一种利用重组大肠杆菌生产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
【专利摘要】公开了一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是指在一定pH值的水溶液中，作用于游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的具有氨基酸酯酰基转移酶的蛋白质的基因片段重组到载体里并转入宿主菌，得到带有重组DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的宿主菌。经过以下阶段(1)培养大量表达氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌细胞；(2)过量表达阶段(1)中的氨基酸酯酰基转移酶；(3)将阶段(2)所得作为粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐底物氨基酸的缓冲溶液中反应，实现L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的高效生产。
【专利说明】一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法
【技术领域】
[0001] -种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，属于微生物基因工程 领域。
【背景技术】
[0002] 谷氨酰胺（Gln)作为特别的免疫营养素成为各领域的研宄热点，尤其在机体应激 状态下对维护免疫功能的完整性和维护肠道结构是无法替代的。因此，认为谷氨酰胺是应 激状态下的"条件必需氨基酸"。但谷氨酰胺水溶性差（36g/L)，在水溶液、热消毒及长期储 存时化学稳定性不足，在加热灭菌的条件下会生成有毒的焦谷氨酸和氨，而含有L-谷氨酰 胺的小肽，具有高热稳定性和水溶性，弥补了 L-谷氨酰胺的不足，扩大了其在临床上作为 静脉营养制剂的应用范围，而L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在稳定性和水溶性上均优于其他含 L-谷氨酰胺的小肽。
[0003] 目前，生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化学合成法、微生物发酵法以及生物 转化法。由于化学合成法在合成过程中需要引入和去除保护基团，合成步骤过多，成本过 高，并且需要用到有毒试剂，不适合工业生产；微生物发酵法成本低廉，环境温和，但是产量 较低，离大规模生产还有一定距离；随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得 微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成为工业上很有前景的生产方法。其中微生物 转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的报道相对较少，其中Yoshinori Hirao等人报导的通 过培养表达氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌酶法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在50L 发酵罐中，以2. OmL/h的速度流加葡萄糖，发酵培养24h，取一定量的发酵液加入到含500mM 底物的IL发酵罐中反应40min，终产量达到67. 9g/L。
【发明内容】
[0004] 针对目前生物转化法获得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成本高，产量较低的缺陷，本发 明要解决的问题是提供一种使含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性 增强的方法。
[0005] 本发明为了高效利用氨基酸酯酰基转移酶生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，提供了一 种使宿主菌中的氨基酸酯酰基转移酶合成基因的拷贝数增加的方法，利用该方法可高效生 产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
[0006] 本发明是一种使含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强 的方法。其特征是：含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统是指在一定pH 值的水溶液中，作用于游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐，生成L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺的具有氨基酸酯酰基转移酶的蛋白质的基因片段重组到载体里并转入进宿主菌，得到 带有重组DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的宿主菌，经过以下阶 段（1)培养大量表达氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌细胞；（2)过量表达阶段（1)中 的氨基酸酯酰基转移酶；（3)将阶段（2)所得作为粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯盐酸盐底物氨基酸的一定pH值的水溶液中反应，实现L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的 尚效生广。
