一种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法，属于生物工程领域。本发明在以中性脂肪为底物生产C3H的过程中，通过在酵母细胞中表达可分泌到胞外的脂肪酶基因或者直接加入商业化的脂肪酶，首先实现以中性脂肪为原料生产C3H。本发明的技术方案克服了亚麻酸对宿主细胞有毒，而且价格昂贵的问题，具有工业化应用前景。
【专利说明】—种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]顺式-3-己烯醇(C3H, cis-3-hexen-l-ol),又名顺式-3-己烯_1_醇、叶醇,是一种无色油状液体，具有强烈的刚被修割过的绿色草地和叶子的气味。大多数植物能够少量合成顺式-3-己烯醇用于引诱许多捕食性昆虫。当植物遭遇机械损伤或者食草动物捕食时,会产生顺式-3-己烯醇作为一种“呼救”信号分子来引诱食草动物的天敌-捕食性昆虫。顺式-3-己烯醇作为一种重要的芳香化合物应用于果蔬香料和香水。然而，由于顺式-3-己烯醇在植物中的含量低，相应地，天然顺式-3-己烯醇的价格很昂贵，顺式-3-己烯醇的年产量约为30吨。
[0003]在植物中，顺式-3-己烯醇是以α -亚麻酸为底物先后经脂肪氧合酶(LOX)、脂氢过氧化物裂解酶(HPL)和乙醇脱氢酶(ADH)这3种酶作用生成。从20世纪90年代开始，编码这些酶的基因已经相继从多种植物中克隆得到，为在微生物(如大肠杆菌和酵母)中异源表达这些基因产C3H创造了可能。
[0004]合成C3H的关键酶之一是脂肪氧合酶。脂肪氧合酶是一类含铁酶，能够催化含有顺式，顺式-1，4-戊二烯结构(如α -亚麻酸)的脂质中的多元不饱和脂肪酸发生双加氧。它催化的反应如下:脂肪酸+O2=脂肪酸过氧化氢物。脂肪酸过氧化氢物是许多重要激素(如前列腺素类、脂氧素、茉莉酸、创伤激素)以及上文提到的香料/香气物质(如C3H、1_辛烯-3-醇)的前体。
[0005]C3H合成过程中的第二个酶是脂氢过氧化物裂解酶。当存在亚麻酸过氧化氢物底物时，脂氢过氧化物裂解酶会催化亚麻酸过氧化氢物生成顺式-3-己烯醛，再由乙醇脱氢酶将顺式-3-己烯醛转化为C3H。`
[0006]α-亚麻酸(ALA)是种子(如芡欧鼠尾草、亚麻籽、坚果(值得注意的是核桃)以及多种常见植物油)的必要Ω-3脂肪酸和有机化合物。从结构的角度，α-亚麻酸被命名为全-顺式-9，12，15-十八碳三烯酸。在生理学文献中，α-亚麻酸被命名为18:3 (η_3)。α -亚麻酸是一种具有18碳碳链和3个顺式双键的羧酸。其中，第一个双键位于从甲基末端(即η末端)起第三个碳，因此，α-亚麻酸是一种多元不饱和η-3 (Ω-3)脂肪酸，是多元不饱和η-6 (Ω-6)脂肪酸，即Y-亚麻酸的异构体。
[0007]然而，游离脂肪酸，如α -亚麻酸，不但昂贵还对微生物具有毒性，使得目前的生物技术合成从经济和生物学角度变得不可行。而另一方面，甘油三酯或其他中性脂质则价格便宜且对微生物没有毒害作用。甘油三酯由甘油和3个脂肪酸合成得到，甘油三酯是多种多样的，根据油的来源，有的甘油三酯是高度不饱和的，有的不饱和度低。饱和化合物是指氢饱和，即碳原子中所用能结合氢原子的位置都结合上了氢原子。
[0008]但面包酵母由于缺乏胞外脂肪酶不能从甘油三酯中释放出游离C18:3，从而不能直接利用中性脂质来生成C3H。因此，开发一种新的在合成C3H的过程中不影响微生物细胞(如细菌和酵母)存活的C3H生物合成方法十分必要。
【发明内容】
[0009]本发明要解决技术问题是提供一种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法，是以脂肪酶辅助过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WATlI,以中性脂肪为原料生产 C3H。
[0010]所述中性脂肪是C18:3酯或亚麻油。C18:3酯是α-亚麻酸甲酯、α-亚麻酸乙酯、α-亚麻酸甘油三酯中的一种或者多种的组合。亚麻油可以是来源于芡欧鼠尾草、猕猴桃籽、紫苏、亚麻、越橘、荠、马齿觅、沙棘、大麻、油菜籽或大豆中的一种或几种的组合。
[0011]所述脂肪酶源自皱褶假丝酵母。还可以是源自猪胰、皱褶假丝酵母、麦芽或雪白根霉中的一种或几种的组合。所述脂肪酶的基因是来自猪胰、麦芽或雪白根霉的脂肪酶基因。
[0012]编码所述脂肪氧合酶(LoxD-TP)的基因序列如SEQ ID N0.5所示，将LoxD-TP基
因扩增产物用pCR?8/GW/T0P0? TA克隆试剂盒处理，将基因导入Gateway?重组克隆载体
T D O
[0013]编码所述脂氢过氧化物裂解酶(HPL)的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
[0014]所述LoxD-TP和HPL 基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体pAG424GPD_ccdB 和 pAG425GPD_ccdB (Life Technologies)并用于转化 S.cerevisiaeWATllo
