°C (图8)。
[0034]本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物和/或左侧特异性引物，其中，所述右侧特异性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述左侧特异性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
[0035]根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性对照核酸包括SEQ ID N0.1所示的核酸和/或SEQ ID N0.6所示的核酸。
[0036]根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高温DNA聚合酶。
[0037]本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻B2A68及由转基因水稻B2A68杂交产生含有如上所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系中的用途。 [0038]转基因水稻B2A68所用载体的T-DNA区域结构及引物位置见图1，该载体由Cry2Aa#基因表达框和Bar基因表达框组成。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA。利用hiTail-PCR和LD-PCR方法，分离并延伸得到T-DNA右边界侧的旁侧序列，如SEQ IDN0.1所示，长度1975bp。利用LD-PCR方法分离得到的T-DNA左边界侧的旁侧序列，如SEQID N0.6 所示，长度 2856bp。
[0039]通过分析SEQ ID N0.1发现，其中第I至第120位序列与所用载体右边界上游序列完全一致，说明是外源基因序列，第121至第1975位序列与已发表的水稻基因组第3号染色体上序列(NCBI登录号AC133450.6) 一致，说明是转基因水稻B2A68的基因组序列。通过分析SEQ ID N0.6发现，其第I至第1541位序列与水稻3号染色体上的发表序列(AC133450.6)高度匹配，说明是转基因水稻B2A68的基因组序列，第1542至第2856位与载体左边界及CaMV35S终止子、Bar基因序列及35S启动子部分序列完全相同，说明是外源基因序列。
[0040]根据T-DNA右旁侧序列(SEQ ID N0.1)设计特异性引物，其中一条引物根据SEQID N0.1中第I至第120位序列设计，即是按照T-DNA右边界区域序列设计，另一条引物根据第121至第1975位序列设计，即按照插入位点旁边的水稻基因组序列设计。优选的，本发明采用的正向引物为RB-2F，序列如SEQ ID N0.16所示(5，-CCAACTTAATCGCCTTGC-3’)，反向引物为RB-2R，序列如SEQ ID N0.17所示(5，-GGGTTCCAATCTTGTGCC-3，)，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻B2A68能获得长度为307bp的特异条带。
[0041]根据T-DNA左旁侧序列(SEQ ID N0.6)设计特异性引物，其中一条引物根据SEQ IDN0.6中第I至第1541位序列设计，即是按照T-DNA左边界区域序列设计，另一条引物根据第1542至第2856位序列设计，即参照插入位点旁边的水稻基因组序列设计。优选的，本发明采用的正向引物为 LB-2F，序列如 SEQ ID N0.18 所示(5，-ACATTTCATCCAGCAGCAGA-3’)，反向引物为 LB-2R，序列如 SEQ ID N0.19 所示(5，-CCAGATAAGGGAATTAGGGT-3’)，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻B2A68能获得长度为521bp的特异条带。
[0042]本发明首次获得了转基因水稻品系B2A68的插入外源基因的左、右旁侧序列，并且利用这两个旁侧序列建立了灵敏、特异性的转基因水稻B2A68的品系特异性定性PCR检测方法。本发明所建立的转基因水稻B2A68特异性PCR检测方法可以进一步应用于特异性检测试剂盒的开发，以对转基因活体(植株、种子)、产品、提取物进行转基因成分的定性检测，通过标准含量样品的设置，还可实现定量检测和定量检测试剂盒的开发。
[0043]本发明可以采用如下技术方案:
[0044]I)获得右旁侧序列
[0045]转基因水稻B2A68的外源基因在水稻染色体插入位置的右旁侧序列，所述T-DNA右边界侧的旁侧序列，其特征在于:所述右旁侧序列如SEQ ID N0.1所示。
[0046]首先，通过hiTail-PCR扩增得到右旁侧序列的部分序列，如SEQ ID N0.2所示，全长59Ibp。hiTail-PCR所用特异性嵌套引物依据植物表达载体pC3300-Cry2Aa#的T-DNA序列右边界(RB)上游IacZ基因序列设计。植物表达载体pC3300_Cry2Aa#的资料参考专利(201210280832.4)。hiTail-PCR 方法参考文献(Liu et al., 2007, B1Techniques, 43(5):649-456),其中=Rb-Ob 序列为 5，-CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT-3’，Rb-1b 序列为 5’ -ACGATGGAC TCCAGAGCGGCCGCCGACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATC-3’，Rb_2b 序列为5’ -GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT-3’。hiTail-PCR 扩增获得 591bp 长的片断。
[0047]通过分析发现其中第I至第120位核苷酸序列与所用载体右边界序列完全一致；第121至第591位序列与水稻基因组第3号染色体上NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)登录号为AC133450.6的序列的第36171至第36641位完全匹配。
