高产n-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌及其构建方法和应用，该工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌；构建的工程菌株利用葡萄糖为底物进行发酵培养合成N-乙酰氨基葡萄糖。本发明的工程菌利用葡萄糖合成N-乙酰氨基葡萄糖发酵水平高，同时副产物的积累较少，具有工业化生产的潜力。
【专利说明】高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及 其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，广泛存在于各种生物体内。通常以 beta-1，4-糖苷键聚合成几丁质。几丁质是自然界中数量仅次于纤维素的第二大类碳水化 合物，存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳，高等植物的细胞壁 等。除了作为几丁质的组分，N-乙酰氨基葡萄糖还与N-乙酰胞壁酸通过多肽相互交联，构 成细菌细胞壁的主要结构-肽聚糖，也与D-葡萄糖醛酸形成重复的二糖单位而构成透明质 酸。
[0003] N-乙酰氨基葡萄糖医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎症和治疗胃 溃疡疾病，若与抗生素一起使用，可促进抗生素在血液中的吸收，降低副反应同时也可抑制 癌细胞的生长，是合成新型抗癌药物氯脲霉素的主要原料。食品方面，N-乙酰氨基葡萄糖 是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，也是合成VB 6和核黄素中间体的起始原料。 此外，还可应用于化妆品和饲料添加剂中，用途十分广泛。
[0004] N-乙酰氨基葡萄糖的生产目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应 而成，存在成本过高、收率低、纯度不足等缺陷。因此，国内外开展了利用微生物发酵法生产 N-乙酰氨基葡萄糖的工作。
[0005] 美国阿基昂生命科学公司（Arkion Life Sciences LLC)利用代谢工程构建 了一系列代谢工程菌，通过优化发酵参数，获得了高产N-乙酰氨基葡萄糖的生产工 艺（W02004003175, US7332304和CN101365785A等），该专利中，通过向大肠杆菌引入 并过表达6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶，敲除N-乙酰氨基葡萄糖消耗基因，打通葡萄糖 到氨基葡萄糖的代谢途径，构建了高产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌。中国专利申请号 201110174246. 7(CN102286420A)和 201110174249. 0(CN102268399A)通过上述类似的方 式，构建了两株N-乙酰氨基葡萄糖的生产菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，本发明的另一 目的在于提供该工程菌的构建方法，以及在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
[0007] 本发明通过构建新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程大肠杆菌，提高了 N-乙 酰氨基葡萄糖的产量。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的产（高产）N_乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，是通 过将高表达编码Μ)Ρ-Ν-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因（如neuCl基因）和高表达编码 6_磷酸氨基葡萄糖合成酶基因（如glmS基因）导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的 N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因（如基因簇nagDCABE)构建而成的重组大肠 杆菌。
[0009] 所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter je juni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No. AF400048基因序列 全基因合成，或利用空肠弯曲菌（如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获 得，或采用过类似手段从其他生物体获得。
[0010] 所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生 物，6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的获得可根据GenBank No. NC_007779的大肠杆菌W3110 基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或 采用过类似手段从其他生物体获得。
[0011] 所述m)P-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导 入大肠杆菌表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达， 或将两个基因整合到大肠杆菌染色体上表达。
[0012] 上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠 杆菌中的nagDCABE基因簇，将neuC 1和glmS基因分别克隆到表达载体上，转入敲除了 nagDCABE基因簇的大肠杆菌中，获得高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。其中，该构建方 法，更加具体的步骤包括：
[0013] A、敲除大肠杆菌中的基因簇nagDCABE，获得基因簇nagDCABE失活的菌株；
[0014] B、全基因合成编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuCl基因 （SEQ ID NO. 5)，并克隆表达载体；