[0015]所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的构建方法参照文献UrbanP, Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeast expression, andcharacterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thalianaNADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73a5.J Biol Chem272 (31): 19176-19186 中该细胞的构建方法。
[0016]所述以脂肪酶辅助生产C3H可通过两种方式实现，以中性脂肪为底物，外源添加脂肪酶或过量表达编码脂肪酶的基因:
[0017](I)外源添加脂肪酶
[0018]培养收集过量表达LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiae WATlI，培养收集过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATlI，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反应生成C3H。
[0019]所述细胞悬浮液OD6qq=IO。
[0020]所述脂肪酶来源于皱裙假丝酵母(Candida rugosa),购自Sigma公司，产品号L1754，添加量是 3mg/10mL。
[0021]所述中性脂肪是终浓度(v/v)为0.5%的亚麻油或5%的亚麻油或0.1%的甲酯亚麻酸或0.1%的乙酯亚麻酸。
[0022](2)过量表达脂肪酶基因LIP2
[0023]是将序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶基因克隆进入酵母表达载体pAG423GPD-ccdB,并转化进入已过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因的
S.cerevisiae WATll中；培养重组菌，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪到反应体系，反应生成C3H。
[0024]所述细胞悬浮液OD6qq=IO。
[0025]所述中性脂肪是终浓度(v/v)为2%的亚麻油或0.05%的甲酯亚麻酸或0.1%的甲酯亚麻酸或0.05%的乙酯亚麻酸或0.1%的乙酯亚麻酸。
[0026]本发明要解决的第二个技术问题是提供一株酵母基因工程菌，是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll为宿主，表达基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶和基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氢过氧化物裂解酶。更具体地，是将编码所述脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶的基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体pAG424GPD-ccdB 和 pAG425GPD_ccdB，并转化 S.cerevisiae WATlI。
[0027]应用所述酵母基因工程菌生产C3H的方法，是培养收集过量表达LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiae WATlI，培养收集过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因的
S.cerevisiae WATlI，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反应生成C3H。
[0028]所述细胞悬浮液OD6tltl=IO。所述脂肪酶来源于皱裙假丝酵母(Candida rugosa),购自Sigma公司，产品号L1754，添加量是3mg/10mL。所述中性脂肪是终浓度(v/v)为0.5%的亚麻油或5%的亚麻油或0.1%的甲酯亚麻酸或0.1%的乙酯亚麻酸。
[0029]本发明要解决的第三个技术问题是提供一株酵母基因工程菌，是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll为宿主,表达基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶、基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氢过氧化物裂解酶和基因序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶。更具体地，是将编码所述脂肪氧合酶、脂氢过氧化物裂解酶和脂肪酶的基因分别通过 LR 反应克隆进入酵母表达载体 pAG424GPD-ccdB、pAG425GPD-ccdB 和 pAG423GPD_ccdB，并转化 S.cerevisiae WAT11 ?