[0048]其次，利用SEQ ID N0.2所示的序列设计引物RBGF，序列如SEQ ID N0.3所示(5’ -TCGGCACAAGATTGGAAC-3’)，参考水稻基因组序列(NCBI登录号AC133450.6)设计引物RBGR,序列如 SEQ ID N0.4 所示(5，-TGCAGTTGAGGTCGGTGT-3’)，利用 RBGF 和 RBGR 引物对PCR扩增得到1740bp的转基因水稻B2A68的基因组序列，如SEQ ID N0.5所示，该序列与网上所列的粳稻序列(AC133450.6)相同。
[0049]然后，把两次扩增获得的两个序列SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5拼接得到右旁侧序列SEQ ID N0.1，该序列全长1975bp，包含第I至第120位的外源基因序列(载体序列)与第121至第1975位的水稻基因组序列。
[0050]2)获得左旁侧序列
[0051]在本发明中，还提供了转基因水稻B2A68的外源基因在水稻染色体插入位置的左旁侧序列，所述T-DNA左边界侧的旁侧序列，其特征在于:所述左旁侧序列如SEQ ID N0.6所示。
[0052]首先，所述左旁侧部分序列，如SEQ ID N0.7所示，它通过LD-PCR扩增得到，全长925bp。具体方法为:参照已公布的该位点上游水稻基因组序列设计正向引物LB-1F，序列如SEQ ID N0.8所示(5，-GGCGTCACGTTTGTTGTT-3’)，根据T-DNA左边界序列设计反向引物LB-1R，序列如SEQ ID N0.9所示(5’-CTGCCCGTCACCGAGATT_3)，用该引物对扩增获得转基因水稻B2A68的部分左旁侧序列，如SEQ ID N0.7所示，长度为925bp。通过分析SEQ ID N0.7发现，除了第612位与水稻3号染色体第36169位相比有一个A碱基缺失外，其余第I至第613位与水稻第3号染色体上第35557-第36170位完全匹配；第614位至第925位与载体pC3300-Cry2Aa#的左边界及CaMV35S终止子部分序列完全相同。
[0053]其次，参考已公布水稻基因组序列(NCBI登录号AC133450.6)设计引物LBGF，序列如 SEQ ID N0.10 所示(5，-TAAACTGTTAGGCGGTGGA-3’)，利用 SEQ ID N0.7 序列设计引物LBGR，序列如 SEQ ID N0.11 所示(5，-TCGTGGAAATTGTGAGGG-3’)，利用 LBGF 和 LBGR 引物对PCR扩增得到转基因水稻B2A68的基因组序列，序列如SEQID N0.12所示，全长1113bp。
[0054]再次，利用SEQ ID N0.7序列设计引物LBTF，序列如SEQ ID N0.13所示(5’ -CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3’)，利用载体pC3300_Cry2Aa# 上 35S 启动子序列设计引物LBTR，序列如 SEQ ID N0.14 所示(5，-TAACATGGTGGAGCACGACA-3’)，利用 LBTF 和 LBTR 引物对PCR扩增得序列，该序列如SEQ ID N0.15所示，该序列与载体pC3300_Cry2Aa#的相应序列相同，全长1068bp。
[0055]最后，将SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.15拼接得到左边界旁侧序列，序列如SEQ ID N0.6所示，全长2856bp。其中第I至第1541位为水稻基因组序列，第1542位至第2856位为外源基因序列(载体序列)。
[0056]3)基于右旁侧序列的B2A68转化事件特异性检测方法
[0057]转基因水稻品系B2A68的外源插入片段的右旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于:所述PCR反应中的两条引物组合为T-DNA右边界的旁侧序列的特异性引物:一条引物依据SEQ ID N0.1中第I至第120位序列设计，另一条引物依据SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列设计。
[0058]优选地，所述特异性引物如下:
[0059]正向引物RB-2F，序列如 SEQ ID N0.16 所示(5，-CCAACTTAATCGCCTTGC-3’)，依据SEQ ID N0.1中第I至第120位序列设计；
[0060]反向引物RB-2R，序列如 SEQ ID N0.17 所示(5，-GGGTTCCAATCTTGTGCC-3’)，依据SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列设计；
[0061]利用上述引物对进行扩增，转基因水稻品系B2A68能获得长度为307bp的目的片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或大小相同的目的片断。
[0062]4)基于左旁侧序列的B2A68转化事件特异性检测方法
[0063]转基因水稻品系B2A68的外源插入片段的左旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于:所述PCR反应中的两条引物组合为T-DNA左边界旁侧序列的特异性引物:一条引物依据SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列设计，另一条引物依据SEQ ID N0.6中第1542至第2856位序列设计。
[0064]优选地，所述特异性引物如下:
[0065]正向引物LB-2F，序列如 SEQ ID N0.18:所示(5，-ACATTTCATCCAGCAGCAGA-3’)，依据SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列设计；
[0066]反向引物LB-2R，序列如 SEQ ID N0.19:所示(5，-CCAGATAAGGGAATTAGGGT-3’)，依据SEQ ID N0.6第1542至第2856位序列设计；