[0015] C、以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS 基因 （SEQ ID NO. 8)，克隆至步骤B获得的表达载体上，获得双基因表达载体；
[0016] D、将步骤C获得的双基因表达载体转化入步骤A所得的菌株中，获得第一种产 N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌；或
[0017] 将步骤C获得的双基因表达载体整合至步骤C所得菌株的染色体上，获得第二种 产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。
[0018] 所述步骤B中，表达载体包括：质粒pETDuet-1。
[0019] 所述步骤D中，整合是通过RED重组系统，利用pKD46质粒表达RED重组酶来实现。
[0020] 本发明还公开了一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的应用，即利用上述高 产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌进行N-乙酰氨基葡萄糖的生产，该生产方法包括步骤：
[0021] 1)挑取高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的单菌落于种子培养基中，在30? 40°C好气培养5?10小时；其中，优选在35?38°C培养7?8小时；且种子能多级放大培 养；
[0022] 2)将培养好的种子（高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程种子）接种于含有发酵 培养基的发酵罐中，在30?40°C (优选33?38°C，尤其优选37°C )发酵培养，搅拌速度 300?800转/分钟，通风培养，用氨水控制pH6?8,优选pH6. 8?7. 1 ;
[0023] 4)当菌体浓度0D6QQ为25?30时，加入终浓度为（λ 05?ImM IPTG (异丙 基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），30?40°C继续培养（优选37°C )，至结束发酵。其中，IPTG 的终浓度优选〇. 1?〇. 5mM，最优选0. 2mM。
[0024] 所述步骤1)和2)中的种子培养基和发酵培养基的配方如下：
[0025] 氮源，0· l-10g/L，磷源(λ l-25g/L，葡萄糖 l-100g/L，微量元素 0.01-50mg/L。氮 源包括酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、铵盐、硝酸盐或其组合的混合物。磷源包括磷酸及其盐 类。微量元素包括：猛、锌、钥、硼、钴、铜、镍。
[0026] 本发明通过在大肠杆菌中构建一条新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路（如 图1所示），增强N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达，同时，失活导致N-乙酰 氨基葡萄糖消耗和回流的基因，阻止N-乙酰氨基葡萄糖的回流和消耗，使得工程菌株能积 累高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖。通过本发明的方法，得到一株基因工程大肠杆菌，该菌株 可以利用葡萄糖合成高水平N-乙酰氨基葡萄糖，同时，副产物的积累较少，具有工业化生 产的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是大肠杆菌中构建高水平N-乙酰氨基葡萄糖生产工程菌株代谢相关途径。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施不 仅限于此。
[0029] 以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。 以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实 验指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，I989)中所述条件进行。
[0030] pKD46 和 pIJ773 质粒参见[Gust, Β·，et al.，PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100 (4) :p. 1541] 〇
[0031] 实施例1
[0032] -、采用RED重组方法，失活菌株中的nagDCABE基因簇，其具体步骤如下：
[0033] 1、根据大肠杆菌 BL21 (DE3) (Invitrogen 公司）基因组（Genbank No. CP001509)序 列，设计引物：
[0034] 上游引物 F-K〇-nag :
[0035] ATCAGAGCCAACCACGTCCGCAGACGTGGTTGCTATTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID Ν0· 1所示）
[0036] 下游引物 R-K〇-nag :
[0037] TGCGACGCTCAAGCGTCGCATCAGGCATAAAGCAGATTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO. 2 所示）
[0038] 利用引物F-K〇-nag和R-K〇-nag，以质粒pIJ773为模板，利用商业化的PCR试剂， 经PCR扩增得到DNA片段，纯化备用。
[0039] PCR 反应体系：Tag 酶 0· 5 μ 1，10 X buffer5 μ 1，模板 1 μ 1，dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ 1， 引物（10 μ mol/L)各 1· 5 μ 1，ddH2036. 5 μ 1 ;
[0040] PCR 反应过程：94°C 5min，94°C 30s，55°C 45s，72°C 9〇8,30个循环，72 1：延伸 10min〇
[0041] 将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1. 5kb左右存在明显条带。
[0042] 2、将RED重组酶表达质粒载体pKD46利用电击转化法转入大肠杆菌BL21 (DE3)，得 到菌株 BL21 (DE3) /pKD46 ;