[0030]应用所述酵母基因工程菌生产C3H的方法，是培养重组菌，将细胞重新悬浮在100mMpH6.8的磷酸缓冲液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪到反应体系，反应生成C3H。
[0031]所述细胞悬浮液0D_=10。所述中性脂肪是终浓度(v/v)为2%的亚麻油或0.05%的甲酯亚麻酸或0.1%的甲酯亚麻酸或0.05%的乙酯亚麻酸或0.1%的乙酯亚麻酸。
[0032]目前C3H的工业化生产以游离亚麻酸为原料，而亚麻酸对宿主细胞有毒，而且价格昂贵。本发明通过在酵母细胞中表达可分泌到胞外的脂肪酶基因或者直接向反应体系中加入商业化的脂肪酶，首先实现以中性脂肪为原料生产C3H，具有工业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1是顺式-3-己烯醇的结构式。
[0034]图2是亚麻酸的结构式。
[0035]图3是C3H的生物合成过程。
[0036]图4是经基因改造的过量表达LoxD_TP、HPL、Lip2的S.cerevisiae Watll细胞以0.1%的游离亚麻酸或2%的亚麻油为底物生产C3H。
[0037]图5是经基因改造的过量表达LoxD-TP、HPL的S.cerevisiae Watll细胞生产C3H ；CK:以0.2%的C18:3为底物生产C3H ；P0.5:以0.5%亚麻油为底物及来自猪胰的脂肪酶生产C3H ；C0.5:以0.5%亚麻油为底物及来自皱褶假丝酵母的脂肪酶生产C3H ；W0.5:以
0.5%亚麻油为底物及来自麦芽的脂肪酶生产C3H ；R0.5:以0.5%亚麻油为底物及来自麦芽的脂肪酶生产C3H ;P5:以5%亚麻油为底物及来自猪胰的脂肪酶生产C3H ;C5:以5%亚麻油为底物及来自皱褶假丝酵母的脂肪酶生产C3H ；W5:以5%亚麻油为底物及来自麦芽的脂肪酶生产C3H ;R5:以5%亚麻油为底物及来自麦芽的脂肪酶生产C3H。
[0038]图6是经基因改造的过量表达LoxD-TP、HPL、Lip2的S.cerevisiae Watll细胞以C18:3、甲酯亚麻酸或乙酯亚麻酸为底物生产C3H ；CK:0.1%的C18:3 ;ΜΕ_0.05:0.05%的甲酯亚麻酸；ME-0.1:0.1%的甲酯亚麻酸；ΕΤ-0.05:0.05%的乙酯亚麻酸;ΕΤ_0.1:0.1%的乙
酯亚麻酸。
[0039]图7是经基因改造的过量表达LoxD-TP和HPL的S.cerevisiae Watll细胞生产C3H的产量；CK-0.1:代表饲喂0.1%游离亚麻酸；ΜΕ-0.1及ΕΤ-0.1:分别代表饲喂0.1%甲酯亚麻酸或乙酯亚麻酸；ME+LP及ET+LP，分别代表添加来自皱褶假丝酵母的脂肪酶并同时饲喂0.1%甲酯亚麻酸或乙酯亚麻酸。【具体实施方式】
[0040]实施例1以表达LoxD、HLP基因的面包酵母WATll生产C3H
[0041](I)表达载体的构建
[0042]Lox 基因(Lycopersicon esculentum, GenBank:U37840)序列如 SEQ ID N0.1 所示，将Lox基因基于酵母基因组密码子进行优化后得到LoxD基因，序列如SEQ ID N0.2所示，将该基因连接到pUC57载体(GenScript USA Inc.，Piscataway, NJ, USA),得到重组载体pUC57-LoxD。
[0043]LoxD-TP基因序列如SEQ ID N0.5所示，是通过PCR从pUC57_LoxD载体上扩增得到，所用引物为 LoxD-TPF:ATGATTTCAGAAAACTTGGTTAA 和 LoxD-R:CTAGATGGAAACACTATTAGGA。LoxD-TP基因缺失5’端174个碱基，编码由58个氨基酸组成的叶绿体定位序列，将LoxD-TP基因扩增产物克隆进pCR?少GW/TOPO? TA克隆载体(LifeTechnologies)。
[0044]HPL基因的序列如SEQ ID N0.3所示，是基于GenBank:AF230372设计引物，HPL-F:atgaattctgctcctctatcaa 和 HPL-R:tcaactagcctttttcacagatgtga,提取西红柿叶片 RNA(Solanum lycopersicum Moneymaker),通过 RT-PCR 获得 HPL 基因。
[0045]将LoxD-TP和HPL基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体pAG424GPD_ccdB和 pAG425GPD_ccdB (Life Technologies)并用于转化 S.cerevisiae WAT11。转化发方法见文献(Chen DC, Yang BC, Kuo TT.0ne-step transformation of yeast in stationaryphase.Current Genetics.1992,21:83-84)。
[0046]酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) WATll 的构建方法参照文献 UrbanP, Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeast expression, andcharacterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thalianaNADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73a5.J Biol Chem272 (31): 19176-19186。
[0047](2)重组菌的筛选及C3H的转化合成
