基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，公开了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本发明提供的基因在作为短链醇耐受靶点上的应用中的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。本发明发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。将微生物中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇中的耐受性。CGMCC No.96472014.09.11
【专利说明】基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微 生物短链醇耐受性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，特别涉及基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及 利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。
【背景技术】
[0002] 随着全球石油供求关系的日益紧张，燃料乙醇作为清洁、可再生能源正在成为新 的燃料替代品。第一代燃料乙醇技术是以含糖质和淀粉质作物作为原料生产乙醇，因为该 第一代燃料乙醇技术所使用的原料需要用到糖质或淀粉质的农作物，所以存在与人争粮的 问题。第二代燃料乙醇技术是以世界上最丰富的可再生资源木质纤维素为原料生产乙醇， 其有效地避免了燃料乙醇生产与人争粮的问题。
[0003] 木质纤维素原料经预处理后主要生成葡萄糖和木糖两大单糖，而大多数的乙醇生 产菌株如酵母、运动发酵单胞菌等都不能天然利用木糖，那么如何利用微生物快速发酵葡 萄糖和木糖生产乙醇则成为了当前的研究热点。根据科研报道，主要研究包括两个方面： (1)通过基因重组技术将表达异源或者同源乙醇合成路径相关的酶的基因导入能够利用葡 萄糖和木糖的微生物受体细胞中进行发酵生产乙醇；（2)通过基因重组技术将与木糖利用 相关途径的酶的基因导入能够生产乙醇的微生物中。目前，科学家已研究报道了一系列的 重组微生物，可利用葡萄糖和木糖生产乙醇。
[0004] 然而，当利用重组微生物发酵生产乙醇时，乙醇发酵的成功与否取决于在发酵过 程中对各种环境压力的耐受能力。根据研究报道，发酵过程中不断增加的乙醇浓度所产生 的压力是限制乙醇生产和最终阻止乙醇发酵的重要因素之一。因此，如何提高重组微生物 的乙醇耐受性是第二代燃料乙醇技术迫切需要解决的问题。通过基因重组手段，改良微生 物中的乙醇敏感相关基因无疑是提高微生物的乙醇耐受性能的一个重要解决方案。因此， 寻找微生物中的乙醇敏感的关键基因祀点，对相关基因改良，对进一步提商乙醇发酵得率 有着非常积极的意义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应 用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本发明发现了该基因对短链醇敏感，与 微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。
[0006] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用，该基因具有I或II所示 的核苷酸序列中的任意一个：
[0008] I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0009] II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序 列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1的所示核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0010] 大肠杆菌虽然不能天然高效合成乙醇，但它具有生长快速、培养简单、遗传背景清 晰、底物利用宽泛、能够利用木糖为单一碳源快速生长等优点，是异源构建乙醇合成路径的 良好宿主。上世纪90年代，Ingram课题组将来自运动发酵单胞菌中的PET操纵子导入大肠 杆菌W中，成功构建筛选了一株高产乙醇的重组大肠杆菌KOll，它在复杂培养基中的乙醇 得率超过100%，是目前报道的共利用葡萄糖和木糖产乙醇最具潜力的菌株之一。然而，菌 株KOll的乙醇耐受性较差，当乙醇浓度达到35g/L时生长几乎全部被抑制，其乙醇耐受力 较低，严重限制了菌株发酵生产乙醇的产量。本发明通过探究菌株KOll乙醇耐受能力差的 原因，寻找到一个新的乙醇敏感性基因。该基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。该 基因在NCBI公布的大肠杆菌KOll基因组上的基因编号为EK011_3023,由于该基因编码假 设蛋白，具体功能尚不知。在本发明中，根据本发明鉴定的功能（乙醇敏感性蛋白-ethanol sensitive protein A)将该基因命名为 espA。
[0011] 实验结果证实，将大肠杆菌KOll中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组 菌株在乙醇中的耐受性。在本发明的另外一些实施例中，实验结果还发现，将微生物中的该 基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在异丙醇或正丁醇中的耐受性。说明该基因 与微生物对短链醇的耐受有一定的关联。
[0012] 优选地，本发明提供的应用中的短链醇为乙醇、正丙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、 异丁醇或丁二醇。在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中的短链醇为乙醇、异丙醇 或正丁醇。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中的短链醇为乙醇。
[0013] 优选地，本发明提供的应用具体为作为短链醇筛选标记基因。
[0014] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用具体为作为短链醇筛选标记基因 时，可将该基因作为反向筛选标记，将此基因作为质粒筛选标记，用短链醇作为筛选压，反 向筛选。这和抗性筛选相反，即不生长的重组微生物含有目标质粒。也可以将该基因作为 正向筛选标记，将此基因导入质粒中，同时将酶切位点设计在这个基因内部，所设酶切位点 不改变基因翻译之后所得的氨基酸序列，将后续目标基因插入此酶切位点而使其失活，用 短链醇作为筛选压，短链醇抗性高的菌株中的质粒即含有目标基因。用该基因作为短链醇 筛选标记基因时，区别于其它常用抗性基因标记基因。以质粒为例，现有的以抗性基因作为 标记基因的质粒的多克隆位点与抗性基因标记各自独立，抗生素压力只能筛选质粒是否转 化成功，不能说明质粒是否含有目标插入基因，需要蓝白斑筛选辅助验证目标基因的插入， 且该方法存在较高的假阳性且验证较为繁琐；而用本发明中的短链醇敏感基因作为标记， 将克隆位点和短链醇耐受筛选标记合二为一，单用短链醇压力筛选，短链醇耐受性提高的 即为插入有目标基因的质粒，可以简化筛选步骤并提高目标基因插入验证的正确率。