[0007] 上述的氨基酸酯酰基转移酶是在一定pH条件下，可使游离的L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯盐酸盐转化为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶。
[0008] 上述的宿主菌除了大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等属的微生 物菌珠外，还可以使用酵母菌或者动物细胞宿主等。
[0009] 上述的宿主菌以大肠杆菌等作为宿主菌时，氨基酸酯酰基转移酶表达载体在微生 物中独立复制的同时，最好由启动子、核糖体结合序列、氨基酸酯酰基转移酶基因、转录终 止序列组成。
[0010] 上述的宿主菌以大肠杆菌为宿主菌时，表达载体有pET21a、PUC19、pET28a等质 粒。
[0011] 上述的表达载体中启动子可采用Iac启动子、PL、trp启动子、trp串联启动子或 者T7启动子等。
[0012] 上述的表达载体中核糖体结合序列，只要在大肠杆菌等宿主中能表达即可，核糖 体结合位点和起始密码子之前保留适当的距离
[0013] 上述的宿主菌以大肠杆菌为宿主时，可使用大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109、大 肠杆菌BL21 (DE3)、大肠杆菌W3310、大肠杆菌SCSllO等。
[0014] 上述的的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法是通过使宿主菌 中的氨基酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加来实现。
[0015] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法中宿主菌中的氨基 酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加是通过导入经密码子优化后的氨基酸酯酰基转移酶基 因来实现的。
[0016] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产方法，为了获得含有本发明中用到的产酶的 宿主，例如重组棒状杆菌、重组大肠杆菌、重组酵母菌等的细胞培养物，只要其能够在合适 的培养基中培养微生物就可以了，对用于此目的的培养基，只要其能够让微生物正常生长， 就没有特别限制。该培养基可以是含有必要的普通碳源、有机氮无机氮源、磷源、无机离子 和有机营养源的普通培养基。比如，只要该微生物能利用，就能够使用任何碳源，能使用的 碳源的具体实施例，包括糖类诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，醇类包括乙醇、山梨醇 和甘油，有机酸及其盐包括柠檬酸、琥珀酸、乙酸和丙酸，碳氢化合物包括石蜡及其混合物。
[0017] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产方法，能使用的有机氮源实施例包括胰蛋白 胨、酵母膏、牛肉膏、酵母提取物等等，无机氮源诸如硫酸铵和氯化铵，延胡索酸铵盐和柠檬 酸铵盐，另外，培养基中用到的普通氮源，例如无机盐、痕量金属盐和维生素，也能适宜的被 混合和使用。
[0018] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产方法中，作为无机盐可使用磷酸氢二钾、磷 酸二氢钾、硫酸镁等。
[0019] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产方法中，在培养时宿主采用诱导型启动子的 表达质粒时，根据需要在培养基中补加诱导物。如果使用Iac启动子或者T 7启动子的表达 质粒，在培养基中补加乳糖或者IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）等，而使用色氨 酸启动子的表达质粒时，需在培养基中补加吲哚丙烯酸（IAA)。
[0020] 本发明所提供的使含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增 强的方法，具有重要的工业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图L pEAM330质粒图谱
[0022] 图 2. pUC19-phoC-SAET 质粒图谱
[0023] 图3. PCR产物电泳图
【具体实施方式】
[0024] 一般性说明：实施例所提及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒与PCR产 物纯化试剂盒以及胶回收试剂盒均购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进 行。全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0025] LB 培养基（％) :1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1 % NaCl，pH 7. 0-7. 2。
