专利名称：抗丙型肝炎病毒非结构区4抗原的单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体的制作方法
本申请是1994年8月25日申请的94115017.8号中国专利申请的分案申请。
丙型肝炎是世界性传染病，主要通过输血和血液制品传播。1988年由美国学者首次克隆并表达出了编码丙型肝炎病毒HCV非结构区3～4(NS3～4)部分序列的蛋白质(C-100-3)并相继建立了人工抗原为基础的测定抗体的免疫学方法，对HCV传播的控制起到了很重要的作用。但是，由于HCV病毒分离困难重重，病毒学研究尚未获得突破性进展，由此目前均以抗HCV抗体作为HCV感染的唯一指征。但所用的抗原均为人工合成多肽或基因工程表达的抗原，与自然抗原无论在一级结构还是在空间构型上必然存在着一定的差别。由此加强HCV病毒的深入研究及建立高敏感的抗原抗体测定方法有着非常重要的意义。用抗HCV特异性的单克隆抗体可以构建高敏感特异的抗原抗体测定方法、用于HCV病毒抗原的分离、鉴定以及病毒及病毒感染的基础研究。与HCV特异性的鼠单克隆抗体国内外尚未见诸报道。
本发明的目的是制备抗HCV特异性的鼠单克隆抗体，我们用HCV基因编码的不同抗原成功地制备出了抗HCV的核心区、膜区、NS3、NS4及NS5区抗原的特异性单克隆抗体，从而为HCV的基础研究及应用打下了基础。
一、单克隆抗体细胞株的建立
(一)、抗HCV核心区单克隆抗体细胞株的建立1、免疫原的制备合成核心区多肽[购自美国UBI生物技术有限公司的人工合成多肽(20肽)]2mg、BSA4mg/ml PH7.2,0.1M乙酸铵缓冲液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室温搅拌2小时，在0.02M PH7.2 PBS 4℃透析48小时(12小时时)换液一次，分装，-20℃备用。
2、免疫动物按多肽20μg/只BALB/c小鼠(4-6周龄)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐剂(FCA)乳化后，四脚掌及皮下多点注射。4周后同剂量抗原加弗氏不完全佐剂乳化后腹腔加强，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效价测定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸缓冲液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃ 2小时4℃过夜。次日，10％牛血清1％脱脂奶粉0.02MPH7.2 PBS 0.15ml/孔，37℃,2小时，4℃过夜，用于鼠血清效价测定。
鼠血清用10％牛血清PBS(同上)以102～106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔37℃,2小时，水洗六次后加入2,000倍稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠(Sigma),37℃2小时同上洗后，加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％(V/V)双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，0.1ml/孔，室温避光20分钟，测492吸收值，免前鼠血清作阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的效价。
4、细胞融合建株末次加强后，无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞按10∶1混合，用分子量6,000的PEG作为融合剂，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml浓度时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体的情况；分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用10％DMSO的培养液配制106/ml细胞，细胞融合一次共建6株稳定分泌抗体细胞株。分别命名JDSHCC39(CCTCC NO:C94005),JDSHCC58,JDSHCC81,JDSHCC105,JDSHCC123,JDSHCC221细胞系。
(二)、抗HCV膜区单克隆抗体细胞株的建立1、免疫原的制备将合成多肽(购自美国UBI生物技术有限公司的人工合成多肽)2mg、BSA4mg/ml,PH7.20.1M乙酸铵缓冲液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室温搅拌2小时，在0.02M PH7.2,PBS 4℃透析48小时(12小时)换液一次，分装，-20℃备用。
2、免疫动物按多肽20μg/只BALB/c小鼠(4-6周龄)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐剂(FCA)乳化后，四脚掌及皮下多点注射。4周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂乳化后腹腔加强，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效价测定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸缓冲液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小时4℃过夜，次日，10％牛血清1％脱脂奶粉0.02MPH7.2PBS 0.15ml/孔，37℃,2小时，4℃过夜，用于鼠血清效价测定。
鼠血清用10％牛血清PBS(同上)以102～106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔37℃,2小时，水洗六次后加入2,000倍稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠(Sigma),37℃2小时同上洗后，每孔加100ul底物液(0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％(V/V)双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液)，室温避光20分钟，测492nm吸收值，免前鼠血清作阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的效价。
4、细胞融合建株末次加强后，无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞按10∶1混合，用分子量6,000的PEG作为融合剂，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml浓度时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体的情况；分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，10％DMSO的培养液配制细胞至106/ml液氮冻存。细胞融合一次共建4株稳定分泌抗体细胞株。分别命名为JDSHCE-44,JDSHCE-56,JDSHCE-125(CCTCC NO:C94009),JDSHCE-246细胞系。
