一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用，属于食品甜味剂生物制造【技术领域】，制备的木糖醇可广泛应用于食品、医药、日化等行业。以Candida?tropicalis?CT16为出发菌株，设计构建木糖醇醇合成代谢途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd过量表达的工程菌，增强了合成途径中g6pd基因的拷贝与表达，选育的工程菌(转化子)C.tropicalis?SYG5经多次传代，遗传稳定，优化了木糖醇生物合成的代谢网络和代谢途径，明显提高木糖醇的代谢通量及产量，为木糖醇生物制备提供了优良菌种和技术支持。
【专利说明】一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用，属于食用甜味剂生物制造领域，制备的木糖醇可广泛应用于食品、医药、日化等行业。
【背景技术】
[0002]木糖醇(Xylitol)，也称戊五醇，是一种五碳多羟基糖醇，化学分子式是C5H12O5，外形为结晶性粉末或白色晶体，极易溶于水，味甜，与蔗糖相当，微溶于甲醇和乙醇，热稳定性好。木糖醇不需要胰岛素的参与即能在人体内代谢，亦不会造成人体血糖的急剧变化，因此可作为糖尿病人专用食品的甜味剂，并已广泛应用于口香糖、胶姆糖、太妃糖、软糖、巧克力、果冻、冷饮、口含片、漱口剂、润喉药物、止咳糖浆等食品、日化及医药工业；木糖醇还在卷烟、蓄电池、表面活性剂等方面有许多重要的应用。木糖醇的安全性高，是动物正常代谢的中间产物，人体每天能代谢产生5-15g木糖醇。在自然界中，木糖醇也广泛存在于多种果蔬(如草毒、青梅等)，但含量很少，通常少于900mg / 100g。
[0003]目前木糖醇生产主要采用化学合成法:将农业植物纤维废料(如玉米芯、棉籽壳、蔗糖渣等)水解制得木糖，在高温高压条件下，镍催化剂催化加氢使木糖还原成为木糖醇。该方法要求木糖纯度高(95%以上)，生产成本高，设备要求高，副产物成分复杂，环境污染较大。
[0004]酵母菌可转化木糖生成木糖醇，该生化过程的原料木糖无需纯化制备，反应条件温和，无需耐高压设备，此“绿色”、“清洁”生产技术成为近年研究开发的热点。研究发现，木糖醇的生物合成与磷酸戊糖途径(PPP)紧密相连，需要木糖还原酶、还原性辅酶NADPH等参与(木糖+NADPH 木糖醇+NADP+)，此`还原反应是木糖醇能否顺利连续合成的关键步骤，NADPH主要是通过PPP途径产生，若PPP途径受到破坏，木糖醇产量则明显降低。Kang研究认为，以木糖为底物发酵时，PPP途径的多种相关酶活力远远高于以葡萄糖为底物时，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6TOH)是PPP途径中催化生成NADPH的关键性调控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供应量的有效手段之一。为了增强流向PPP途径的代谢通量及NADPH的再生，Do-Hyun Kwon等将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的G6PDH编码基因ZWFl导入经遗传改造已含有外源木糖脱氢酶基因的酿酒酵母中，改造后重组菌株中G6TOH的酶活力提高了 6倍，木糖醇产率达到2g / L / h，与只导入木糖脱氢酶基因的菌株相比，每升发酵液中木糖醇的产率提到了 25%。热带假丝酵母(Candidatropicalis)是目前木糖醇生产研究广泛应用的菌株,本申请专利将葡萄糖_6_磷酸脱氢酶基因g6pd进行克隆、过量表达，构建高产稳定表达的木糖醇工程菌，增强目的产物木糖醇的代谢流量与产量，为天然木糖醇生物制备提供菌种和技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用。以Candida tropicalis CT16为出发菌株,设计构建木糖醇合成代谢途径中关键酶基因(g6pd)过量表达的代谢工程菌；通过上述技术构建的工程菌(转化子)SYG5经多次传代，遗传性稳定，木糖醇的代谢通量与产量有较大提高；工程菌SYG5在以木糖为主要原料的发酵培养基中高效生产木糖醇。
[0006]生物材料样品保减相关情况的说明
[0007]生物材料样品保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0008]保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
[0009]保藏日期:2013年10月18日。
[0010]保藏编号:CGMCCN0.8364。
[0011]分类命名:热带假丝酵母(Candidatropicalis) SYG5。
【具体实施方式】
[0012]本发明是一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其制备方法与应用，【具体实施方式】(技术方案):
[0013](1) PCR技术从热带假丝酵母DNA模板中扩增g6pd基因，连接到穿梭质粒表达载体pYES-pgk,再将重组载体pYES-pgk-g6pd导入C.tropicalis CT16,使g6pd基因过量表达，筛选阳性转化子，构建了高产木糖醇的C.tropicalis工程菌SYG5。
[0014](2)分析工程菌SYG5的g6pd基因转录水平、G6PDH的酶表达水平、代谢流量分配。
[0015](3)以木糖为主要原料，优化工程菌的发酵培养基和发酵条件，利用发酵罐(生物反应器)发酵生产木糖醇。
[0016]技术效果
[0017]通过调控木糖醇合成代谢途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6TOH的功能基因过量表达，提高了菌体的NADPH供应量和还原力，优化了木糖醇生物合成的代谢途径和代谢流量，提高了木糖醇的生物转化率。在优化发酵培养基和发酵条件下，选育的工程菌SYG5较野生型菌株C.tropicalis CT16在目的产物木糖醇的产量提高了 11.3%、木糖醇产率提高了40.0%，工程菌构建的优化策略、技 术效果明显。
【权利要求】
1.一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌，其特征是将热带假丝酵母(Candidatropicalis)CT16的葡萄糖_6_磷酸脱氢酶基因g6pd过量表达，构建选育的工程菌C.tropicalis SYG5经多次传代，遗传稳定，木糖醇的代谢通量和产量较野生型CT16有明显提闻。
2.一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌制备方法，其特征是设计适当引物，克隆出C.tropicalis CT16的葡萄糖_6_磷酸脱氢酶基因g6pd,并将g6pd基因连接到穿梭质粒pYES-pgk,获得 重组质粒pYES-pgk-g6pd,并将该重组质粒转化导入C.tropicalis CT16,筛选获得工程菌。
3.一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌的应用，其特征是以木糖为主要发酵底物和原料，工程菌C.tropicalis SYG5在发酵罐中高效转化木糖生成木糖醇，经提取纯化制备的木糖醇。
【文档编号】C12P7/18GK103614309SQ201310513570
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】王成涛, 张婵, 尹胜, 刘国荣, 赵磊, 孙宝国, 高雪楠, 秦鲁南 申请人:北京工商大学