[0026] Amp抗性平板：1%胰蛋白胨，0. 5%酵母抽提物，1% NaCl，1. 5%琼脂糖，氨苄青霉 素 50 μ g/ml〇
[0027] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0· 5M KC1，0. 15M CaC12,0. 25M MgC12。
[0028] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活测定：取0. 5ml的发酵液尚心去上清，加入0. 5mL 含有底物氨基酸的pH = 9. 0的IOOmM硼酸-NaOH缓冲溶液中（底物氨基酸浓度为：IOOmM Gln，和 IOOmM Ala-OMe. HC1)，混匀，25°C反应 5min，加入等体积的 I. 7% (ν/ν)Η3Ρ04溶液终 止反应。用0. 22 μ L的有机系滤膜过滤处理，OPA衍生后用HPLC测定L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺浓度，从而计算出酶活。
[0029] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量测定：取0. 5ml的发酵液离心去上清，加入0. 5mL含 有底物氨基酸的pH = 9的水溶液中（底物氨基酸浓度为：IOOmM Gln，和IOOmM Ala-OMe. HC1)，混匀，25°C反应2h，加入等体积的I. 7% (VZV)H3PO4溶液终止反应。用0. 22 μ L的有 机系滤膜过滤处理，OPA衍生后用HPLC测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺浓度。
[0030] 实施例1 :氨基酸酯酰基转移酶基因序列的设计
[0031] 根据大肠杆菌的密码子使用频率来优化基因密码子，消除低使用率的密码子，同 时利用同义转化方法消除EcoRI酶切位点，为了便于将氨基酸酯酰基转移酶基因连接到其 他质粒载体上，因此在终止子后面插入一个酶切位点BamH I (GGATCC)。
[0032] 考虑到mRNA的二级结构，首先要保证AUG起始密码子及其后的几个碱基组成的密 码子翻译口袋呈打开状态，降低核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着 起始密码子向后翻译。
[0033] 本实施方式中氨基酸酯酰基转移酶基因序列的原始序列，见Genbank ACCESSI0NAB610978,优化后的氨基酸酯酰基转移酶序列见SEQ ID N0:1。
[0034] 实施例2 :磷酸盐启动子的设计
[0035] 磷酸盐启动子来源于PEAM330质粒，质粒图谱如说明书附图1，该质粒的磷酸盐启 动子来源于大肠杆菌K12菌株的磷酸盐操纵子，是一个适合大量积累微生物菌体的弱启动 子，为了便于将磷酸盐启动子和氨基酸酯酰基转移酶连接到质粒载体上，在启动子上游插 入一个EcoR 1酶切位点（GAATTC)，磷酸启动子序列见SEQ ID N0:2。
[0036] 将实施例1方式中优化的氨基酸酯酰基转移酶基因序列和实施例2方式中的磷 酸盐启动子直接相连一起提交给上海旭冠公司人工合成并连接到载体PUC19上，得到质粒 pUC19-phoC-SAET，质粒图谱如说明书附图2。
[0037] 实施例3 :氨基酸酯酰基转移酶基因表达载体的构建
[0038] 以质粒pUC19-phoC-SAET为模板，利用引物
[0039] CAGAAGCTTATGAAAAACACTATAAGCT 和
[0040] CGAGGATCCTTAGTCTTTCAGAACAGAA，进行 PCR 扩增。得到长度为 1800bp 左右的 DNA 片段，PCR产物电泳图如图3所示。
[0041] (I) JM109/pUC19-phoC-SAET 的构建
[0042] 将实施案例1，2中基因合成的质粒pUC19-ph〇C-SAET转化至大肠杆菌JM109感受 态细胞中。转化过程为：将3 μ L连接液加入至50 μ L的JM109感受态细胞中，然后再加入 10 μ L的5 XKCM缓冲液，混匀后，在冰上放置30min后，42。。热激90s，然后在冰上放置5min 后，加入500 μ L的LB培养基，37 °C，220rpm培养60min后，涂布至Amp抗性平板上，培养12h 后，挑取单菌，过夜培养，提取质粒进行验证。然后进一步测序验证基因序列是否正确。从 而得到了构建好的JM109/pUC19-phoC-SAET重组大肠杆菌。
[0043] (? JMl〇9/pUCl9-ptrp2_SAET 的构建
[0044] 本实施方式中色氨酸串联启动子序列为实验室优化并保藏；优化后的色氨酸串联 启动子序列见SEQ ID NO:3
[0045] 将实施案例3中PCR扩增的SAET基因片段和载体pUC19-ptrp2-HYP (由实验室保 藏）用限制性内切酶BamH I、Hind III于37°C酶切2h，电泳，切胶回收目的条带，两片段在 T4连接酶的作用下16°C连接反应16h，得到pUC19-ptrp2-SAET质粒。连接体系为10 μ L :
[0046] 氨基酸酯酰基转移酶基因片段：5 μ L
[0047] pUC19-ptrp2-HYP 胶回收片段：1 μ L
[0048] IOXbuffer ： IyL
[0049] Τ4 DNA Iigase ： IyL
[0050] ddH20: 2 UL
