使用丝状菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法

使用丝状菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法
【专利摘要】一种多核苷酸，其是在至少一个密码子中具有与编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽的野生型碱基序列不同的碱基序列且被修饰的多核苷酸，修饰的密码子的使用频率为腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌的密码子使用频率，在丝状菌中能够使编码的多肽表达。
【专利说明】使用丝状菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制 造方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用丝状菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方 法。更详细地涉及：编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽并在该丝状菌中能够表达该多肽 的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、将该表达载体导入丝状菌而形成的形质转换体、 使用该形质转换体的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法、以该制造方法制 造的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质及含有其的制剂以及其用途。

【背景技术】
[0002] 来自西洋山葵的过氧化物酶作为在酶联免疫测定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ;ELISA)、免疫组织染色法、南方墨点法、西方墨点法等各种试验中检 测用的酶的一种，被广泛使用。此外，近年来也被广泛用作临床检测试剂盒用酶。
[0003] 虽然过氧化物酶广泛存在于萝卜、红薯、小麦、日本山葵、西洋山葵等一般植物界 中，但是由于西洋山葵的过氧化物酶含量较高等理由，在工业生产上，优选用西洋山葵。
[0004] 但是,来自西洋山葵的过氧化物酶由酸性、中性及碱性同工酶等多种酶构成。另 夕卜，过氧化物酶含量及这些同工酶组成比除了根据栽培土壤的性质、给予肥料的种类以及 量、气候、收获时间等不同会有显著的变动以外，由于是以破坏植物并从多种多样的夹杂成 分中纯化过氧化物酶的方法来制造，因此从西洋山葵纯化的过氧化物酶的品质并不一定是 恒定的。也就是，现在广泛使用的来自西洋山葵的过氧化物酶制品的大多数几乎是多种同 工酶的混合物的状态，其比例几乎每个批次不同。进行使用这种来自西洋山葵的过氧化物 酶制品的各种测定，例如ELISA时，随制造批次而产生不均匀，因而存在难以得到稳定的测 定结果的重大问题。
[0005] 此外，由于作为原料的西洋山葵的栽培需要长时间，根据气候不同其产量会变动， 近年来，由于栽培效率的恶劣或轮栽成需要量大的生物乙醇用谷物等理由，担忧会产生西 洋山葵的供给不稳定的状况，对于能够稳定供给的来自西洋山葵的过氧化物酶的潜在的需 要大。
[0006] 作为克服具有如前述所示的来自西洋山葵的过氧化物酶的问题的方法，考虑通过 使用基因重组技术的微生物来大量生产。通过使用微生物，不仅能够在短时间内大量栽培， 也能够不受气候等影响而进行稳定供给。此外，利用基因重组技术，能够大量地仅表达作为 目的的过氧化物酶，因此也能够避免同工酶的夹杂的问题。
[0007] 在来自西洋山葵的过氧化物酶中，作为主要同工酶之一的过氧化物酶CI a，其DNA 序列及氨基酸序列已明确（参照非专利文献1)。此外，研究使用编码过氧化物酶Cla的基因 在大肠杆菌、酵母及烟草植物细胞中的表达。但是，其表达量在大肠杆菌中的〇. llmg/L(参 照非专利文献2)、在酵母中的5. 3mg/L(参照非专利文献3)、在烟草植物细胞中的3mg/ L (参照非专利文献4)为微量，生产极低且不实用。由以上所述，期望开发可大量生产来自 西洋山葵的过氧化物酶的重组生物以及使用它的来自西洋山葵的过氧化物酶的制造方法。
[0008] 现有技术文献：
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献 I :Fujiyama et al. Eur. J. Biochem, 1988 年，173 卷，第 681-687 页
[0011] 非专利文献 2 :Lin et al. Biotechnol. Prog.，1999 年，15 卷，第 467-471 页
[0012] 非专利文献 3 :Morawski et al. Protein Engineering, 2000 年，13 卷，第 377-384 页
[0013] 非专利文献 4 :Matsui et al.J. Biosci. Bioeng. ,2006 年，102 卷，第 102-109 页


【发明内容】

[0014] 发明要解决的课题
[0015] 本发明鉴于前述现有技术具有的问题而作成，其目的为提供一种能够大量并高效 率地制造来自西洋山葵的过氧化物酶多肽的多核苷酸。
[0016] 解决课题的方法
[0017] 本
【发明者】为了达成所述目的，首先，将含有编码野生型的来自西洋山葵的过氧化 物酶（HRP)Cla的多核苷酸的表达载体导入到丝状菌中，研究在得到的形质转换体中的HRP 肽的产生量。但是，明确的是：不能确认由该形质转换体产生HRP肽，即使使用编码野生型 HRP多肽的多核苷酸，也不能使丝状菌中产生HRP多肽。
[0018] 因此，本
【发明者】为了使HRP多肽在丝状菌中被高表达而进行认真研究，首先，考量 在腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌中密码子的使用频率。接着，调制出使HRP多核苷酸中密 码子的出现频率符合于所得的密码子使用频率的密码子修饰HRP多核苷酸。然后，使用此 密码子修饰HRP多核苷酸，对腐质霉、曲霉及木霉进行形质转换后，虽然无法在腐质霉中确 认其表达，但能够在曲霉及木霉中确认HRP的表达。特别是使用木霉时，成功生产出以往的 100倍以上浓度的HRP。
[0019] 因此，本
【发明者】为了使HRP在木霉中有更高的表达，使用仅符合于木霉的密码子 使用频率的HRP多核苷酸，对木霉进行形质转换。其结果为，能够在该形质转换体中确认 HRP的表达。但是，惊讶的是与预想相反，考量腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌中的密码子使 用频率并使用修饰后的多核苷酸来进行形质转换的情况与使用仅符合作为宿主细胞的木 霉的密码子使用频率的多核苷酸来进行形质转换的情况相比，HRP的生产性显著地更高。
[0020] 本
【发明者】为了进一步验证考量腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌的密码子使用频率 的有效性，考量该3种丝状菌的密码子使用频率并调制修饰后的其他多核苷酸，对木霉进 行形质转换，评价HRP的表达。其结果为，与前述同样地，在形质转换的木霉中，确认HRP有 高表达。另外，通过利用该密码子修饰HRP多核苷酸，使来自木霉的CBHl多肽或His-tag 多肽融合后的HRP多肽也能够在丝状菌中表达。另外，还发现介由与这些HRP融合的多肽 能够简单地分离纯化HRP。此外，还发现介由密码子修饰HRP多核苷酸而被形质转换的丝 状菌所产生的HRP多肽在过氧化氢的存在下，能够将胭脂树红色素脱色，从而完成本发明。 艮P，本发明更详细地提供以下内容。