[0048]将所得同时过量表达LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiaeffATll在缺失Trp和Leu的合成培养基(SD-Trp-Leu，美国Clontech公司生产)中选育及生长。在30°C、225转/分钟的摇床培养两天后，3000转离心5分钟收集细胞，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中至浓度0D_=10，然后，添加0.1%游离亚麻酸(溶解于95%酒精)到反应体系用于C3H的生产，于30°C、225rpm的摇床反应生成C3H。在不同时间点取2ml反应液加入2mlMTBE (Methyl tert-butyl ether)振荡萃取 C3H。有机相用于 GC/MS 测定 C3H 含量，GC/MS分析采用Shimadzu GC-2010系统，该系统带有GCMS-QP2010S检测器，分析柱为:Rtx_5MS(Thickness0.25u; length30m; diameter0.25mm),进样温度 265°C，进样模式为 split,炉温50°C，温度梯度:0-4min50°C>4-7.3min50°C -100。。，梯度 15，7.3-15.3minl00°C _260°C，梯度20，C3H的保留时间大约为5.lmin。结果见实施例2的结果分析。
[0049]实施例2 以表达 LoxD、HLP 和 LIP2 基因的 S.cerevisiaeffATll 生产 C3H
[0050]由于实施例1所得重组菌株不能利用中性脂肪，我们在此基础上继续导入脂肪酶基因LIP2 (GenBank:DQ831123)0所述脂肪酶基因LIP2的序列如SEQ ID N0.4所不，是提取 Yarrowia lipolytica ATCC90811 的基因组 DNA (YeaStar?Genomic DNA 试剂合)，通过 PCR 扩增得到，所用引物为 Lip2_F:ATGAAGCTTTCCACCATCCTTTTCA 和 Lip2_R:TTAGATACCACAGACACCCTCGGTGA, PCR 产物连接pCR?M3NV/ΟΡΟ?载体，LIP2 基因通过 LR 反应克隆进入酵母表达载体pAG423GPD-ccdB并用于转化酵母。
[0051]同时过量表达LoxD-TP、HPL 和 LIP2 基因的 S.cerevisiaeffATll 在缺失 Trp、Leu和His的合成培养基中选育及生长(SD-Trp-Leu，美国Clontech公司生产)，在30°C、225转/分钟的摇床培养两天后，3000转离心5分钟收集细胞，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中至浓度0D_=10，然后，添加终浓度为0.1%的甲酯亚麻酸(溶解于95%酒精)到反应体系用于C3H的生产，于30°C、225rpm的摇床反应生成C3H。在不同时间点取2ml 反应液加入 2ml MTBE (Methyl tert-butyl ether)振荡萃取 C3H。有机相用 GC/MS测定C3H含量，GC/MS分析采用Shimadzu GC-2010系统，该系统带有GCMS-QP2010S检测器，分析柱为:Rtx_5MS (Thickness0.25u; length30m; diameter0.25mm),进样温度 265。。，进样模式为 split，炉温 50°C，温度梯度:0-4min50°C、4-7.3min50 °C _100°C，梯度 15，7.3-15.3minl00°C _260°C，梯度 20，C3H 的保留时间大约为 5.lmin。
[0052]同时用不表达LIP2基因的菌株并添加甲酯亚麻酸作负对照，用不表达LIP2基因的菌株并添加游离亚麻酸作正对照。如图4所示，当表达Lip2基因的同时也表达LoxD-TP和HPL，S.cerevisiaeffATll可以直接以亚麻油为底物少量合成C3H。
[0053]对于仅过量表达LoxD-TP和HPL而不表达Lip2的S.cerevisiaeffATll,添加来自皱褶假丝酵母的脂肪酶，可以合成得到C3H (图5)。仅过量表达LoxD-TP和HPL的
S.cerevisiaeffATll 不能以 C18:3 酯，即 C18:3 甲酯(C18:3_ME)或 C18:3 乙酯(C18:3_ET)为底物得到C3H。这意味着S.cerevisiaeffATll的内源性脂肪酶不能水解C18:3酯。相反，当再在S.cerevisiaeffATll中表达Lip2,或者添加商业化皱裙假丝酵母脂肪酶时，可以合成 C3H。
[0054]借助脂肪酶时，以甲酯亚麻酸为底物生产C3H的效果好于以亚麻油为底物和以游离脂肪酸为底物生产C3H。
[0055]编码脂肪酶的基因是从猪胰、皱褶假丝酵母、麦芽、雪白根霉，以及它们的组合中选择。C18:3酯是从α-亚麻酸甲酯、α-亚麻酸乙酯、α -亚麻酸甘油三酯及它们的组合中选择。C18:3酯来源于亚麻油。C18:3酯来源于从芡欧鼠尾草、猕猴桃籽、紫苏、亚麻、越橘、荠、马齿苋、沙棘、大麻、油菜籽、大豆及它们的组合中挑选的油。
[0056]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。此外，除特别说明之外，本发明所涉及的科学术语具有本领域技术人员一般理解的含义。尽管有很多与本发明的相似、等同的材料方法均可以使用，但本发明优选上述实施方式。
[0057]其他方面，本发明的目的及优势可以从本发明记载的附图、权利要求中得到。
【权利要求】