[0043] 3、LB培养基中加入1% (m/V，质量体积百分比）的L-阿拉伯糖，30°C震荡培养菌 株BL21 (DE3) /pKD46至0D600达到0. 5,然后制备感受态细胞。将步骤1制备好的DNA片段 电转化入该感受态细胞内，涂布安普霉素抗性（50 μ g/mL) LB平板，得到转化子。
[0044] 4、挑取转化子，用菌落PCR鉴定
[0045] 菌落 PCR 引物为 F-nag :AGCACTGTGCGCAAGCGATTTGG (SEQ ID N0. 3 所示）和 R-nag : CCTGGGCGATCCCGAAGTTCAG (SEQ ID NO. 4 所示）。
[0046] 挑取的转化子菌落经PCR扩增，能扩增出大小为2kb左右条带的菌落，即为 nagDCABE 失活的菌株 BL21 (DE3) / Λ nag。
[0047] 二、glmS 和 neuCl 基因双表达载体 pETDuet-glmS-neuCl 的构建
[0048] 1、根据基因序列（GenBank No. AF400048)全基因合成neuCl基因，两端加 Ndel和 Xhol位点，具体序列如下所示（SEQ ID N0. 5)。
[0049] 2、利用常规分子生物学技术将neuCl基因连接至pETDuet-1 (Novogen公司）的 Ndel和Xhol位点上，得到载体pETDuet-neuCl。
[0050] 3、根据大肠杆菌W3110基因组序列（GenBank N〇.NC_007779)设计引物，正向 引物 F-glmS-Bsal ：TACGGTCTCCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC (SEQ ID Ν0· 6 所示）和反向引物 R-glmS-BamHI ：GCGGGATCCTTACTCAACCGTAACCGATTTTG (SEQ ID Ν0· 7 所示），该引物中的两端 增加了 Bsal和BamHI位点；
[0051] 4、以大肠杆菌W3110菌株（美国大肠杆菌遗传保藏中心，The Ε· coli genetic stock center，cgsc)的总DNA为模板，以上述引物（SEQ ID Ν0· 6和7所示）PCR扩增得到 glmS基因片段（SEQ ID NO. 8所示），并用Bsal和BamHI酶切，回收备用。
[0052] 5、用试剂盒抽提纯化表达载体pETDeut-neuCl，用Ncol和BamHI双酶切，回收备 用。可选用市售的质粒抽提试剂盒，如Axygen plasmid extraction kit等。
[0053] 6、连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌 DH5a (购自TAKARA公司）感受态细胞，得到双表达载体pETDuet-glmS-neuCl。
[0054] 三、glmS和neuCl基因以质粒方式在BL21 (DE3) / Δ nag中表达
[0055] 1、用液体LB培养基过夜培养含有载体pETDuet-glmS-neuCl的大肠杆菌DH5 α菌 株，抽提质粒 pETDuet-glmS-neuCl。
[0056] 2、培养大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Anag，制备感受态细胞，并电击转化质 粒载体pETDuet-glmS-neuCl进入该菌株，获得基因工程菌株BL21 (DE3) / Λ nag/ pETDuet-glmS-neuCl，即为能高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。
[0057] 四、工程菌株发酵实验
[0058] 1、种子和发酵培养基（1L):
[0059] KH2P0414g ;K2HP04 ·3Η202Κ ;酵母提取物（购自 0X0ID公司）5g ;柠檬酸钠·2H201g ; 硫酸铵 7. 5g ;MgS04 · 7Η200· 25g ;CaCl20. 02g ;葡萄糖 5g，微量元素 10ml。
[0060] 其中，微量元素为：硫酸锰lOOmg/L ;氯化锌70mg/L ;钥酸钠35mg/L ;硼酸60mg/L ; 氯化钴 200mg/L ;硫酸铜 29. 28mg/L ;氯化镍 25mg/L ;浓盐酸（37% )0· 9ml/L。
[0061] 补料液：650g/L葡萄糖。
[0062] 2、发酵过程：
[0063] 1)挑取 BL21 (DE3) / Δ nag/pETDuet-glmS-neuCl 单菌落于装液量 4ml LB 试管中， 37°C培养8小时。
[0064] 2) 2ml -级种子接种于200ml种子培养基中，35°C培养16?18小时。
[0065] 3)二级种子接种于装液量3. 5L的发酵罐中，37°C，搅拌速度300?800转/分钟， 溶氧保持在30%以上，用氨水控制pH在6. 9。
[0066] 4)葡萄糖耗完后，开始以6. 5g/L. h的速度补加葡萄糖。
[0067] 5)发酵液菌体0D6QQ = 25?30时加入IPTG (IPTG终浓度为0. 2mM)，37°C培养，培 养基中葡萄糖浓度保持在5?10g/L，50小时后可减慢补料速度，至结束发酵。
[0068] 五、发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度的测定
[0069] 将发酵液稀释至合适倍数后，采用HPLC检测，检测条件如下：
[0070] 检测柱：Bi〇-Rad AMINEX HPX87H Organic Analysis Column (300 X 7. 8mm);
[0071] 柱温：6〇?;
[0072] 流动相是6mM硫酸，流速是0. 6ml/min ;
[0073] 检测波长：210nm
[0074] 经检测，60小时发酵后，发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达30g/L。
[0075] 实施例2
[0076] 一、glmS和neuCl基因整合至菌株BL21 (DE3) / Λ nag染色体上表达
[0077] 1、根据质粒pIJ778序列，设计引物F-IJ778_KpnI :
[0078] CTAGGTACCATTCCGGGGATCCGTCGAC (SEQ ID N0. 9 所示）R-I J778_XhoI:
[0079] GATCTCGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO. 10 所示），以质粒 pi J778 为模板，PCR 扩增获得链霉素抗性DNA片段；