[0021] (1) 一种多核苷酸，其是在至少一个密码子中具有与编码来自西洋山葵的过氧化 物酶多肽的野生型碱基序列不同的碱基序列且经修饰的多核苷酸，其密码子的使用频率为 下述百分比，其在丝状菌中能够使编码的多肽表达，
[0022] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丙氨酸时，GCC的使用频率为80%，GCT的使用频 率为20!% ;
[0023] 经修饰的密码子编码的氨基酸为精氨酸时，CGC的使用频率为90%，CGT的使用频 率为10% ;
[0024] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬酰胺时，AAC的使用频率为100% ;
[0025] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬氨酸时，GAC的使用频率为95%，GAT的使用 频率为5% ;
[0026] 经修饰的密码子编码的氨基酸为半胱氨酸时，TGC的使用频率为100% ;
[0027] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酰胺时，CAG的使用频率为100% ;
[0028] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酸时，GAG的使用频率为100% ;
[0029] 经修饰的密码子编码的氨基酸为甘氨酸时，GGC的使用频率为75%，GGT的使用频 率为25% ;
[0030] 经修饰的密码子编码的氨基酸为组氨酸时，CAC的使用频率为100% ;
[0031] 经修饰的密码子编码的氨基酸为异亮氨酸时，ATC的使用频率为100% ;
[0032] 经修饰的密码子编码的氨基酸为亮氨酸时，CTC的使用频率为80%，CTG的使用频 率为20!% ;
[0033] 经修饰的密码子编码的氨基酸为赖氨酸时，AAG的使用频率为100% ;
[0034] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苯丙氨酸时，TTC的使用频率为100% ;
[0035] 经修饰的密码子编码的氨基酸为脯氨酸时，CCC的使用频率为80%，CCT的使用频 率为20!% ;
[0036] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丝氨酸时，AGC的使用频率为15%，TCC的使用频 率为85% ;
[0037] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苏氨酸时，ACC的使用频率为85%，ACG的使用频 率为15% ;
[0038] 经修饰的密码子编码的氨基酸为酪氨酸时，TAC的使用频率为100% ;
[0039] 经修饰的密码子编码的氨基酸为缬氨酸时，GTC的使用频率为85%，GTG的使用频 率为5%，GTT的使用频率为10%。
[0040] (2)根据（1)中记载的多核苷酸，其中至少2个密码子被修饰。
[0041] (3)根据⑴或⑵中记载的多核苷酸，其中至少10%的密码子被修饰。
[0042] (4)根据（1)-(3)中任意一项记载的多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物 酶Cla多肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征，
[0043] (i)含有序列编号：1中记载的喊基序列的编码区
[0044] (ii)与序列编号：1中记载的91-1017位组成的碱基序列有95%以上的相同性。
[0045] (5)根据（1)-(3)中任意一项记载的多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物 酶Cla多肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征，
[0046] (i)含有序列编号：26中记载的喊基序列的编码区
[0047] (ii)与序列编号：26中记载的91-1017位组成的碱基序列有95%以上的相同性。
[0048] (6) -种多核苷酸，在（1)-(5)中任意一项记载的多核苷酸中，还附加编码所期望 的多肽的多核苷酸。
[0049] (7) -种表达载体，其含有（1)-(6)中任意一项记载的多核苷酸。
[0050] (8) -种形质转换体，其由将（7)中记载的表达载体导入到丝状菌中而形成。
[0051] (9)根据⑶中记载的形质转换体，其中所述丝状菌为木霉属菌或曲霉属菌。
[0052] (10)根据⑶中记载的形质转换体，其中所述丝状菌为绿色木霉或黑曲霉。
[0053] (11)根据⑶中记载的形质转换体，其中所述丝状菌为绿色木霉。
[0054] (12) -种（1)-(6)中任意一项记载的多核苷酸编码的多肽的制造方法，其包括培 养（8)-(11)中任意一项记载的形质转换体，从培养的形质转换体和/或该形质转换体的培 养物中提取表达的多肽的步骤。
[0055] (13) -种多肽，其以（12)中记载的方法制造。
[0056] (14) -种多肽，其以（12)中记载的方法制造并除去糖链。
[0057] (15) -种制剂，其含有以（12)中记载的方法制造的多肽。
[0058] (16) -种用于检测目标分子的方法，其特征在于：使通过（12)中记载的方法制造 的多肽与所述目标分子结合。
[0059] (17) -种色素的脱色方法，其特征在于：使通过（12)中记载的方法制造的多肽在 过氧化氢的存在下对该色素作用。
[0060] (18) -种酚性化合物的去除方法，其特征在于：使通过（12)中记载的方法制造的 多肽在过氧化氢的存在下对该酚性化合物作用。
[0061] 发明的效果
[0062] 通过本发明，提供含有最适于编码来自西洋山葵的过氧化物酶的丝状菌表达的密 码子的多核苷酸。另外，可使用将所述多核苷酸进行了形质转换的绿色木霉或黑曲霉来制 造来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质。
[0063] 附图简要说明
[0064] [图1]是表示介由含有编码野生型的来自西洋山葵的过氧化物酶（HRP)Cla的多 核苷酸的表达载体（pCBl-HRP_Native)，将丝状菌（木霉）进行形质转换，将所得的形质转 换体的培养上清液通过使用抗HRP抗体的西方墨点法（western blot)进行分析的结果的 照片。图中，1的电泳带表示分子量标记展开的结果，2的电泳带表示形质转换体的培养上 清液展开的结果。
[0065][图2]是表示将野生型HRP多核苷酸与本发明的多核苷酸（密码子修饰HRP多 核苷酸）在碱基序列（1-540位）中比较的结果的图。图中，上方的序列表示野生型HRP多 核苷酸的碱基序列（序列编号：3中记载的碱基序列），下方的序列表示本发明的多核苷酸 (序列编号：1中记载的碱基序列）。
[0066][图3]是表示将野生型HRP多核苷酸与本发明的多核苷酸（密码子修饰HRP多 核苷酸）在碱基序列（541-1014位）中比较的结果的图。图中，上方序列表示野生型HRP 多核苷酸的碱基序列（序列编号：3中记载的碱基序列），下方序列表示本发明的多核苷酸 (序列编号：1中记载的碱基序列）。