1.一种以中性脂肪为底物生物合成顺式-3-己烯醇的方法，是以脂肪酶辅助过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WAT11,以中性脂肪为底物生产C3H。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是C18:3酯或亚麻油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶源自皱褶假丝酵母。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述脂肪氧合酶的基因序列如SEQID N0.5 所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述脂氢过氧化物裂解酶的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体pAG424GPD-ccdB和pAG425GPD_ccdB，并用于转化 S.cerevisiae WAT11。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述以脂肪酶辅助生产C3H可通过外源添加脂肪酶或过量表达编码脂肪酶的基因实现。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述通过外源添加脂肪酶生成C3H是培养收集过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATlI，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲 液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反应生成 C3H。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞悬浮液0D_=10。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量是3mg/10mL。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亚麻油，添加量0.5%。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亚麻油，添加量5%。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亚麻酸，添加量.0.1%。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亚麻酸，添加量.0.1%。
15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过量表达脂肪酶基因生成C3H是将序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶基因克隆进入酵母表达载体pAG423GPD-ccdB，并转化进入已过量表达脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATll中；培养重组菌，将细胞重新悬浮在IOOmM pH6.8的磷酸缓冲液中得到细胞悬浮液，然后，添加中性脂肪到反应体系，反应生成C3H。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞悬浮液0D_=10。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亚麻油，添加量2%。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亚麻酸，添加量.0.05%。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亚麻酸，添加量.0.1%。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亚麻酸，添加量.0.05%。
21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亚麻酸，添加量0.1%。
22.—株酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，是以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WATll为宿主，表达基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶和基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氢过氧化物裂解酶。
23.根据权利要求22所示的酵母基因工程菌，其特征在于，编码所述脂肪氧合酶和脂氢过氧化物裂解酶的基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体pAG424GPD-ccdB和pAG425GPD-ccdB，并转化 S.cerevisiae WATlI。
24.—株酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，是以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WATll为宿主，表达基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶、基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氢过氧化物裂解酶和基因序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶。
25.根据权利要求24所示的酵母基因工程菌，其特征在于，编码所述脂肪氧合酶、脂氢过氧化物裂解酶和脂肪酶的基因分别通过LR反应克隆进入酵母表达载体 pAG424GPD-ccdB、pAG425GPD_ccdB 和 pAG423GPD_ccdB，并转化 S.cerevisiae WATlI。
26.权利要求22-25任一所述酵母基因工程菌应用于生产顺式-3-己烯醇。
【文档编号】C12R1/865GK103725716SQ201310722845
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】陈辉, 蔄辉民, 余晓丹 申请人:无锡新和源发酵技术研究院有限公司