[0067]利用上述引物对进行扩增，转基因水稻品系B2A68能获得长度为521bp的目的片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或大小相同的目的片断。
[0068]5)基于左、右旁侧序列的多重PCR检测方法
[0069]依据SEQ ID N0.1中第I至第120位序列设计I个特异性引物，依据SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列设计I个特异性引物，获得右旁侧序列的I个特异性引物对；依据SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列设计I个特异性引物，依据SEQ ID N0.6中第1542至第2856位序列设计I个特异性引物，获得左旁侧序列的I个特异性引物对；以这2个特异性引物对同时扩增转基因水稻基因组DNA，同时获得左、右边界的2条目标特异带。
[0070]优选的，以特异性引物LB-2F、LB-2R、RB-2F和RB-2R对待测样品DNA进行PCR扩增，转基因水稻B2A68扩增获得521bp和307bp的2条目的片段，其它所有水稻不会获得条带或者上述相同大小的目标条带。
[0071]以下，通过实施例进一步详细说明本发明，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆:实验室手册》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0072]实施例1:转基因水稻品系B2A68右边界旁侧序列的扩增
[0073]1.DNA的提取:CTAB法(王关林等，植物基因工程，北京:科学出版社，2009)。取
2.0yL DNA用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用微量紫外分光光度计测定DNA浓度。 [0074]2.hiTail-PCR 分离 T-DNA 右旁侧序列:参照 Liu 等(Liu et al., 2007, B1Techniques，43 (5):649-456)的方法进行，每个随机引物对重复扩增三次。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。
[0075]表1:hiTail_PCR 所用引物
[0076]
【权利要求】
1.一种核酸，该核酸为转基因水稻B2A68的旁侧序列所示的核酸，所述转基因水稻B2A68 的旁侧序列为 SEQ ID N0.1 或 SEQ ID N0.1 的片段，SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.6 的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ ID N0.1的第100-141位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，优选至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更优选至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
2.一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻B2A68或者含有权利要求1所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系，该方法包括: (O使用针对权利要求1所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物； (2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物扩增产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻B2A68或者含有权利要求1所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述特异性引物包括SEQID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述特异性引物扩增产生的目的片段的长度为307bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括退火温度为55-60°C。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述特异性引物包括SEQID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸；所述特异性引物扩增产生的目的片段的长度为521bp。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括退火温度为52-58°C。
7.一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物和/或左侧特异性引物，其中，所述右侧特异性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述左侧特异性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性对照核酸包括SEQ ID N0.1所示的核酸和/或SEQ ID N0.6所示的核酸。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高温DNA聚合酶。
10.权利要求7-9中任意一项所述的试剂盒在检测转基因水稻B2A68或者含有权利要求I所述的核酸的转基因水稻B2A68的衍生系中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104031912SQ201310068126
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2013年3月4日
【发明者】肖国樱, 蒋利平, 翁绿水 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所