[0067][图4]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体（pNCE2-HRP-humic〇la)，将 腐质霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清液通过使用抗His-tag抗体的西方 墨点法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量标记展开的结果，2的电泳带 表示形质转换体的培养上清液展开的结果。
[0068][图5]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体 (pAmyB-pyr-HRP-AspergiIIus)，将曲霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清液 通过使用抗His-tag抗体的西方墨点法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子 量标记展开的结果，2的电泳带表示形质转换体的培养上清液展开的结果。
[0069][图6]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体（pCBl-HRP-tricho)，将木 霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清液通过使用抗His-tag抗体的西方墨点 法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量标记展开的结果，2的电泳带表示 形质转换体培养上清液展开的结果。
[0070] [图7]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho)，将木霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清液 通过使用抗HRP抗体的西方墨点法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量标 记展开的结果，2的电泳带表示形质转换体的培养上清液展开的结果。
[0071] [图8]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体（pCBl-KR-HRP-tricho)，将 木霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清液通过使用抗HRP抗体的西方墨点法 进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量标记展开的结果，2的电泳带表示形 质转换体培养上清液展开的结果。
[0072] [图9]是表示介由含有仅符合木霉密码子使用频率的HRP多核苷酸的表达载体 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho-2)，将木霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清 液通过使用抗HRP抗体的西方墨点法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量 标记展开的结果，2的电泳带表示形质转换体培养上清液展开的结果。
[0073] [图10]是表示将野生型HRP多核苷酸与本发明多核苷酸（密码子修饰HRP多核 苷酸）在碱基序列（1-540位）中比较的结果的图。图中，上方序列表示野生型HRP多核苷 酸的碱基序列（序列编号：3中记载的碱基序列），下方序列表示本发明的多核苷酸（序列 编号：26中记载的碱基序列）。
[0074] [图11]是表示将野生型HRP多核苷酸与本发明多核苷酸（密码子修饰HRP多核 苷酸）在碱基序列（541-1014位）中比较的结果的图。图中，上方序列表示野生型HRP多核 苷酸的碱基序列（序列编号：3中记载的碱基序列），下方序列表示本发明的多核苷酸（序 列编号：26中记载的碱基序列）。
[0075] [图12]是表示将本发明的多核苷酸彼此在碱基序列（1-540位）中进行比较的 结果的图。图中，上方序列表示序列编号：1中记载的碱基序列，下方序列表示序列编号：26 中记载的碱基序列。
[0076][图13]是表示将本发明的多核苷酸彼此在碱基序列（541-1017位）中进行比较 的结果的图。图中，上方序列表示序列编号：1中记载的碱基序列，下方序列表示序列编号： 26中记载的碱基序列。
[0077][图14]是表示介由含有本发明的多核苷酸的表达载体 (pCBl-HRP (Hisless)-tricho-3)，将木霉进行形质转换，将所得的形质转换体的培养上清 液通过使用抗HRP抗体的西方墨点法进行分析的结果的照片。图中，1的电泳带表示分子量 标记展开的结果，2的电泳带表示形质转换体培养上清液展开的结果。
[0078] 发明的实施方式
[0079]〈多核苷酸〉
[0080] 如后述的实施例所示，使用具有编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽（HRP)的野 生型碱基序列的多核苷酸，在丝状菌中，通过西方墨点法分析，虽然不能检测出HRP多肽的 表达，但是使用密码子中具有与所述野生型的碱基序列不同的碱基序列的被修饰的多核苷 酸后，在该丝状菌中，能够检测出HRP多肽的表达。
[0081] 因此，本发明提供下述多核苷酸。
[0082] 其是在至少一个密码子中具有与编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽的野生型 碱基序列不同的碱基序列且被修饰的多核苷酸，其密码子的使用频率为下述百分比，其在 丝状菌中能够使编码的多肽表达，
[0083] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丙氨酸时，GCC的使用频率为80%，GCT的使用频 率为20!% ;
[0084] 经修饰的密码子编码的氨基酸为精氨酸时，CGC的使用频率为90%，CGT的使用频 率为10% ;
[0085] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬酰胺时，AAC的使用频率为100% ;
[0086] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬氨酸时，GAC的使用频率为95%，GAT的使用 频率为5% ;
[0087] 经修饰的密码子编码的氨基酸为半胱氨酸时，TGC的使用频率为100% ;
[0088] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酰胺时，CAG的使用频率为100% ;
[0089] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酸时，GAG的使用频率为100% ;
[0090] 经修饰的密码子编码的氨基酸为甘氨酸时，GGC的使用频率为75%，GGT的使用频 率为25% ;
[0091] 经修饰的密码子编码的氨基酸为组氨酸时，CAC的使用频率为100% ;
[0092] 经修饰的密码子编码的氨基酸为异亮氨酸时，ATC的使用频率为100% ;
[0093] 经修饰的密码子编码的氨基酸为亮氨酸时，CTC的使用频率为80%，CTG的使用频 率为20!% ;
[0094] 经修饰的密码子编码的氨基酸为赖氨酸时，AAG的使用频率为100% ;
[0095] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苯丙氨酸时，TTC的使用频率为100% ;
[0096] 经修饰的密码子编码的氨基酸为脯氨酸时，CCC的使用频率为80%，CCT的使用频 率为20!% ;