[0080] 2、纯化上述DNA片段，并用ΚρηΙ和Xhol双酶切，回收备用。
[0081] 3、用ΚρηΙ和Xhol双酶切质粒载体pETDuet-glmS-neuCl,纯化后与步 骤2中纯化好的链霉素抗性DNA片段连接，转化大肠杆菌DH5 α，获得整合载体 pETDuet-glmS-neuC-Str 〇
[0082] 4、设计上游引物 F-ETDu-fucI :
[0083] ATGAAAAAAATCAGCTTACCGAAAATTGGTATCCGCCCGTGCGTCCGGCGTAGAGGATC(SEQ ID Ν0· 11所示）和下游引物R-ETDu-fucI:
[0084] TTAACGCTTGTACAACGGACCGTAGTTCTGGCAAGCGCGGCCAATCCGGATATAGTTCC(S EQ ID NO. 12所示），引物前端为大肠杆菌fuel基因内的片段，末端为与整合载体 pETDuet-glmS-neuC-Str 匹配的片段，以整合载体 pETDuet-glmS-neuC-Str 为模板，PCR 扩 增获得含有待表达基因 glmS和neuCl以及链霉素筛选标记的DNA片段，纯化备用。
[0085] 5、将RED重组酶表达载体pKD46利用电击转化法转入实施例1中获得的nagDCABE 失活的菌株 BL21 (DE3) / Λ nag，得到菌株 BL21 (DE3) / Λ nag/pKD46。
[0086] 6、LB培养基中加入1%的L-阿拉伯糖，30°C震荡培养菌株BL21(DE3)/Anag/ PKD462?3小时，然后制备感受态细胞。将上述制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞 内，涂布链霉素（50 μ g/mL)抗性LB平板，得到转化子。
[0087] 7、用菌落PCR鉴定转化子，根据插入位点及整合基因的序列设计引物F-fucI : GTTCTCAAACGGCAACTAACTG(SEQ ID N0. 13所示）和原来用于扩增glmS基因的引物 R-glmS-BamHI :GCGGGATCCTTACTCAACCGTAACCGATTTTG(SEQ ID N0. 7 所示），PCR 扩增得到 2kb左右条带的转化子，即为将glmS和neuCl基因整合至染色体的菌株BL21 (DE3) / Λ nag/ Δ fuel ：glmS-neuCl--高产N_乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。
[0088] 二、工程菌株发酵检验
[0089] 种子和发酵培养基及发酵过程同实施例1，菌株BL21(DE3)/Anag/AfucI : glmS-neuCl经60小时发酵后，经如实施例1的HPLC检测，N-乙酰氨基葡萄糖浓度达到70g/ L〇
[0090] 以上培养结果表明，经代谢工程技术构建的基因工程菌具有高产N-乙酰氨基葡 萄糖的能力，具备了工业化的潜力。
[0091] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
[0001] 序列表 SKQI：F,NCE USTTNG <110〉华东理T大学 <120〉高产Ν-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用 <130〉说明书，权利要求书 <160> 13 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211〉 59 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 1 atcagagcca accacgtccg cagacgtggt tgctattcaa ttccggggat ccgtcgacc 59 <210> 2 <211〉 58 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 2 tgcgacgctc aagcgtcgca tcaggcataa agcagattat gtaggctgga gctgcttc 58 <210〉 3 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 [0002] <400〉 3 agcactgtgc gcaagcgatt tgg 23 <210> 4 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4 cctgggcgat cccgaagttc ag 22 <210〉 5 <211> 1134 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 5 catatgaaaa aaatcctttt tataacaggc tctagggctg attattctaa gattaaatct 60 ttaatgtaca gggtgcaaaa ctcaagcgaa tttgaacttt acatctttgc aacaggaatg 120 cacttaagta aaaattttgg ctatacagtt aaagaacttt ataaaaatgg ctttaaaaat 180 atttatgaat ttataaatta tgataaatat tatcaaactg ataaggcttt agctactaca 240 attgatggat tttxaaggta tgcaaatgag ctaaaacctg atttaatcgt agtacatgga 300 gatagaattg agcctttagc agcagctatt gttggagcat taaataatat cttagtagcg 360