[0051] 16 °C连接过夜后，将3 μ L的连接液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。转化过 程为：将3 μ L连接液加入至50 μ L的JM109感受态细胞中，然后再加入10 μ L的5 X KCM缓 冲液，混匀后，在冰上放置30min后，42°C热激90s，然后在冰上放置5min后，加入500 μ L的 LB培养基，37 °C，220rpm培养60min后，涂布至Amp抗性平板上，培养12h后，挑取单菌，过夜 培养，提取质粒进行验证。然后进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的 pUC19-ptrp2-SAET重组质粒。将测序正确的质粒pUC19-ptrp2-SAET转入大肠杆菌JM109 中，得到构建好的重组大肠杆菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET。
[0052] 实施例4 :L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的检测
[0053] OPA衍生方法：50yL样品，加入200 yL甲醇，200 yL 0· ImM四硼酸钠，加入50yL 的衍生试剂（50mg 0PA，加入4. 5mL甲醇溶解，加入500ul 0. ImM四硼酸钠，加入50 μ L的巯 基乙醇，混匀后置4°C保存），于37°C恒温水浴锅中加热衍生25min。
[0054] HPLC检测方法：日立I HPLC系统（输液泵、荧光检测器，柱温箱，进样器，数字记 录及处理装置），1&七618乂-131^(^(]18(25〇111111\4.6111111，5以111)，操作时柱温控制在40 <€。流 动相：含17 %乙腈的磷酸缓冲液（pH 7. 2)，流速：lmL/min，检测波长：激发波长338nm，发 射波长450nm〇
[0055] 实施例5 :重组菌株的发酵实验
[0056] 摇瓶培养：挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基（含氨苄青霉素 50 48/1^)中，30°〇、220印111培养811后，按5%接种量接入含有251^发酵培养基（2(^/1葡 萄糖，l〇g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L硫酸铵，lg/L磷酸氢二钾，3g/L磷酸二氢钾， 〇. 5g/L硫酸镁）的250mL摇瓶中，在旋转式摇床中22°C、220rpm培养20h。取发酵液测定 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺浓度。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的测定方法详见实施方式一般性说 明。发酵结果显示，重组大肠杆菌JM109/pUC19-ph 〇C-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量 达到29mg/L，重组大肠杆菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量达到 32mg/L〇
[0057]
[0058」
【权利要求】
1. 一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重组大肠杆 菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是通过将具有氨基酸酯酰基转移酶活性的蛋白质的基因片 段重组到载体上并转入微生物细胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重 组微生物。
2. 权利要求1所述的利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在 于通过优化氨基酸酯酰基转移酶基因的密码子，并使重组微生物中的经密码子优化后的氨 基酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加来实现。
3. 权利要求2所述的重组微生物中的氨基酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加是通过 将经密码子优化后的氨基酸酯酰基转移酶基因连接到多拷贝质粒中来实现的。
4. 权利要求3所述的多拷贝质粒包括但不局限于pUC19、pKYPIO等。 5. L-丙氨酰-L-谷氨酰的生产方法，其特征是将权利要求1、2、3所述的重组微生物在 培养基上培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在一定pH值的水溶液 中，作用于游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，再从 该水性介质中提取生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
6. 权利要求5所述的生产方法，其特征是水性介质是一定pH值的水溶液。
7. 权利要求5所述的生产方法，其特征是向水性介质中添加 L-谷氨酰胺和L-丙氨酸 甲酯盐酸盐两个底物。
8. 权利要求5所述的生产方法，其特征在于菌体培养和酶催化反应分两步进行。
9. 权利要求1、2、3、5所述的重组微生物包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假 单胞菌属。
【文档编号】C12R1/19GK104480172SQ201410663050
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】张震宇, 何艳春, 夏紫薇, 王宇婷 申请人:江南大学