[0097] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丝氨酸时，AGC的使用频率为15%，TCC的使用频 率为85% ;
[0098] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苏氨酸时，ACC的使用频率为85%，ACG的使用频 率为15% ;
[0099] 经修饰的密码子编码的氨基酸为酪氨酸时，TAC的使用频率为100% ;
[0100] 经修饰的密码子编码的氨基酸为缬氨酸时，GTC的使用频率为85%，GTG的使用频 率为5%，GTT的使用频率为10%。
[0101] 在本发明中，HRP多肽是指从西洋山葵中提取并具有将过氧化物结构氧化性地切 割并分解成2个羟基的活性的酶，例如，可列举HRP Cla，HRP Clb、HRP Clc、HRP C2、HRP C3 的同工酶，但从由于在来自西洋山葵的过氧化物酶中是含有率最高的同工酶、因此在从西 洋山葵中提取并作为试剂等广泛使用的过氧化物酶混合物的性质方面最强地反映其性质 的观点来看，优选HRP Cla多肽。
[0102] 此外，作为HRP Cla多肽，典型的为序列编号4中记载的氨基酸序列组成的多肽。 另外，在自然界中也会发生氨基酸序列变异。因此，HRP多肽中，只要编码具有所述活性的 蛋白质，在序列编号：4中记载的氨基酸序列中也可包含编码由1个或多个氨基酸经置换、 删除、嵌入、和/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。
[0103] 另外，公知的是在HRP Cla多肽中，由自N末端的蛋氨酸残基开始算起至第30个丙 氨酸残基为止构成的多肽作为HRP的信号肽而起作用。此外，在本发明中，多肽是指2个以 上的氨基酸介由肽键结合的分子。因此，不仅包括全长的蛋白质，还包括所谓寡肽的概念。 多肽中，除了氨基酸序列的变异以外，例如，可进行糖基化、磷酸化、棕榈酰化、异戊二烯化、 甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化、羟基化、酰胺化等修饰。
[0104] 在本发明中，典型地，"编码HRP多肽的野生型碱基序列"是指在序列编号3中记载 的碱基序列。"密码子"是指3个编码氨基酸的核苷酸的碱基的组合。
[0105] 本发明中，作为具有与所述野生型碱基序列不同的碱基序列的至少1个密码子， 优选在丝状菌中使翻译效率提高的密码子。该密码子优选为导入了不伴随氨基酸序列变化 的"退化变异"的密码子。
[0106] 与通过将具有所述野生型碱基序列的多核苷酸导入到丝状菌中所产生的HRP多 肽的量相比，通过将在至少1个密码子中具有与所述野生型碱基序列不同的碱基序列且被 修饰的多核苷酸导入到丝状菌中所产生的HRP多肽的量更多时，可以判定该密码子为"在 丝状菌中使翻译效率提高的密码子"。对于HRP多肽的量的比较，如后述的实施例所示，例 如，可使用西方墨点法、检测四甲基联苯胺引起的显色（测定波长450nm下的吸光度）、测定 愈创木酚氧化活性等公知的方法来进行。
[0107] 此外，经修饰的密码子数优选为至少2个（例如，3个以上、5个以上），更优选为10 个以上（例如，20个以上、30个以上、50个以上），进一步优选为100个以上（例如，120个 以上、150个以上、180个以上），特别优选为200个以上（例如，210个以上、220个以上、230 个以上、240个以上）。此外，在本发明中，在具有所述野生型碱基序列的多核苷酸中的全部 密码子中，被修饰的密码子比例优选为至少10%，更优选为30%以上，特别优选为60%以 上（例如，70%以上、80%以上、90%以上、100%)。另夕卜，在序列编号：1中记载的碱基序列 的编码区中，338个密码子中的246个密码子（72.8%)被修饰（退化变异的导入）。此外， 在序列编号：26中记载的碱基序列的编码区中，338个密码子中的245个密码子（72. 5% ) 被修饰（退化变异的导入）。
[0108] 本发明中，丝状菌是指由菌丝构成的真菌，可列举例如，木霉（Trichoderma)属 菌、曲霉（Aspergillus)属菌、枝顶孢（Acremonium)属菌，镰孢（Fusarium)属菌、自毁丝 霉（Myceliopthora)属菌、链抱霉（Neurospora)属菌、青霉（Penicillium)属菌、毛霉 (Rhizomucor)属菌、嗜热真菌（Thermomyces)属菌、梭孢壳（Thielavia)属菌、多孔木霉 (TolypoCladium)属菌。
[0109] 另外，更具体地，作为木霉属菌，可列举绿色木霉（Trichoderma viride)、哈茨木 霉（Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长枝木霉（Tricoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)。此外，作为曲霉属菌，可列举黑 曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构巢曲霉（Aspergillus nidulans)、米曲 霉（Aspergillus oryzae)。这些中优选木霉属菌及曲霉属菌，更优选绿色木霉及黑曲霉。
[0110] 在本发明中，在该丝状菌中，"能够使编码的多肽表达"是指通过导入至少1个密码 子中具有与编码HRP多肽的野生型碱基序列不同的碱基序列且被修饰的多核苷酸、从而将 丝状菌形质转换，将该丝状菌进行培养，在该形质转换体的浓度稀释为9 X IO8CFUAiL的培 养上清液中产生的HRP的浓度为0. 001mg/L以上，优选为lmg/L以上，更优选为10mg/L以 上，进一步优选为l〇〇mg/L以上，特别优选为300mg/L以上。
[0111] 如后述的实施例所示，考量在腐质霉、曲霉及木霉3种菌中的密码子使用频率，算 出后面示出的表1中记载的密码子使用频率。然后，使野生型HRP多核苷酸密码子的出现 频率符合于所得的密码子使用频率，并将野生型HRP多核苷酸碱基序列（序列编号：3中 记载的碱基序列），改变为序列编号：1中记载的碱基序列或序列编号：26中记载的碱基序 列。然后，使用这样调制的密码子修饰HRP多核苷酸，将丝状菌进行形质转换后，使用野生 型HRP多核苷酸，对于之前不能确认表达的HRP多肽，也能够检测出其表达。
[0112] 因此，本发明的多核苷酸为密码子的使用频率为下述百分比的被修饰的编码HRP 多肽的多核苷酸。
[0113] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丙氨酸时，GCC的使用频率为80%，GCT的使用频 率为20!% ;
[0114] 经修饰的密码子编码的氨基酸为精氨酸时，CGC的使用频率为90%，CGT的使用频 率为10% ;
[0115] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬酰胺时，AAC的使用频率为100% ;
[0116] 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬氨酸时，GAC的使用频率为95%，GAT的使用 频率为5% ;
[0117] 经修饰的密码子编码的氨基酸为半胱氨酸时，TGC的使用频率为100% ;
[0118] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酰胺时，CAG的使用频率为100% ;
[0119] 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酸时，GAG的使用频率为100% ;
