玉米cbl9基因cds序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及玉米CBL9基因CDS序列的应用。本发明首次提出玉米CBL9基因CDS序列的功能，将玉米CBL9基因CDS序列克隆至植物表达载体中，并将该载体转入植物体内，获得的转基因植株耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫。ZmCBL9蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐及渗透胁迫过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
【专利说明】玉米CBL9基因CDS序列的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因植物领域，具体地说，涉及玉米CBL9基因⑶S序列的应用。
【背景技术】
[0002]自然界中，植物不同于动物无法逃避逆境只能应对逆境。因此，植物演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生理水平上响应的精细调控机制。众多研究表明，各种胁迫环境下均会引发植物细胞中Ca2+浓度的变化。Ca2+浓度在时空上的变化代表了某种特殊的胁迫信号，称之为钙信号；这其中钙离子感受器则起了至关重要的作用，钙离子感受器可以坚持钙信号，并通过与其互作的蛋白来传导信号，调控下游基因的表达。
[0003]在植物中Ca2+-Ca2+感受器-作用蛋白-靶基因是关键的调控途径。而众多研究表明，Ca2+感受器可分为响应型感受器(sensor responders)和依赖型感受器(sensorrelays)。前者既能结合Ca2+，又具有蛋白激酶活性，一旦结合Ca2+即刻改变构象，通过调控自身分子内作用，就可实现其功能或作用。目前，在植物中研究得比较深入的响应型感受器有钙依赖型蛋白激酶(CDPK)家族。而依赖型感受器本身不具有酶活性，结合Ca2+后必须与其相互作用的蛋白激酶发生分子间作用，才能实现其功能。植物中有两类，一种是钙调素(CaM);钙调素及钙调素相关蛋白是研究最广泛的一类Ca2+结合蛋白，它含有4个能够直接结合Ca2+的典型的EF-hand结构域，其自身并没有酶活性，只有结合钙离子活化后才能进一步作用于它的目标蛋白，并实现信号的传递。钙调素作用的目标蛋白包括蛋白激酶、转运子、结构蛋白等。另一种是近年来发现为植物所特有的钙调磷酸酶B类似蛋白(CBL)。它和CaM 一样，只含有Ca2+的结合域，不含有激酶区。CBL与CaM不同的是，它调控的是一类特殊的蛋白激酶，称为 CBL 互作蛋白激酶(CBL-1nteracting protein kinases, CIPKs)。CIPK在N端含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，并通过其特有的C末端区域(C-terminal reg1n)与CBL互作。通过对已知的基因组数据(包括EST)的扫描分析发现，CBL和CIPK只存在于植物中，说明他们可能是植物所特有的一类基因家族，可能出现于植物的早期进化中。
[0004]研究表明，在许多植物中均已找到CBLs基因家族的存在；其中，在拟南芥、水稻、玉米和杨树中发现10个CBLs，在高粱和葡萄中分别发现6个和8个CBLs基因。近年来对CBL基因家族的研究主要集中在模式植物拟南芥中，并且已报道的CBL基因大多参与了拟南芥对逆境胁迫的响应。AtCBL4/S0S3是最早报道的在拟南芥应对盐胁迫时起重要功能的基因，该基因主要在根中表达并与AtCIPK24/S0S2互作，后者可以磷酸化NHX7/S0S1将Na+运出细胞，减少体内Na+含量；AtCBL10/SCaBP8主要在茎和叶片中表达，参与了对Na+区隔化，降低高盐对植物的损害；AtCBLl和AtCBL9通过参与不同的信号通路，对植株响应逆境尤其是在对K+和N03_的吸收过程中起着重要的作用。AtCBL2和AtCBL3可被光照诱导，并在维持细胞内离子平衡中起着重要的作用。此外，AtCBL5在应对高盐及渗透胁迫中也起着重要的作用。而AtCBL6、AtCBL7和AtCBL8的功能则未有报道。对于玉米CBLs基因的研究仅发现ZmCBL4在应对高盐胁迫中起着重要的作用。
[0005]因此，目前对于植物CBL基因的研究方兴未艾，仅有的一些研究结果只是对该领域的初步探索，这方面的研究工作基本上是在模式植物拟南芥上进行的。对于重要作物(如水稻、玉米、小麦等)的此类基因的研究还鲜有报道，特别是有关玉米CBL基因的功能研究尚未见应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供玉米CBL9基因CDS序列的应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明提供玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫的能力中的应用。
[0008]优选地，所述植物为拟南芥等。
[0009]本发明中涉及的玉米钙调磷酸酶B类似蛋白9 (ZmCBL9)的氨基酸序列如Seq IDN0.2所示。ZmCBL9基因CDS序列为:
[0010]i)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0011]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
[0012]iii)在严格条件下与Seq ID N0.1所示序列杂交的核苷酸序列；
[0013]所述严格条件为在含0.1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0014]本发明还提供含有ZmCBL9基因⑶S序列的载体，出发载体优选为植物双元表达载体 ρ3301ο