[0015] 优选地，本发明提供的应用具体为提高微生物短链醇耐受性。在本发明的一些实 施例中，本发明提供的应用中所述针对的微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。在本发明的另外 一些实施例中，本发明提供的应用中所针对的微生物为大肠杆菌时，具体为大肠杆菌W或 其衍生菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所针对的微生物为大肠 杆菌W衍生菌株时，具体为大肠杆菌KOl 1。
[0016] 本发明还提供了一种提高微生物短链醇耐受性的方法，包括：
[0017] 取微生物，敲除短链醇敏感基因，获得重组微生物；
[0018] 该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：
[0019] I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0020] II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序 列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0021] 优选地，本发明提供的方法中的微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。
[0022] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中的微生物为大肠杆菌时，具体为 大肠杆菌W或其衍生菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中的微生物 为大肠杆菌W衍生菌株时，具体为大肠杆菌KOll。
[0023] 优选地，本发明提供的方法中，步骤2中的同源重组所用重组系统为Red重组系 统。
[0024] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆菌W或其 衍生菌株时，包括以下步骤：
[0025] 步骤1 :构建获得包含筛选标记基因和短链醇敏感基因的上、下游同源序列的基 因敲除盒；
[0026] 步骤2 :将步骤1所得基因敲除盒导入大肠杆菌中，通过同源重组，敲除大肠杆菌 中的短链醇敏感基因；
[0027] 该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：
[0028] I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0029] II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序 列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0030] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤1中的筛选标记基因为抗 生素筛选标记基因。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤1中的抗生 素筛选标记基因具体为卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。筛选 标记基因的作用是作为筛选表型。
[0031] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤1中的基因敲除盒包 括筛选标记基因、短链醇敏感基因的上、下游同源序列，在基因敲除盒中的排列顺序为：从 5' -3'依次为短链醇敏感基因的上游同源序列、筛选标记基因、短链醇下游同源序列。
[0032] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆菌KOll或 其衍生菌株时，包括以下步骤：
[0033] 步骤1 :获得具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的上游引物；具有SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列下游引物；
[0034] 步骤2 :取步骤1所得上游引物和下游引物，以质粒pKD13为模板，扩增得到含卡 那霉素抗性基因筛选标记的短链醇敏感基因敲除盒；
[0035] 步骤3 :取含有Red重组酶基因的质粒导入大肠杆菌中，得重组大肠杆菌；
[0036] 步骤4 :取步骤2所得基因敲除盒，导入步骤3所得重组大肠杆菌中，通过同源重 组，敲除大肠杆菌中的短链醇敏感基因。
[0037] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，敲除短链醇敏感基因所用的基 因敲除盒具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
[0038] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆菌W 或其衍生菌株时，步骤3中的质粒具体为质粒pKD46。
[0039] 本发明还提供了一种短链醇耐受性高的重组微生物，该重组微生物为：基因敲除 微生物中的短链醇敏感基因，该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一 个：
[0040] I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0041] II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序 列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0042] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的微生物为大肠杆菌或沙 门氏菌。
[0043] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌为大肠杆 菌W或其衍生菌株。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物为大肠杆菌时，大 肠杆菌W的衍生菌株具体为大肠杆菌KOl 1。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组 微生物为大肠杆菌W或大肠杆菌KOl 1。