[0120] 经修饰的密码子编码的氨基酸为甘氨酸时，GGC的使用频率为75%，GGT的使用频 率为25% ;
[0121] 经修饰的密码子编码的氨基酸为组氨酸时，CAC的使用频率为100% ;
[0122] 经修饰的密码子编码的氨基酸为异亮氨酸时，ATC的使用频率为100% ;
[0123] 经修饰的密码子编码的氨基酸为亮氨酸时，CTC的使用频率为80%，CTG的使用频 率为20!% ;
[0124] 经修饰的密码子编码的氨基酸为赖氨酸时，AAG的使用频率为100% ;
[0125] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苯丙氨酸时，TTC的使用频率为100% ;
[0126] 经修饰的密码子编码的氨基酸为脯氨酸时，CCC的使用频率为80%，CCT的使用频 率为20!% ;
[0127] 经修饰的密码子编码的氨基酸为丝氨酸时，AGC的使用频率为15%，TCC的使用频 率为85% ;
[0128] 经修饰的密码子编码的氨基酸为苏氨酸时，ACC的使用频率为85%，ACG的使用频 率为15% ;
[0129] 经修饰的密码子编码的氨基酸为酪氨酸时，TAC的使用频率为100% ;
[0130] 经修饰的密码子编码的氨基酸为缬氨酸时，GTC的使用频率为85%，GTG的使用频 率为5%，GTT的使用频率为10%。
[0131] 在本发明中，"将野生型HRP的碱基序列修饰成为密码子的使用频率为所述百分 比"不仅是指与所述百分比的值一致，还包括以2. 5%的范围符合于所述百分比的值的意 思。例如，是指在经修饰的密码子编码的氨基酸为丝氨酸时，为了实现AGC的使用频率为 12. 5-17. 5%、TCC的使用频率为82. 5-87. 5%这样的适合，在编码HRP多肽的多核苷酸的碱 基序列中，将编码丝氨酸的密码子的使用频率进行修正。此外，在本发明的多核苷酸中，虽 然使密码子使用频率为所述百分比的氨基酸至少有1种即可，但优选为至少2种（例如，3 种以上、5种以上、7种以上），进一步优选为10种以上（例如，12种以上、15种以上、17种 以上），特别优选为所述全部18种。
[0132] 如前所述，使用具有被修饰成密码子使用频率为所述百分比的碱基序列（序列编 号：1中记载的碱基序列或序列编号：26中记载的碱基序列）的多核苷酸，将丝状菌进行形 质转换后，能够检测出HRP多肽显著地高表达。
[0133] 因此，本发明提供一种多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物酶（HRP)Cla多 肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征，
[0134] (i)含有序列编号：1中记载的喊基序列的编码区
[0135] (ii)与序列编号：1中记载的91-1017位组成的碱基序列具有95%以上的相同 性。
[0136] 此外，本发明提供一种多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物酶（HRP)Cla多 肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征，
[0137] (i)含有序列编号：26中记载的喊基序列的编码区
[0138] (ii)与序列编号：26中记载的91-1017位组成的碱基序列具有95%以上的相同 性。
[0139] 在本发明中，"序列编号：1中记载的91-1017位组成的碱基序列"及"序列编号：26中记载的91-1017位组成的碱基序列"是指，S卩，进行修饰使密码子使用频率为所述百分 t匕，且编码信号序列的碱基序列除外的编码HRP Cla多肽的碱基序列。
[0140] 此外，关于碱基序列的"相同性"是指在被比较的序列间，构成各个序列的碱基的 一致程度。本说明书所示的"相同性"的数值都可以是使用本领域技术人员所公知的相同性 检索程序算出的数值，例如通过使用FASTA，BLAST, Smith-Waterman等默认（default)(初 期设定）的参数，能够轻易地算出。
[0141] 此外，为了 HRP Cla多肽发挥其活性，不需要信号序列，因此作为本发明的多核苷 酸，可从HRP多核苷酸中除去编码信号序列的多核苷酸（相当于序列编号：1中记载的1-90 位的碱基序列）。
[0142] 对于本发明的多核苷酸，只要本领域技术人员通过使用适当的公知的方法就能够 调制。例如，如后述的实施例所示，设计至少1个密码子中与编码HRP多肽的野生型碱基 序列不同的碱基序列，基于此碱基序列信息，使用市售的DNA合成机，能够化学性地合成本 发明的多核苷酸。此外，在野生型HRP多核苷酸中，通过公知的定点诱变（site-directed mutagenesis)法等导入变异（碱基的置换），也能够调制本发明的多核苷酸。
[0143] 如后述的实施例所示，明确地：通过利用所述密码子修饰HRP多核苷酸，也能够使 来自木霉的CBHl (纤维素生物水解酶1)多肽或His-tag多肽融合的HRP多肽在丝状菌中 表达。
[0144] 因此，本发明提供一种多核苷酸，其在所述密码子修饰HRP多核苷酸中进一步附 加编码所期望的多肽的多核苷酸。
[0145] 在本发明中，所期望的多肽没有特别限制，例如，通过附加 HRP多肽作为检测用的 标记，能够容易地检测出该期望的多肽。
[0146] 另一方面，在本发明中，为了纯化HRP多肽，可将所期望的多肽附加于该HRP多 肽。作为用于纯化该HRP多肽的多肽，例如，可列举具有基质吸附能力的多肽，更具体地，可 列举纤维二糖水解酶（CBH)、内切葡聚糖酶、￠-葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、白蛋白、抗体、 Fab抗体、scFV抗体、His-标记、GST标记、MBP标记、TAP标记、FLAG标记、Myc标记、HA标 记、V5标记、17标记。
[0147] 作为所述密码子修饰HRP多核苷酸和编码所期望的多肽的多核苷酸间的附加方 式，通过附加，这些多肽的可读框（Reading Frame)不偏离，并翻译成连续的融合多肽即可， 也可在密码子修饰HRP多核苷酸的5'侧及3'侧的其中一侧或两侧附加编码所期望的多肽 的多核苷酸。此外，该附加可是直接的也可是间接的。作为间接性的附加，例如，可列举在 所述密码子修饰HRP多核苷酸与编码所期望的多肽的多核苷酸之间嵌入编码连接多肽的 多核苷酸的方式。作为该连接多肽的长度，通常为1-100个氨基酸，优选为1-50个氨基酸， 更优选为1-30个氨基酸，特别优选为12-18个氨基酸（例如15个氨基酸）。
[0148] 〈表达载体，形质转换体〉
[0149] 本发明提供一种含有所述本发明的多核苷酸的表达载体。作为本发明的表达载 体，作为自我复制载体，即，染色体外的独立体而存在，其复制并不依赖于染色体的复制，例 如，能够构筑基本的质粒。此外，本表达载体被导入到作为宿主的丝状菌时，会被镶嵌到该 丝状菌的基因组中，其可与被镶嵌的染色体一起复制。
[0150] 本发明的表达载体，为了导入到丝状菌中并使HRP等表达，除了所述本发明的多 核苷酸以外，也可含有控制其表达的多核苷酸或用于选择形质转换体的基因标记等。
[0151] 作为控制该表达的多核苷酸，可列举启动子、引导序列及终止子等。启动子只要 在丝状菌中显示出转录活性即可，而不特别限定，能够得到控制编码与作为宿主的丝状菌 同种或异种或同属或异属的任意多肽的基因的表达的多核苷酸。作为该启动子，可列举例 如，a -淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因、纤维素生物水解酶基因、甘油醛-3-磷酸去氢酶基 因的启动子。终止子只要是用于结束转录的可被丝状菌所辨识的序列即可，例如可列举， TAKA淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、纤维素生物水解酶基因、邻氨基苯甲酸合成酶、a-葡萄糖苷 酶、trpC基因、胰蛋白酶样蛋白酶基因的终止子。引导序列只要为能够将丝状菌的翻译效 率提高的mRNA的非翻译区域即可，例如可列举，TAKA淀粉酶、磷酸丙糖异构酶、glaA基因的 引导序列。
