一种用于检测vkh综合征的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测VKH综合征的试剂盒，该试剂盒包含用于扩增位点rs78377598、rs77258390、rs78597810、rs12568393、rs12561798、rs76436269、rs3021304、rs442309和rs224058的基因片段的试剂的引物对，以及特异性检测个体基因型的Sequenom?MassARRAY单碱基延伸引物。该试剂盒通过检测受试者所述的SNP位点是否有变异，预测受试者对VKH综合征的遗传易感性，可用于早期筛查汉族人群VKH综合征的发生，为临床诊断和治疗提供依据。
【专利说明】—种用于检测VKH综合征的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种用于检测VKH综合征的试剂盒。
【背景技术】
[0002]Vogt一Koyanagi一Harada (VKH)综合征又名伏格特-小柳-原田综合征,是一种累及全身多系统的炎症性疾病。该综合征的其特征为:①突发性色素膜炎；②眉毛及毛发变白、秃发及白癜风等皮肤损害；③头痛、头晕、恶心等神经系统表现；④耳鸣、耳聋及眩晕等内耳症状。
[0003]VKH综合征以急性发作开始，病程迁延反复。分两个临床类型，即以渗出性虹膜睫状体炎为主的Vogt-小柳型(VK型)和渗出性脉络膜炎为主的原田型(H型)。VKH综合征多发生于有色人种，中国、日本、巴西及美国印第安人为高危人群，并且其好发于青壮年，以20-40岁为多，男女无明显差别。双眼同时受累是VKH综合征的重要临床表现，据统计约占患者总数的94% _100*%，双眼先后受累者间隔多小于10天。
[0004]VKH综合征是我国葡萄膜炎中常见的一种类型，约占所有葡萄膜炎患者的14%。其确切病因目前尚不清楚，所致的葡萄膜炎具有发作频繁、受累组织广泛，病程长及并发症多等特点。VKH综合征如未得到及时有效的治疗，可引起许多并发症，如带状角膜变性、角膜水肿、并发性白内障、继发性青光眼、黄斑部及视盘水肿、黄斑表面褶纹样改变以及视网膜脱离等，造成严重后果。预后与炎症的控制程度相关，反复多次的炎症可致眼部病情迁延及并发症，使眼组织的进一步破坏和视力的逐渐下降，最后严重影响患者视功能，降低患者的劳动力，并对其生理、心理造成不同程度的妨碍。
[0005]VKH综合征是一种多因素复杂疾病，现被普遍认为是一种免疫遗传基因病，在遗传和环境等因素共同作用下，由T细胞介导的自身免疫反应以黑色素相关抗原、视网膜S抗原或光感受器维生素A类结合蛋白为靶点，引起眼部抗原-抗体反应而表现出免疫源性葡萄膜炎。虹膜睫状体的病理改变在本质上与脉络膜改变相同，系由上皮样细胞、淋巴细胞和浆细胞等构成的病灶，有时可见有淋巴细胞的有丝分裂征象，但在虹膜内上皮样细胞形成不及脉络膜内明显。既往流行病学研究发现VKH综合征有明显的家族聚集倾向，呈现地域性聚集，特定种群发病率高等现象，这些现象揭示了遗传因素在其致病机理中发挥重要作用。VKH综合征属于多基因遗传复杂疾病，并不遵循经典孟德尔遗传定律，在这类遗传病中，每个基因对表型的贡献相差不大，其遗传性状表达受多对等效、微效和累加的多基因控制，环境因素在其中所起的作用也不可忽视。
[0006]近年来，遗传学理论、研究手段和认识水平的不断进步和发展给疾病遗传学研究带来了新的思路和突破。应用候选基因筛查、连锁分析等技术进行VKH综合征的基因定位和候选基因的克隆筛查工作，已经发现了多个VKH综合征的候选基因位点。在日本人群中，HLA-DR4/DR53与VKH综合征有强相关性早被证实，随后在中国，北美，西班牙人群中，此遗传区域与VKH综合征的易感性得到进一步验证。其他候选基因包括TRAF5 (rsl 14065494)、JAKl(rs4916004)、PTPN22(rs974404)、CTLA4(rsl87762111)、STAT4(rs34946552)、0PN(rsl42608941)、TNIPl (rs2287721)、TNFAIP3 (rs3799491)、MIF (rs2012133)等。目前，对VKH综合征遗传易感性研究成果多集中于人类白细胞抗原(HLA-DR4/DR53，HLA-DRl,HLADRBI * 0405等)与此病的相关性，非HLA抗原与此病的相关性报道并不多见，而且大部分报道结果很难在其他人群中重复。
[0007]未来针对VKH综合征治疗的发展趋势是切实有效、疗效持久、降低复发的综合治疗手段，以长久地保存患者有用的视功能，提高患者的生活质量。为此，需要寻求更加有效和精准的遗传标记物和检测方法，以利于早期筛查VKH综合征高危人群，并实施早期的检测和预防，减少其视力损害。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种用于检测VKH综合征的试剂盒，该试剂盒通过检测位于染色体区域 1ρ31.2 的 SNP 位点 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269，[以及位于1ρ31.2且与上述位点连锁遗传的rsll7633859、rsl2564219、 rsl2563505、 rs3401735 2、 rsll4661385、 rsll7301158、 rsll500927Urs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985];位于染色体区域6p21.3的SNP位点rs3021304[以及连锁遗传位点rsl 14800139];和位于染色体区域10q21.3的SNP位点rs442309和rs224058[以及位于10q21.3且与上述位点连锁遗传的rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]的变异，用于早期筛查汉族人群VKH综合征，为临床诊断和治疗提供依据。