[0015]本发明还提供含有上述的载体的工程菌、转基因细胞系。
[0016]本发明还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将上述含有ZmCBL9基因CDS序列的载体转入植物体内，筛选转基因植株。
[0017]本发明还提供一种能够高效表达ZmCBL9的转基因植株，该植株表现为对盐胁迫的抗性。
[0018]所述转基因植株的构建方法如下:
[0019]1、依据目的基因的序列，设计引物，从玉米cDNA扩增ZmCBL9基因⑶S序列，与pGEM-Τ载体连接，经过测序确定所获得的序列与目的片段一致，所得载体命名为pGEM-ZmCBL9。
[0020]2、将pGEM_ZmCBL9载体及植物表达载体p3301，分别用Nco I和BstE II进行酶切，然后使用T4DNA连接酶，将ZmCBL9片段与p3301的载体片段连接，然后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，将单克隆送测序，测序正确的克隆进行扩繁，提质粒,命名为 p3301-ZmCBL9。
[0021]3、用 p3301-ZmCBL9 转化农杆菌 GV3101 菌株。
[0022]4、转化拟南芥，获得纯合的转化阳性苗株系。
[0023]5、将转基因株系分别在MS、0.7μΜ ΑΒΑ、4%葡萄糖、150mM NaCl和325mM甘露醇的MS固体培养基上培养，获得耐盐、耐渗透、耐葡萄糖和ABA的转基因材料。
[0024]本发明进一步提供用于扩增玉米CBL9基因⑶S序列的引物对，包括正向引物F5’ -ATGGGGTGCTTCCAT-3’ 和反向引物 R5’ -TCACGTGACGAGATC-3’。
[0025]本发明首次提出玉米CBL9基因⑶S序列的功能，将玉米CBL9基因⑶S序列克隆至植物表达载体中，并将该载体转入植物体内，获得的转基因植株耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫。ZmCBL9蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐及渗透胁迫过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明中涉及的植物双元表达载体p3301的质粒图谱。
[0027]图2为本发明实施例3中ZmCBL9转基因株系目的基因的PCR检测结果其中，M:Marker ；1:正对照(以ZmCBL9超表达载体为PCR模板)；2_11:ZmCBL9不同转基因株系目的基因扩增结果；WT:负对照(以野生型拟南芥Col的DNA为PCR模板)。
[0028]图3为本发明实施例4中转基因拟南芥与野生型植株在含有不同胁迫条件的培养基上生长情况比较；其中，转35S::ZmCBL9基因拟南芥种子点播在不同胁迫处理条件的MS培养基上，4°C春化3天后，置于22°C培养，10天后观察生长状况转基因株系在不同处理条件平板上的生长情况，转基因株系L2、L6和LlO长势明显优于野生型WT。
[0029]图4为本发明实施例5中转35S::ZmCBL9拟南芥能够互补拟南芥cbl9突变体在不同胁迫条件下的敏感表型；其中，转35S::ZmCBL9基因拟南芥种子点播在不同胁迫处理条件的MS培养基上，4°C春化3天后，置于22°C培养，10天后观察生长状况互补株系及突变体在不同处理条件平板上的生长情况，互补株系(COM)长势明显优于cbl9突变体。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。[0031 ] 实施例1含有玉米CBL9基因⑶S序列的表达载体的构建
[0032]1、依据已知目的基因的序列(GenBank:ΝΜ_001157847.1)，设计引物(正、反向引物序列分别如Seq ID N0.3和4所示)，从玉米cDNA扩增ZmCBL9基因⑶S序列，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。
[0033]2、将回收的片段与pGEM-T载体连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性单克隆，送测序，经过序列比对，获得与原序列一致的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，将其命名为 pGHM-ZmCBL9。
[0034]3、将pGEM-ZmCBL9和p3301质粒分别用Nco I和BstE II进行酶切，并通过T4DNA连接酶连接。然后转化DH5a感受态细胞，将获得的阳性单克隆送测序，经过序列比对正确无误后，提质粒，将其命名为p3301-ZmCBL9。
[0035]植物双元表达载体p3301的质粒图谱如图1所示。
[0036]实施例2含有玉米CBL9基因⑶S序列的转基因植株的获得
[0037]1、将构建好的超表达载体p3301_ZmCBL9转入农杆菌GV3101。
[0038]2、用沾花浸染(floral dipping)的方法转化野生型拟南芥。
[0039]3、将转化后得到的T1代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长约两周后，用0.5%。的PPT(phosphinothricin)喷洒T1代拟南芥筛选转化植株(即转35S::ZmCBL9 基因植株)。
[0040]4、由于植物表达载体p3301中带有抗PPT(phosphinothricin)的Basta基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，因此在喷施PPT (phosphinothricin)后大部分未转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。转化植株按照不同株系分别收获T2代种子。