[0152] 此外，作为用于选择形质转换体的基因标记，可根据形质转换体的选择方法来适 当地选择，例如，可利用编码抗药性的基因、补足营养要求性的基因，例如，可列举尿嘧啶生 物合成基因（pyr4)、硝酸盐同化基因（niaD)、精氨酸生物合成基因（argB)、乙酰胺酶基因 (amdS)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因（argB)、草胺膦（phosphinothricin)乙酰转移酶基因 (bar)、腐草霉素结合性基因（WeA)、潮霉素磷酸转移酶基因（hygB)、乳清苷_5'_磷酸脱羧 酶基因（pyrG)、硫酸腺苷酰转移酶基因（sC)、邻氨基苯甲酸合成酶基因（trpC)、越霉素抗 性基因、潮霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因、博来霉素抗性基因、短梗霉素抗性基因。
[0153] 本领域技术人员可以通过利用公知的基因重组技术等，适当地进行该载体的设计 及调制。
[0154] 此外，通过导入这种本发明的载体，能够在丝状菌中产生HRP多肽等。因此，本发 明提供一种将所述表达载体导入到丝状菌而形成的形质转换体。
[0155] 作为该丝状菌，虽如前所述，但从HRP多肽等的产生量更多的观点来看，优选木霉 属菌（特别是绿色木霉）、曲霉属菌（特别是黑曲霉），更优选木霉属菌，特别优选绿色木 霉。
[0156] 作为导入本发明的载体的方法不特别限定，可使用公知的方法进行。作为该公知 的方法，例如，可列举原生质体法、氯化钙法、电穿孔法、形质转换受容法、热休克法、原生质 球法、乙酸锂法。此外，如后述的实施例所示，也可用将含有本发明多核苷酸的表达载体及 含有所述基因标记的载体同时导入的所谓的共转型法。
[0157] 〈HRP多肽等的制造方法、HRP多肽等、含有HRP多肽等的制剂〉
[0158] 在本发明中，将所述形质转换体进行培养，通过从培养的形质转换体和/或该形 质转换体的培养物中提取表达的HRP多肽等，能够制造编码本发明的多核苷酸的多肽。通 过按照通常的方法，适当地选择培养基、培养条件等能够进行本发明的形质转换体培养。
[0159] 本发明中"培养物"是指含有通过将所述形质转换体在对丝状菌适当的培养基中 进行培养所得到的增殖的形质转换体、该形质转换体的分泌物及该形质转换体的代谢产物 等的培养基，包括它们的稀释物、浓缩物。
[0160] 作为该培养基，含有丝状菌能够同化的物质即可，例如，作为含有物可列举碳源、 氮源、硫源、无机盐类、金属、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、血清等。此外， 在该培养基中，例如，也可以添加对应于本发明的表达载体所编码的抗药性基因的抗生素 或对应于补足本发明的表达载体所编码的营养要求性的基因的营养物。
[0161] 作为本发明中该培养的条件，只要是本发明的形质转换体能够在所述培养基中分 泌产生HRP多肽等的条件即可，本领域技术人员可配合丝状菌种类、使用的培养基等适当 地调整温度、有无空气的添加、氧气的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养 时间、湿度等来进行设定。
[0162] 此外，作为提取由培养的形质转换体所表达的HRP多肽等方法，例如，可列举回收 形质转换体（过滤，离心分离等），从回收的形质转换体提取（磨碎处理，加压破碎等），进 一步纯化（盐析法、溶剂沉淀法等）的方法。
[0163] 另外，作为提取由形质转换体所表达的HRP多肽的方法，例如，可列举用培养物过 滤器（例如，孔径0.2 以下的过滤器）除去丝状菌的方法或萃取过滤、离心分离、透析、 浓缩、干燥、冷冻、吸附，脱附、利用对各种溶液的溶解度的差的方法（例如，沉淀、盐析、结 晶化、重结晶、溶解转移、色谱法）等公知的方法。此外，也可单独使用该方法或者也可以任 意顺序组合或反复使用。
[0164] 此外，当本发明的多核苷酸所编码的多肽含有用于纯化所述的HRP的标记时，能 够使用吸附该标记的基质进行纯化。
[0165] 以该制造方法能够得到HRP多肽、不含信号序列的HRP多肽、或在这些HRP多肽上 附加了所期望的多肽的多肽。因此，本发明提供这些HRP多肽等。
[0166] 此外，在从西洋山葵中提取的HRP Cla多肽中，由于糖链被附加约IOkDa左右，在 用SDS-PAGE等进行的分析中，作为约40kDa的分子量的多肽被检测出。另一方面，如后述 的实施例所示，通过本发明的制造方法所得的HRP Cla多肽，在用SDS-PAGE等进行的分析 中，作为约32kDa的分子量的多肽被检测出。另外，虽然没在后述的实施例中示出，但是明 确地：从西洋山葵中所提取的HRP Cla多肽虽然不能用糖苷酶F切断糖链，但是本
【发明者】发 现以本发明的制造方法所得的HRP Cla多肽的糖链可被该酶切断，由此发现，虽然从西洋山 葵中提取的HRP Cla多肽的糖链中附加 a 1，3-键核岩藻糖残基，但通过本发明的制造方法 所得的HRP Cla多肽的糖链中并没有附加 a 1，3-键核岩藻糖残基。
[0167] 因此，通过本发明的制造方法所得的HRP多肽等，由于实施了与在西洋山葵中所 产生的HRP多肽不同的糖链修饰，因此作为本发明的多肽，可以是以本发明的制造方法制 造的去除糖链的多肽。可使用将糖链分解去除的酶来进行糖链的去除。作为该酶，例如，可 列举糖苷酶F (糖肽酶F)、内切糖苷酶H。
[0168] 另外，本发明还提供一种含有以所述制造方法制造的HRP多肽等的制剂。作为本 发明的制剂，只要含有以所述制造方法制造的HRP多肽等即可，但除了本发明的HRP多肽等 以外，也可含有被允许作为HRP多肽等的制剂的其他成分。作为这种其他成分，例如，可列 举载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐。作为 赋形剂可以使用乳糖、淀粉、山梨醇、D-甘露醇，白糖等。作为崩解剂可以使用淀粉、羧甲基 纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂可以使用磷酸盐、柠檬酸盐，乙酸盐等。作为乳化剂可以使 用阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基 纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。作为稳定剂可以使用丙二醇、二 亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为保存剂可以使用酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、尼泊金 甲酯等。作为防腐剂可以使用叠氮化钠、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0169] 〈HRP多肽等的使用方法〉
[0170] 已知的是通过使HRP多肽作为催化剂起作用，鲁米诺或TMB(四甲基联苯胺）等发 光、显色基质被氧化，产生化学发光或显色。此外，通过使HRP多肽与目标分子结合，以所述 化学发光等作为指标能够检测出该目标分子。因此，本发明提供一种方法，其是用于检测出 目标分子的方法，其特征在于：使通过本发明的制造方法所制造的多肽（本发明的多肽）结 合于所述目标分子。