[0003] catattgaag gcggagagat ttcaggaact attgacgata gcttacgcca cgctatatca 420 aaactagctc atattcattt agtaaatgat gagtttgcaa aaaggcgttt. aat.gcagctt 480 ggagaagatg aaaaatctat ttttatcata. ggttcgcctg atttagaact tttaaacgat 540 aataaaattt cacttagcga agcaaaaaaa tattatgata taaattatga aaactacgct 600 ttgcttatgt ttcatcctgt tacaactgaa attactagca ttaaaaatca agcagacaat 660 tC&Cttg t"tHttt&tCC SELHtS&tg&t 720 ttaggttttg aattaatctt gcaaagctat gaagagttta aaaataaccc tagatttaag 780 ctttttccat cgcttagatt tgagtatttt ataactttgt taaaaaatgc tgattttata 840 ataggtaatt caagttgtat tttaaaagag gccttatact taaaaacagc agggatttta 900 gttggctcaa gacaaaatgg aagacttggc aatgaaaata cactaaaagt taatgcaaat 960 agtgatgaaa tactaaaagc tattaacact attcataaaa aacaagattt atttagcgct 1020 aagttagaga ttttagatag ctcaaaatta ttttttgaat atttacaaag cggagatttt 1080 tttaaactca gcacacaaaa agtttttaag gatataaaat gaggtaccct cgag 1134
[0004] <210〉 6 <211> 31 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 6 tacggtctcc catgtgtgga attgttggcg c 31 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 7 gcgggatcct tactcaaccg taaccgattt tg 3? <210〉 8 <211> 1830 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 8 atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60 ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120 ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtxcaga tgctggcaca ggcagcggaa 180 gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
[0005] ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300 atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360 txt.gaaaccg acancgaagt gattgcccat otggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420 actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480 atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540 attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600 acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660 aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720 tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780 ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840 gagct.gggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900 tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960 attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020 aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
[0006] cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140 tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200 gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260 tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320 ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380 gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440 ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500 ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560 gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620 ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680 cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740 ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800 aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