[0009]本发明的技术方案是:
[0010]用于检测VKH综合症的试剂盒，包含用于扩增位点rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 的基因片段的试剂的引物对，以及特异性检测个体基因型的Sequenom MassARRAY单碱基延伸引物。
[0011]所述基因片段的试剂的引物rs78377598基因片段的试剂的PCR引物对序列如SEQID N0.1~2所示；rs77258390基因片段的的PCR引物对序列如SEQ IDN0.3~4所示；rs78597810基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.5~6所示；rsl2568393基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.7~8所示；rsl2561798基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.9~10所示；rs76436269基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.11~12所示；rs3021304基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.13~14所示；rs442309基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.15~16所示；rs224058基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.17~18所示。
[0012]所述特异性检测个体基因型的Sequenom MassARRAY单碱基延伸引物的序列如SEQID N0.19 ~27 所示。
[0013]所述试剂盒还包括Taq酶，SAP，SAP Buffer,无酶水，以及位点rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和rs224058的标准DNA样本。
[0014]本发明的试剂盒中含有特异性扩增目的片段的PCR引物对、特异性检测个体基因型的Sequenom MassARRAY单喊基延伸引物，以及用于PCR扩增和进行Sequenom MassARRAY分型检测试剂盒的常规组件、试剂、操作步骤等。
[0015] 申请人:在研究中发现，在汉族人中当位点rs78377598C — T变异、rs77258390G — A 变异、rs78597810T — C 变异、rsl2568393G — A 变异、rsl2561798T — C变异、rs76436269G — A变异、[以及连锁遗传位点rsll7633859A — G变异、rsl2564219G — A 变异、rsl2563505C — T 变异、rs34017352A — C 变异、rsll4661385G — A变异、rsll7301158T — A 变异、rsll5009271C — A 变异、rs76091599C — G 变异、rs78865162C — T 变异、rs78917656T — G 变异、rs6693659C — A 变异、rsl2566159C — T 变异、rsll7282985G — C 变异]、rs3021304C — G 变异[连锁遗传位点 rsll4800139G — A 变异]、rs442309C — T变异和/或rs224058G — A变异[以及连锁遗传位点rs224048G — A变异、rs224052G — T 变异、rs224057C — T 变异、rsl0995307T — C 变异、rsl0995281T — C变异、rs7088592A — G 变异、rs224071G — A 变异、rs224031T — G 变异、rs224032G — A 变异、rs224033C — G变异]，即上述33个位点之一发生变异，均不同程度地增加了 VKH综合征的患病风险。
[0016]本发明的测定方法用于测定来源于人的基因组DNA，临床取材样本来源广泛，如体液(如血液、腹水和房水)、组织细胞(如皮肤组织、虹膜组织)等，通过提取和纯化这些样本均可制备基因组DNA。
[0017]本发明首次公开了上述多态性位点与VKH综合征的相关性，提供了一种预测VKH综合征易感性的试剂盒，该试剂盒可用于I)此疾病的辅助诊断:通过所述试剂盒明确受试者的这33个位点的基因型，预测受试者对VKH综合征的易感性。2)指导个体化治疗，新药开发:在临床实践和科研中，rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269, [rsll7633859、 rsl2564219、 rsl2563505、 rs34017352、 rsll4661385、rsll7301158、rsll500927U rs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985] ；rs3021304[rsll4800139] ；rs442309 和 rs224058[rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。3)为判断预后提供分子生物学依据。携带有上述位点危险等位基因的病人可能在一定程度上预后差于其他未携带有危险等位基因的病人。
[0018]本发明所述试剂盒可对VKH综合征高危的人群进行早期的筛查、正确诊断、及时有效治疗，对可能发生的严重并发症尽早发现以及预防病变发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1-3是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs78377598位点的基因分型图谱；