[0171] 作为通过本发明的方法检测出的目标分子无特别限制，例如，可列举多肽、核酸、 糖、脂质。
[0172] 在用于检测本发明的目标分子的方法中，为了使本发明的多肽与目标分子结合， 在本发明的多肽中，优选附加与该目标分子特异性结合的分子（例如抗体）。此外，也适当 地使用附加与该分子特异性结合的分子（该分子为抗体时，为识别该抗体的所谓的2次抗 体、蛋白A、蛋白G等）的本发明的多肽。
[0173] 作为该附加无特别限制，可以是在基因水平的附加，也可以是化学性的附加。如前 所述，基因水平的附加，可通过作为本发明的多核苷酸使用附加编码所述抗体等的多核苷 酸的密码子修饰HRP多核苷酸来实现。此外，化学性的附加可以是共价键，也可以是非共价 键。作为"共价键"无特别限制，例如，可列举氨基与羧基的酰胺键、氨基与烷基卤基的烷氨 基键、硫醇彼此之间的-硫键、硫醇基与顺丁稀-醜亚胺基或烧基齒基的硫醋键。作为"非 共价键"，例如，可列举生物素-卵白素间的键。
[0174] 作为用于检测本发明的目标分子的方法所使用的发光、显色基质，例如，可列举鲁 米诺、TMB、连苯三酚、愈创木酚、联茴香胺。
[0175] 此外，如后述的实施例所示，用本发明的多肽能够在过氧化氢的存在下使胭脂素 等色素脱色。因此，本发明提供一种方法，其是色素的脱色方法，其特征在于：使通过本发明 的方法制造的多肽在过氧化氢存在下对该色素进行作用。
[0176] 作为通过本发明的方法而脱色的色素，可列举例如，胭脂树红、橙黄II、茜素红S、 金莲橙〇、查尔酮。此外，对于在该色素脱色中的反应条件，即，过氧化氢的浓度、温度、使 HRP多肽与色素混合的体系（例如，缓冲液）的种类及pH等，本领域技术人员能够配合需脱 色的色素种类等适当地进行设定。
[0177] 另外，通过以HRP多肽作为催化剂而起作用，在酚性化合物中的酚部分被氧化成 苯氧基自由基，且通过该苯氧基自由基自身聚合形成水不溶性的多聚体。然后，已知的是该 多聚体作为沉淀物能够容易地除去。
[0178] 因此，本发明还提供一种方法，其是酚性化合物的去除方法，其特征在于使通过本 发明方法制造的多肽在过氧化氢存在下对该酚性化合物进行作用。
[0179] 作为通过本发明的方法除去的酚性化合物，如前所述，只要是具有被过氧化物酶 氧化的酚部分的化合物即可，不特别限制，例如，可列举对甲酚、对乙基苯酚、对正丙基苯 酚。此外，在该酚性化合物的去除中的反应条件，即，过氧化氢的浓度、温度、使HRP多肽与 酚性化合物混合的体系（例如，缓冲液）的种类及pH等，本领域技术人员能够配合酚性化 合物的种类适当地进行设定。
[实施例]
[0180] 以下，基于实施例及比较例对本发明进行更具体的说明，但本发明不限定于下述 的实施例。
[0181] (比较例1)
[0182] 野生型来自西洋山葵的过氧化物酶（HRP)在丝状菌中的表达研究
[0183] 首先，在下述方法中，使用编码野生型HRP多肽的野生型碱基序列，将丝状菌（绿 色木霉）进行形质转换，研究在所得的形质转换体中HRP多肽的表达。
[0184] (1)野生型HRP Cla基因的制作
[0185] 作为野生型HRP Cla基因的序列，使用"Eur. J. Biochem.，1988年，173卷，3号， 681-687页"中记载的碱基序列（序列编号：3中记载的碱基序列），并人工合成野生型HRP 基因。人工合成时，在起始密码子的上游的序列中附加限制酶StuI识别位点，在终止密码 子的下游中附加限制酶XhoI识别位点。然后，通过将合成所得的野生型HRP基因嵌入到用 限制酶SfiI处理的pMA-T中，得到质粒"pHRP_Native"。
[0186] (2)野生型HRP表达质粒"pCBl_HRP_Native"的构筑
[0187] 用StuI及XhoI将质粒"pHRP_Native"切断，得到约Ikbp的基因片段"HRP_ Native"。另一方面，用StuI及XhoI将质粒"pCBl_Eg3X_hphless"（参照国际公开第 2011/021616 号）切断，回收约 6kbp 的片段。使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix (宝酒造公司制）将"HRP_Native "连结于其上，制作质粒"pCBI_HRP_Native "。关于 酶等反应条件，依据试剂盒中所附的说明书的条件。使用Big Dye Terminator v3.1循环 测序试剂盒（Cycle Sequencing Kit)(应用生物系统公司制）与ABI PRISM基因组分析 仪（Genetic Analyzer)(应用生物系统公司制），按照附加的方案（protocol)决定在质粒 "pCBl-HRP_NatiVe"中克隆的嵌入DNA片段的序列。以在宿主绿色木霉内使用自身的起始 密码子表达HRP多肽的方式构筑质粒"pCBl-HRP_Native"。
[0188] (3)介由质粒"pCBl_HRP_Native"进行的绿色木霉的形质转换体的制作
[0189] 根据国际公开第2005/056787号记载的方法实施介由质粒"pCBl-HRP_NatiVe"的 绿色木霉的形质转换。以2株作为尿嘧啶生物合成基因（pyr4)缺失菌株的绿色木霉菌株作 为宿主，通过使用粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)的pyr4基因作为选择标记的共转型法 实施形质转换。将2株绿色木霉菌株在50mL的菌体形成培养基（1 %酵母提取物，1 %麦芽 提取物，2 %聚蛋白胨，2. 5 %葡萄糖，0. 1 %磷酸氢二钾，0. 05 %七水合硫酸镁，0. 0001 %尿 苷（pH7. 0))中，在28°C下培养24小时，以3000rpm离心分离10分钟，收集菌。用0. 5mol/ L的蔗糖洗净所得到的菌体，悬浮于经棉过滤的原生质体化酶溶液中（lmg/mL P -葡萄糖苷 酸酶，0. 3mg/mL几丁质酶，0. 3mg/mL酵母裂解酶，0. 5mol/L鹿糖）。在30°C振荡60分钟，使 菌丝进行原生质体化。将该悬浮液过滤后，以2500rpm离心分离10分钟，回收原生质体，并 用 SUTC 缓冲液（0.5mol/L 鹿糖，10 mmol/L 氯化Hl0mmol/L Tris-盐酸（pH7.5))洗净。
[0190] 将该原生质体悬浮于100 U L的SUTC缓冲液中，向其中添加7 ii L加入了 7 ii g份量 的质粒、〇81-111^_似丨1仰"的0嫩溶液与3111加入了？74基因的0嫩溶液，在冰中静置5 分钟。接着加入 400 ii L 的 PEG 溶液（60% PEG4000, lOmmol/L 氯化钙，lOmmol/L Tris-盐 酸（pH7. 5))，在冰中静置20分钟后，添加 IOmL的SUTC缓冲液，以2500rpm离心分离10分 钟。使收集的原生质体悬浮于ImL的SUTC缓冲液中，在每200 ii L中含有0. 5mol/L蔗糖的 基本培养基中与软琼脂重叠，在28°C下培养5天后，将繁殖的菌落再次移植到基本培养基 中，将在此形成的菌落作为形质转换体。
[0191] (4) "pCBl-HRP_Native"的形质转换体的培养及鉴定
[0192] 导入质粒"pCBl-HRP_Native"，选择在基本培养基中繁殖的菌株，根据国际公开第 98/11239号记载的方法，在P培养基（1. 0%葡萄糖，4. 0%乳糖，2. 0%大豆柏，1. 0%酵母提 取物，0. 5 %磷酸钾，0. 2 %硫酸铵，0. 2 %碳酸钙，0. 03 %硫酸镁）中，使用烧瓶，在28 °C下培 养。然后，为了确认HRP是否表达，使用12% gel SDS-PAGE mini (TEF⑶公司制）将所得 的培养上清液进行电泳分离，在PVDF膜（Millipore公司制）上进行点墨。对于点墨后的 PVDF膜，进行使用了抗HRP抗体（JIRL公司制，制品编号：123-055-021)的西方墨点法。图 1示出得到的结果。