[0044] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌为大肠杆 菌W或其衍生菌株时，获得该重组微生物的方法包括如下步骤：
[0045] 步骤1 :构建获得包含筛选标记基因和短链醇敏感基因的上下游同源序列的基因 敲除盒；
[0046] 步骤2 :将步骤1所得基因敲除盒导入大肠杆菌中，通过同源重组，敲除大肠杆菌 中的短链醇敏感基因；
[0047] 该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：
[0048] I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0049] II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序 列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0050] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌为大肠杆 菌W或其衍生菌株时，获得该重组微生物的方法包括以下步骤：
[0051] 步骤1 :获得具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的上游引物；具有SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列下游引物；
[0052] 步骤2 :取步骤1所得上游引物和下游引物，以质粒pKD13为模板，扩增得到含卡 那霉素抗性基因筛选标记的短链醇敏感基因敲除盒；
[0053] 步骤3 :取含有Red重组酶基因的质粒导入大肠杆菌中，得重组大肠杆菌；
[0054] 步骤4 :取步骤2所得基因敲除盒，导入步骤3所得重组大肠杆菌中，通过同源重 组，敲除大肠杆菌中的短链醇敏感基因。
[0055] 本发明提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生 物短链醇耐受性的方法。本发明提供的应用为一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用， 该基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取 代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列 功能相同或相似的核苷酸序列。本发明发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的 耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。在本发明的一些实施例中，实验结果证实，将微生物 中该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组微生物在乙醇中的耐受性，所得重组微生物 对乙醇的耐受性得到显著提高，P < 0. 05。在本发明的另外一些实施例中，实验结果证实， 将微生物中的该基因敲除掉之后，还能够显著提高所得重组菌株在异丙醇或正丁醇中的耐 受性。在本发明的另外一些实施例中，通过以该基因为靶点，敲除该基因之后，获得了短链 醇耐受性高的重组微生物。
[0056] 生物保藏说明
[0057] 菌株KOll Λ espA :分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli于2014年09月 11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0058] (CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所，保藏编号为CGMCC No. 9647。
【专利附图】
【附图说明】
[0059] 图1示实施例1中大肠杆菌E5对乙醇的耐受性能，其中图I-A为大肠杆菌E5、大 肠杆菌KOll在添加不同浓度（0-60g/L)乙醇的含2%葡萄糖的LB培养基中进行生长测试 结果；图I-B为极高浓度乙醇（100g/L)添加对大肠杆菌E5、大肠杆菌KOll的生长影响；
[0060] 图2示实施例1中大肠杆菌KOll敲除36. 6Kb序列后所得重组菌株的正确性验证 结果；
[0061] 图3示实施例1中大肠杆菌D37K、大肠杆菌KOll、大肠杆菌E5,分别在添加5 % (v/v)乙醇的含2%葡萄糖的LB培养基的生长测试结果；
[0062] 图4示实施例1中从36. 6Kb缺失片段中寻找乙醇响应靶基因的过程，以及过程中 的基因敲除菌株的生长测试结果；
[0063] 图5示实施例1中大肠杆菌KOll Λ espA的构建过程中各个菌株的菌落PCR验证 结果；
[0064] 图6示实施例1中大肠杆菌KOll Λ espA对乙醇耐受性的验证实验结果；
[0065] 图7示实施例1中大肠杆菌KOll Λ espA对异丙醇耐受性的验证实验结果；
[0066] 图8示实施例1中大肠杆菌KOll Λ espA对正丁醇耐受性的验证实验结果；
[0067] 图9示实施例2中大肠杆菌W Λ espA的构建过程中各个菌株的菌落PCR验证结 果；
[0068] 图10示实施例2中大肠杆菌W Λ espA对乙醇耐受性的生长测试实验结果；
[0069] 图11示实施例3中espA基因表达盒的构建中重组质粒的正确性验证结果；
[0070] 图 12 示实施例 3 中大肠杆菌 MG1655(pET-espA)、大肠杆菌 BL21 (DE3) (pET-espA) 对乙醇耐受性的生长测试实验结果。
【具体实施方式】
[0071] 本发明公开了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生 物短链醇耐受性的方法本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明内。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用 本发明技术。
[0072] 本发明提供的基因在短链醇耐受上的应用、利用该基因提高微生物短链醇耐受性 的方法中的试剂和原料均可由市场购得。
[0073] 为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施 例，进一步阐述本发明：
[0074] 实施例1短链醇敏感基因的功能的确定
[0075] 实验材料：
[0076] 大肠杆菌KOll :购买自美国菌种保藏中心（ATCC)，菌株编号为ATCC(55124);
[0077] 质粒：pKD13质粒购买于耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心（CGSC) ;pKD46质粒购 买于耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心（CGSC) ;pCP20质粒购买于耶鲁大学的大肠杆菌遗 传保藏中心（CGSC)。
[0078] 10% (v/v)甘油：10mL甘油和90mL去离子水混合制得。