[0020]图4-6是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs77258390位点的基因分型图谱；
[0021]图7-9是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs78597810位点的基因分型图谱；
[0022]图10-12是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rsl2568393位点的基因分型图
-1'Tfe1曰；
[0023]图13-15是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rsl2561798位点的基因分型图
-1'Tfe1曰；
[0024]图16-18是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs76436269位点的基因分型图
-1'Tfe1曰；
[0025]图19-21是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs3021304位点的基因分型图谱；
[0026]图22-24是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs442309位点的基因分型图谱；
[0027]图25-27是Sequenom MassARRAY SNP技术检测rs224058位点的基因分型图谱。
【具体实施方式】
[0028]本发明所用试剂均为市售产品，其中。乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为抗凝剂，QIAGEN QIAamp DNA Mini Blood Kit (购自德国QIAGEN公司)为市售的快速高效抽提基因组DNA的试剂盒。
[0029]实施例1样本收集和基因组DNA的提取
[0030]样本来自于重庆医科大学附属第一医院，共收集VKH患者1559例，其中男性占55.0%,女性占45.0 % ;正常对照者5640例，其中男性占50.8 %，女性占49.2 %。所有受试者均为汉族，且自愿签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。
[0031]根据QIAGEN QIAamp DNA Mini Blood Kit 试剂盒(购自德国 QIAGEN 公司)说明书提供的操作步骤，制备人外周血基因组DNA。
[0032]实施例2 包括 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269, [rsl17633859、 rsl2564219、 rsl2563505、 rs34017352、 rsll4661385、rsll7301158、rsll500927U rs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985] ；rs3021304[rsll4800139] ；rs442309 和 rs224058[rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
[0033]本发明采用Sequenom MassARRAY SNP 检测技术对位点 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 变异进行检测(如下所示)。
[0034]I)用 SEQ ID N0.1 ~2、SEQ ID N0.3 ~4、SEQ ID N0.5 ~6、SEQ ID N0.7 ~8、SEQ ID N0.9 ~10、SEQ ID N0.11 ~12、SEQ ID N0.13 ~14、SEQ ID N0.15 ~16、SEQ IDN0.17~18所示的引物进行包含特异位点的目的基因片段；
[0035]PCR 扩增:94°C 4min ；94°C 20s, 56V 30s, 72V lmin,共 45 个循环；72°C 5min ；4°C保持。每个反应体积为5ul，包括2ul Taq酶，1.5ul无酶水，PCR上游和下游引物各0.25ul，Iul DNA样本溶液(浓度为50ng/ul)。
[0036]2) PCR产物碱性磷酸化处理；
[0037]①在PCR 结束后,将 PCR 产物用 SAP (shrimp alkaline phosphatase,奸喊性憐酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
[0038]②配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix。每个反应体积为2ul，其中包括1.53ul无酶水，0.17ul SAP Buffer,0.3ul SAP Enzyme。
[0039]③反应条件:37°C 40min, 85°C 5min, 4°C保持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
[0040]3)用特异的单碱基延伸引物包括 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.3KSEQ ID N0.32,SEQ ID N0.33,SEQ ID N0.34,SEQ ID N0.35,SEQ ID N0.36进行单喊基延伸；
[0041]将2ul单碱基延伸反应液加入上述每个反应体系中，按照以下PCR反应条件进行反应:
[0042]1.94°C for 30s, I1.94°C for 5s, II1.52°C for 5s, IV.80°C for 5s, V.go toIII, 4more times, V1.go to II, 39more times, VI1.72°C for 3min, VDI.4。。保持。