[0193] 由图1所示的结果明显可知：在介由pCBl_HRP_Native的形质转换体的培养上清 液中，通过使用了抗HRP抗体的西方墨点法不能检测出来自HRP的电泳带。因此，明确了： 使用没有与编码HRP多肽的野生型碱基序列有任何差异的碱基序列的多核苷酸，即使将丝 状菌进行形质转换，也不能由该形质转换体产生HRP。
[0194] (实施例1)
[0195] 考量腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌密码子使用频率并用被修饰的HRP多核苷酸 进行的在腐质霉中HRP多肽的表达的研究
[0196] 根据所述结果，在丝状菌中为了使HRP多肽高表达，考量腐质霉、曲霉及木霉3种 丝状菌的密码子使用频率，为了提高在全部这3种中的翻译效率，而制作具有与野生型HRP 基因的碱基序列不同的碱基序列的被修饰的多核苷酸。然后，首先，使用该多核苷酸，将腐 质霉（特异腐质霉）进行形质转换，研究在所得的形质转换体中HRP多肽的表达。以下示 出这种方法及得到的结果。
[0197] (1)用于最适于腐质霉、曲霉、木霉全部3种的表达的密码子表的制作
[0198] 考虑到能够在腐质霉、曲霉、木霉中确认表达的多肽的密码子使用频率，为了提高 在全部3种中的翻译效率，作成表1中记载的密码子使用频率表。具体地，在所述3种菌中， 将即使在1种菌中使用频率也极低（使用频率不足5%)的密码子使用频率设定为"0%"。 此外，在全部所述3种菌中，对于使用频率为5%以上的密码子，通过算出3种或2种菌的 使用频率的平均值，进一步将该平均值改变为5的倍数，作成表1中记载的密码子使用频率 表。
[0199] [表 1]
[0200]

【权利要求】
1. 一种多核苷酸，其是在至少一个密码子中具有与编码来自西洋山葵的过氧化物酶多 肽的野生型碱基序列不同的碱基序列且被修饰的多核苷酸，其密码子的使用频率为下述百 分比，其在丝状菌中能够使编码的多肽表达， 经修饰的密码子编码的氨基酸为丙氨酸时，GCC的使用频率为80%，GCT的使用频率为 20% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为精氨酸时，CGC的使用频率为90%，CGT的使用频率为 10% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬酰胺时，AAC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为天冬氨酸时，GAC的使用频率为95 %，GAT的使用频率 为5% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为半胱氨酸时，TGC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酰胺时，CAG的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为谷氨酸时，GAG的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为甘氨酸时，GGC的使用频率为75%，GGT的使用频率为 25% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为组氨酸时，CAC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为异亮氨酸时，ATC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为亮氨酸时，CTC的使用频率为80 %，CTG的使用频率为 20% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为赖氨酸时，AAG的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为苯丙氨酸时，TTC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为脯氨酸时，CCC的使用频率为80%，CCT的使用频率为 20% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为丝氨酸时，AGC的使用频率为15%，TCC的使用频率为 85% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为苏氨酸时，ACC的使用频率为85 %，ACG的使用频率为 15% ； 经修饰的密码子编码的氨基酸为酪氨酸时，TAC的使用频率为100% ; 经修饰的密码子编码的氨基酸为缬氨酸时，GTC的使用频率为85%，GTG的使用频率为 5%，GTT的使用频率为10%。
2. 权利要求1所述的多核苷酸，其中至少2个密码子被修饰。
3. 权利要求1或2所述的多核苷酸，其中至少10%的密码子被修饰。
4. 权利要求1-3项中任意一项所述的多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物酶 Cla多肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征， (i) 含有序列编号：1中记载的喊基序列的编码区 (ii) 与序列编号：1中记载的91-1017位组成的碱基序列有95%以上的相同性。
5. 权利要求1-3项中任意一项所述的多核苷酸，其编码来自西洋山葵的过氧化物酶 Cla多肽且具有选自下述（i)-(ii)中的至少1个特征， (i)含有序列编号：26中记载的碱基序列的编码区 (ii)与序列编号：26中记载的91-1017位组成的碱基序列有95%以上的相同性。
6. -种多核苷酸，其在权利要求1-5中任意一项所述的多核苷酸中进一步附加编码所 期望的多肽的多核苷酸。
7. -种表达载体，其含有权利要求1-6中任意一项所述的多核苷酸。
8. 形质转换体，其通过将权利要求7所述的表达载体导入到丝状菌中而形成。
9. 权利要求8所述的形质转换体，其中所述丝状菌为木霉属菌或曲霉属菌。
10. 权利要求8所述的形质转换体，其中所述丝状菌为绿色木霉或黑曲霉。
11. 权利要求8所述的形质转换体，其中所述丝状菌为绿色木霉。
12. -种多肽的制造方法，该多肽由权利要求1-6中任意一项所述的多核苷酸编码，该 制造方法包括培养权利要求8-11中任意一项所述的形质转换体，从培养的形质转换体和/ 或该形质转换体的培养物中提取表达的多肽的步骤。
13. 根据权利要求12的方法制造的多肽。
14. 根据权利要求12的方法制造的、糖链被去除的多肽。
15. -种制剂，其含有根据权利要求12的方法制造的多肽。
16. -种用于检测目标分子的方法，其特征在于使根据权利要求12所述的方法制造的 多肽结合于所述目标分子。
17. -种色素的脱色方法，其特征在于使根据权利要求12所述的方法制造的多肽在过 氧化氢存在下对该色素作用。
18. -种是酚性化合物的去除方法，其特征在于使根据权利要求12所述的方法制造的 多肽在过氧化氢存在下对该酚性化合物作用。
【文档编号】C12N1/15GK104334723SQ201380029041
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】横山史和, 冈仓薰, 井上敦, 村岛弘一郎, 永里敏秋, 矢内耕二, 中根公隆 申请人:明治制果药业株式会社