[0079] 添加不同种类抗生素的LB培养基（抗生素种类为氨苄青霉素、卡那霉素）。
[0080] 按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：l〇g/L蛋白胨、5g/L酵母 提取物、5g/L氯化钠，100yg/m L氨节青霉素或50yg/m L卡那霉素。
[0081] 添加不同浓度乙醇的含2%葡萄糖的LB培养基（乙醇含量为0-60g/L、100g/L):
[0082] 按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：20g/L葡萄糖、10g/L蛋 白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、0-60g/L或100g/L的乙醇。
[0083] 添加不同体积浓度的乙醇的含2 %葡萄糖的LB培养基：
[0084] 按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：20g/L葡萄糖、10g/L蛋 白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、不同体积浓度的乙醇。
[0085] 各个引物：由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0086] 实验方法：
[0087] (1)乙醇耐受性大肠杆菌的获得
[0088] 以乙醇生产菌株大肠杆菌KOll为原始菌株，通过随机突变筛选得到乙醇耐受能 力提高的突变大肠杆菌，标记为大肠杆菌E5。
[0089] 取大肠杆菌E5、大肠杆菌K011，在添加不同浓度（0_60g/L)乙醇的含2%葡萄糖的 LB培养基培养，培养24h后，测定0D_，进行生长测试。实验结果如图I-A所示，其中1代 表大肠杆菌E5、2代表原始菌株K011。从实验结果可知，原始大肠杆菌KOll的生长对乙醇 压力非常敏感，在乙醇浓度达到35g/L时，生长即停滞；而突变大肠杆菌E5的生长随着乙醇 压力的升高变化相当平缓，在55g/L的较高乙醇压力下才表现为生长停滞。
[0090] 另外，利用极高浓度乙醇（l〇〇g/L)添加对大肠杆菌E5、大肠杆菌KOll进行短时间 (1分钟，5分钟，10分钟，15分钟）处理以比较细胞存活率。实验结果见图1-B，其中曲线1 为大肠杆菌E5,曲线2为大肠杆菌KOll。从实验结果可知，在乙醇处理1分钟后，大肠杆菌 E5有近70%的存活率，而大肠杆菌KOll只剩不到20%的存活率；乙醇处理15分钟之后， 大肠杆菌E5仍维持27%的存活率，而大肠杆菌KOll几乎全部致死。这些结果充分说明突 变大肠杆菌E5具备较高的乙醇耐受能力。
[0091] (2)与乙醇耐受性相关联的基因的确定
[0092] 为了进一步研究突变大肠杆菌E5在基因组水平上发生了哪些突变，本发明提取 大肠杆菌E5基因组DNA并进行基于离子流（Ion-Torrent)平台的基因组重测序。将大肠 杆菌E5的测序结果与NCBI上公布的大肠杆菌KOll的基因组（GeneBank :CP002516. 1)序 列比对发现：大肠杆菌E5基因组上存在一段长为36. 6Kb的大片段DNA缺失，该缺失位于基 因 EK011_2989(ybjL)和EK011_3039(ybjK)之间，且刚好是一段属于Rybb*W(P2)的完整的 原噬菌体序列。现有技术还没有报道关于这段基因序列中乙醇耐受性相关的靶点。
[0093] 为确认该段缺失是否赋予突变菌株乙醇耐受的表型，通过基因敲除手段，敲除大 肠杆菌KOll基因组中的上述36. 6Kb的片段，然后考察基因敲除后所得重组菌株对乙醇的 耐受能力。具体操作如下：
[0094] 以大肠杆菌KOll基因组为模板，PCR扩增基因敲除上下游同源臂；以质粒pKD13 为模板扩增卡那霉素抗性基因；并用OE-PCR方法将左右同源臂和抗性基因连接构建敲除 盒。扩增各个片段所用模板和引物的对应关系见表1。
[0095] 表136. 6Kb的片段敲除试剂盒的构建中各个引物与扩增片段的对应关系
[0096]
【权利要求】
1. 一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用，所述基因具有I或II所示的核苷酸序列 中的任意一个： I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获 得的核苷酸序列，且与SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短链醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁 醇、异丁醇或丁二醇。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用具体为作为短链醇筛选标记 基因。
4. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用具体为提高微生物短链醇耐 受性。
5. -种提高微生物短链醇耐受性的方法，其特征在于，包括： 取微生物，敲除短链醇敏感性基因，获得重组微生物； 所述短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个： I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获 得的核苷酸序列，且与SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述大肠杆菌为大肠杆菌W或其衍生菌 株时，包括以下步骤： 步骤1 :构建获得包含筛选标记基因和所述短链醇敏感基因的上、下游同源序列的基 因敲除盒； 步骤2 :将所述基因敲除盒导入所述大肠杆菌中，通过同源重组，敲除所述大肠杆菌中 的所述短链醇敏感基因。
8. -种短链醇耐受性高的重组微生物，其特征在于，基因敲除所述微生物中的短链醇 敏感基因，所述短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个： I具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； II具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获 得的核苷酸序列，且与SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
9. 根据权利要求8所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌或沙门氏 菌。
10. -种大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC No. 9647。
【文档编号】C12N1/20GK104278043SQ201410513594
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】元英进, 陈艳, 李炳志, 李霞 申请人:天津大学