[0007] <210> 9 <211〉 28 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 9 ctaggtacca ttccggggat ccgtcgac 28 <210> 10 <211> 28 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 10 gatctcgagt gtaggctgga gctgcttc 28 <210> 1.1 <211〉 59 (212> DNA <213〉人工序列 <400> 11 atgaaaaaaa tcagcttacc gaaaattggt atccgcccgt gcgtccggcg tagaggatc 59 <^10> 12 <211> 59 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 12 ttaacgcttg tacaacggac cgtagttctg gcaagcgcgg ccaatccgga tatagttcc 59
[0008] <210> 13 <211> 22 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 13 gttctcaaac ggcaactaac tg 22
【权利要求】
1. 一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述的工程菌是通过将编码 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆 菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因构建而成的 重组大肠杆菌。
2. 根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因来源于空肠弯曲菌Campylobacter jejun或能表达 相同功能酶的微生物。
3. 根据权利要求2所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因是根据GenBank No. AF400048基因序列全基因合 成，或利用空肠弯曲菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。
4. 根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述 6_磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌，或具有相同功能酶的微生物。
5. 根据权利要求4所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：所述 6_磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的获得是根据GenBank No. NC_007779的大肠杆菌W3110基 因组序列，经全基因合成，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。
6. 根据权利要求1所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，其特征在于：是将如 SEQ ID NO. 5所示的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuCl基因和如SEQ ID NO. 8所 示的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因克隆直接整合到敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解 利用代谢途径酶的基因 nagDCABE的大肠杆菌染色体上表达；或两个基因通过表达载体转 化入敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因 nagDCABE的大肠杆菌中表达。
7. -种如权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在 于，该方法包括步骤： A、 敲除大肠杆菌中的基因簇nagDCABE，获得基因簇nagDCABE失活的菌株； B、 全基因合成编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuCl基因如SEQ ID NO. 5所 示，并克隆表达载体； C、 以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基 因如SEQ ID NO. 8所示，克隆至步骤B获得的表达载体上，获得双基因表达载体； D、 将步骤C获得的双基因表达载体转化入步骤A所得的菌株中，获得第一种产N-乙酰 氨基葡萄糖代谢工程菌；或 将步骤C获得的双基因表达载体整合至步骤C所得菌株的染色体上，获得第二种产 N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。
8. 根据权利要求7所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在 于，所述步骤B中，表达载体为质粒pETDuet-1。
9. 根据权利要求7所述的一种产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在 于，所述步骤D中，整合是通过RED重组系统，利用pKD46质粒表达RED重组酶来实现。
10. -种如权利要求1至6任一所述的产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌在生产N-乙 酰氨基葡萄糖中的应用，其特征在于，生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法包括： 1)挑取产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的单菌落于种子培养基中，在30?40°C好气 培养12?20小时；其中，种子能多级放大培养； 2) 将培养好的种子接种于含有发酵培养基的发酵罐中，在30?40°C发酵培养，搅拌速 度300?800转/分钟，通风培养，用氨水控制发酵过程pH6?8 ; 3) 培养至菌体浓度0D6(?为25?30时，加入终浓度为0. 05?ImM异丙基-β -D-硫代 吡喃半乳糖苷，30?40°C继续培养，至结束发酵； 所述的种子培养基和发酵培养基的配方如下： 氮源，0· l-10g/L，磷源 0· l-25g/L，葡萄糖 l-100g/L，微量元素 0.01-50mg/L。
【文档编号】C12N1/21GK104059872SQ201410336950
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】赵黎明, 邱勇隽, 王耀松, 夏泉鸣, 蒋丽华, 范立强, 周家春 申请人:华东理工大学