[0043]4)树脂纯化，芯片点样，质谱分析，检测结果用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果(见图1-27)。
[0044]采用如下PCR引物对A-1以及单碱基延伸引物a-1根据上述方法进行分型。
[0045]PCR 引物对 A(rs78377598)(如 SEQ ID N0.1 ~2 所示):
[0046]F: 5，ACGTTGGATGGAGACATTTATCAGTGCAGG 3，
[0047]R:5’ ACGTTGGATGCTCCAAGAAGAAGGGTATAG 3’
[0048]PCR 引物对 B(rs77258390)(如 SEQ ID N0.3 ~4 所示):
[0049]F: 5，ACGTTGGATGAAGAGGCAAAATGTCATCCC 3，
[0050]R:5’ AC GTTGGATGGAAAAATACAGCTGTGTGTG 3’
[0051]PCR 引物对 C(rs78597810)(如 SEQ ID N0.5 ~6 所示):
[0052]F: 5 ’ ACGTTGGATGATGACTGACTTGAAAACAGC 3，
[0053]R:5’ ACGTTGGATGGGAATGATGAACAACCCCTG 3’
[0054]PCR 引物对 D (rsl2568393)(如 SEQ ID N0.7 ~8 所示):
[0055]F: 5 ’ ACGTTGGATGGTTGATAGTGGTGATTTGTC 3，
[0056]R:5， ACGTTGGATGGAACTGAATTCTTAAGAAGC 3’
[0057]PCR 引物对 E(rsl2561798)(如 SEQ ID N0.9 ~10 所示):
[0058]F: 5 ’ ACGTTGGATGGTTGATAGTGGTGATTTGTC 3，
[0059]R:5，ACGTTGGATGGAACTGAATTCTTAAGAAGC 3’
[0060]PCR 引物对 F(rs76436269)(如 SEQ ID N0.11 ~12 所示):
[0061]F: 5 ’ ACGTTGGATGCAGATTACAACTAGCCAAGG 3，
[0062]R:5， ACGTTGGATGGAGGACAATAAAAGCTCCAC 3，
[0063]PCR 引物对 G(rs3021304)(如 SEQ ID N0.13 ~14 所示):
[0064]F: 5，ACGTTGGATGCCTAGTCTCACTGTCACCTC 3，
[0065]R:5’ ACGTTGGATGTTGGTAAGGCAAGTGTCATA 3’
[0066]PCR 引物对 H(rs442309)(如 SEQ ID N0.15 ~16 所示):
[0067]F: 5 ’ ACGTTGGATGTCTCTGTGAAGTGAAGGGAC 3，
[0068]R:5， ACGTTGGATGGTTCTGTTCTTTGCAGACCG 3，
[0069]PCR 引物对 I (rs224058)(如 SEQ ID N0.17 ~18 所示):
[0070]F: 5 ’ ACGTTGGATGTAGGCACGTGATAGTGATTC 3，
[0071]R: 5，ACGTTGGATGTGGGTAGTCTAAATCCCAGG 3’
[0072]所得到的扩增序列如下(其中序列中的方框中表示碱基发生变异)
[0073]序列28(rs78377598):l26bp
[0074](方框处为SNP)
[0075]AaaccaagatGTTCAACATGTCCAGACAAGtaaatctaagactagagacatttatcagtgcaggatacctccc C/T tatcttcacgattatctgctaaCAGCTATACCCTTCTTCTTGgAgaaAttGc
[0076]序列29(rs77258390):96bp
[0077](方框处为SNP)
[0078]AgGacattTtAAGAGGCAAAATGTCATCCCattatacacacacacatac A/G cacatgcacgcacat
gCACACACAGCTGTATTTTTCtATatAcaGT
[0079]序列30(rs78597810):114bp
[0080](方框处为SNP)
[0081 ] taaTctaAaaATGACTGACTTGAAAACAGCttgtatttaatttaaaatgatggggaatttcacaa C/T
attggttacattttaagtCAGGGGTTGTTCATCATTCCaAgaatgtac
[0082]序列31(rsl2568393):112bp
[0083](方框处为SNP)
[0084]CtGgaatcTaGTTGATAGTGGTGATTTGTCtaagattgtt A/G taataccttcagctcaaaaatttgt
acagaggtgaaaattaGCTTCTTAAGAATTCAGTTCagaaacgtta
[0085]序列32(rsl2561798):112bp
[0086](方框处为SNP)
[0087]ctGgaatcTaGTTGATAGTGGTGATTTGTCtaagattgttgtaataccttcagctcaaaaatttg C/T
acagaggtgaaaattaGCTTCTTAAGAATTCAGTTCagaaacgtta
[0088]序列33(ι^76436269):101bp
[0089](方框处为SNP)
[0090]GgaaaGGtTaCAGATTACAACTAGCCAAGGaaagaagttcacagggca A/G agtcagtcccgaaataa
caaatGTGGAGCTTTTATTGTCCTCttcCtgtgGa
[0091]序列34(rsll7633859):119bp
[0092](方框处为SNP)