[0041]5、收获各转基因株系T2代种子后，用0.5%的NaClO对种子进行消毒处理。然后点种于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中(每个转基因株系需要约50粒种子)，以野生型为负对照。
[0042]6、春化3天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在含0.5 %。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基中无法存活；T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无PPT(phosphinothricin)抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含PPT (phosphinothricin)抗性的MS培养基中存活。
[0043]实施例3含有玉米CBL9基因⑶S序列的转基因植株的PCR鉴定
[0044]1、以提取的阳性植株的总DNA为模板，用ZmCBL9基因⑶S序列引物(Seq IDN0.3-4)进行PCR扩增，阳性植株能够扩增出642bp的条带，而野生型植株不能扩增出目的条带(图2)。
[0045]2、收获各转基因株系T2代种子后，用0.5%的NaClO对种子进行消毒处理。然后点种于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中(每个转基因株系需要约50粒种子)，以野生型为负对照。
[0046]3、春化3天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在含0.5%。的PPT(phosph inothricin)的MS培养基中无法存活。
[0047]4、T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无PPT (phosphinothricin)抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含PPT (phosphinothricin)的MS培养基中存活。
[0048]实施例4含有玉米CBL9基因⑶S序列的转基因植株与野生型植株抗逆性的比较
[0049]将35S::ZmCBL9 转基因株系点种在 MS、0.7μΜ ΑΒΑ、4 % 葡萄糖、150mM NaCl 和325mM甘露醇的MS平板上，4°C春化3天，置于22°C，16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，5天后观察表型并进行分析。从图3结果可以看出，野生型在胁迫下子叶发育迟缓且绿苗率降低，而转基因株系的长势则明显优于野生型植株。此外两者在正常MS培养基中表型无明显差别。
[0050]实施例5玉米CBL9基因转化拟南芥cbl9突变体后能恢复其对不同胁迫处理下的敏感表型
[0051]1、将p3301-ZmCBL9超表达载体转入农杆菌GV3101，用沾花浸染(floraldipping)的方法转化拟南芥cbl9突变体。
[0052]2、将转化后得到的T1代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长约两周后，用0.5%。的PPT (phosphinothricin)喷洒Tl代拟南芥筛选转化植株。能够存活的植株即为T1代植株。
[0053]3、按照不同株系分别收获种子。用PPT筛选，统计存活株数，取符合3:1分离的株系，即为单拷贝的T2代植株。
[0054]4、将T2代存活的植株移至小花盆繁种，收获得到T3代种子，将其继续在含有PPT的MS培养基上筛选，获得能够完全存活的纯合体株系，收获其种子则为转基因互补株系(COM)。
[0055]5、将转35S::ZmCBL9基因互补株系及突变体株系点播在MS、0.7 μ M ΑΒΑ、4%葡萄糖、150mM NaCl和325mM甘露醇的MS平板上，4°C春化3天，置于22°C，16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，4天后观察表型并进行统计分析。从图4结果可以看出，突变体在不同胁迫处理下子叶发育迟缓甚至难以出苗，相对突变体株系而言，野生型表现稍好而互补株系则表现与野生型相当甚至优于野生型的表现。
[0056]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫的能力中的应用； 其中，所述玉米CBL9基因⑶S序列为: i)SeqID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或 iii)在严格条件下与SeqID N0.1所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含0.1% SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
3.含有权利要求1所述玉米CBL9基因CDS序列的载体，其特征在于，出发载体为植物双元表达载体P3301。
4.含有权利要 求3所述载体的工程菌。
5.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求3所述载体转入植物体内，筛选转基因植株。
6.用于扩增权利要求1所述玉米CBL9基因⑶S序列的引物对，其特征在于，包括正向引物 F5’ -ATGGGGTGCTTCCAT-3’ 和反向引物 R5’ -TCACGTGACGAGATC-3’。
【文档编号】C12N1/21GK104073504SQ201410206189
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】郑军, 张凡, 牟颖熙, 王国英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所