[0093]ggagTGagccATCGTGCCAGGCCATAAATGggatttttgatgaaccattact A/G ttttttttttaaa
cattggataaaatttatatgtaaAATTTTACTTGATTTCTTTCagatttggtT
[0094]序列35Crs3O2I3O4):88bp
[0095](方框处为SNP)
[0096]AaaccaGtacCCTAGTCTCACTGTCACCTCcccagccttgatgctcctccT C/G tacctaTATGACAC
TTGCCTTACCAACAgatgAttT
[0097]序列36(rs442309):98bp
[0098](方框处为SNP)
[0099]ttGgTcagcaTCTCTGTGAAGTGAAGGGACtaccca,C/T gcacacatggcctctctgccctagaagagccCGGTCTGCAAAGAACAGAACttgaCAtaaa
[0100]序列37(rs224058):106bp
[0101](方框处为SNP)
[0102]tgGgatGtaGTAGGCACGTGATAGTGATTCaaagattagtctccaaagttaaattctgctgttc C/T g
taaaagtggcCCTGGGATTTAGACTACCCAtgatCcttGT
[0103]延伸引物a(rs78377598)(如 SEQ ID N0.19 所示):
[0104]5， cccTGCAGGATACCTCCC 3，
[0105]延伸引物b(rs77258390)(如 SEQ ID N0.20 所示):
[0106]5’ CCATTATACACACACACATAC 3’
[0107]延伸引物c(rs78597810)(如 SEQ ID N0.21 所示):
[0108]5’ TGATGGGGAATTTCACAA 3’
[0109]延伸引物d(rsl2568393)(如 SEQ ID N0.22 所示):
[0110]5’ AGTGGTGATTTGTCTAAGATTGTT 3’
[0111]延伸引物e(rsl2561798)(如 SEQ ID N0.23 所示):
[0112]5 ’ AGCTAATTTTCACCTCTGT 3，
[0113]延伸引物f (rs76436269)(如 SEQ ID N0.24 所示):
[0114]5， aaacGAAGTTCACAGGGCA 3，
[0115]延伸引物h(rs3021304)(如 SEQ ID N0.25 所示):
[0116]5 ’ ACTTGATGCTCCTCCT 3，
[0117]延伸引物i (rs442309)(如 SEQ ID N0.26 所示):
[0118]5’ gaatTGAAGGGACTACCCA 3’
[0119]延伸引物j (rs224058)(如 SEQ ID N0.27 所示):
[0120]5’ CCCAGGGCCACTTTTAC 3’
[0121]统计方法:利用SPSS 13.0软件进行分析，检测Hardy-Weinberg平衡，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P〈0.05认为有统计学意义的差异。结果如下(图1-27为SNP基因分型结果图):
[0122]SNP位点多态性与VKH综合征密切相关
[0123]
【权利要求】
1.一种用于检测VKH综合征的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包含用于扩增位点rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309和rs224058的基因片段的试剂的引物对，以及特异性检测个体基因型的Sequenom MassARRAY单喊基延伸引物。
2.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于:所述基因片段的试剂的引物 rs78377598基因片段的试剂的PCR引物对序列如SEQ ID N0.1~2所示； rs77258390基因片段的PCR引物对序列如SEQ ID N0.3~4所示； rs78597810基因片段的PCR引物对序列如SEQ ID N0.5~6所示； rsl2568393基因片段的PCR引物对序列如SEQ ID N0.7~8所示； rsl2561798基因片段的PCR引物对序列如SEQ ID N0.9~10所示； rs76436269基因片段的PCR引物对序列如SEQ ID N0.11~12所示； rs3021304基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.13~14所示； rs442309基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.15~16所示； rs224058基因片段的的PCR引物对序列如SEQ ID N0.17~18所示。
3.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于:所述特异性检测个体基因型的Sequenom MassARRAY单喊基延伸引物的序列如SEQ ID N0.19~27所不。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括Taq酶，SAP,SAPBuffer,无酶水，以及位点 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 的标准 DNA 样本。
【文档编号】C12Q1/68GK104164505SQ201410388922
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】杨培增, 杨正林, 侯胜平, 杜利平, 雷博 申请人:重庆医科大学附属第一医院