(三)、抗HCVNS3区单克隆抗体细胞株建立1．免疫动物按抗原[购自日本东燃公司基因工程抗原(MW:20KD)]20μg/只BALB/c小鼠(4-6周龄)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐剂(FCA)乳化后,四脚掌及皮下多点注射。4周后同剂量抗原加弗氏不完全佐剂乳化后腹腔加强，一周后小鼠眼球放血。
2、免疫效价测定配制5ug/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸缓冲液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小时4℃过夜，次日，10％牛血清1％脱脂奶粉0.02MPH7.2 PBS 0.15ml/孔，37℃,2小时，4℃过夜，用于鼠血清效价测定。
鼠血清用10％牛血清PBS(同上)以102～106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔37℃,2小时，水洗六次后加入2,000倍稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠(Sigma),37℃2小时同上洗后，加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％(V/V)双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，0.1ml/孔，室温避光20分钟，OD492测定吸收值，免前鼠血清作阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的效价。
3、细胞融合建株末次加强后的小鼠无菌取脾脏，制成脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞按10∶1混合，用分子量6,000的PEG作为融合剂，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml浓度时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体的情况；分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，10％DMSO的培养液配制细胞至106/ml液氮冻存。细胞融合一次共建5株稳定分泌抗体细胞株。分别命名JDSHCNS3-1(CCTCC NO:C94006),JDSHCNS3-3,JDSHCNS3-6,JDSHCNS3-8,JDSHCNS3-9.
(四)、抗HCVNS4区单克隆抗体细胞株建立1、免疫原的制备合成多肽[购自加拿大Yes公司的人工合成多肽(25肽)]2mg、BSA4mg/ml PH7.2 0.1M乙酸铵缓冲液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室温搅拌2小时，0.02M PH7.2 PBS4℃透析48小时(12小时)换液一次，分装，-20℃备用。
2、免疫动物按多肽20ug/只BALB/c小鼠(4-6周龄)，0.25ml加0.25ml福氏完全佐剂(FCA)乳化后，四脚掌及皮下多点注射。4周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂乳化后腹腔加强，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效价测定配制5ug/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸缓冲液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃ 2小时4℃过夜，次日，10％牛血清1％脱脂奶粉0.02MPH7.2 PBS 0.15ml/孔，37℃,2小时，4℃过夜，用于鼠血清效价测定。
鼠血清用10％牛血清PBS(同上)以102～106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔37℃,2小时，水洗六次后加入2,000倍稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠(Sigma),37℃2小时同上洗后，加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％(V/V)双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，0.1ml/孔，室温避光20分钟，OD492测定吸收值，免前鼠血清作阴性对照,以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的效价。
4、细胞融合建株
末次加强后，无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞按10∶1混合，用分子量6,000的PEG作为融合剂，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml浓度时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体的情况；分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，10％DMSO的培养液配制细胞至106/ml液氮冻存。细胞融合一次共建3株稳定分泌抗体细胞株。分别命名为JDSHCNS4-93(CCTCC NO:C94007),JDSHCNS4-40,JDSHCNS4-13。
(五)抗HCVNS5区单克隆抗体细胞株建立1、免疫原的制备合成多肽[购自美国UBI生物技术有限公司的人工合成多肽(20肽)]2mg、BSA4mg/mlPH7.2 0.1M乙酸铵缓冲液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室温搅拌2小时，0.02M PH7.2 PBS4℃透析48小时(12小时)换液一次，分装，-20℃备用。
2、免疫动物按多肽20ng/只BALB/c小鼠(4-6周龄)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐剂(FCA)乳化后，四脚掌及皮下多点注射。4周后同剂量抗原加弗氏不完全佐剂乳化后腹腔加强，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效价测定配制5ug/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸缓冲液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃ 2小时4℃过夜，次日，10％牛血清1％脱脂奶粉0.02M PH7.2 PBS 0.15ml/孔，37℃,2小时，4℃过夜，用于鼠血清效价测定。
鼠血清用10％牛血清PBS(同上)以102～106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔37℃,2小时，水洗六次后加入2,000倍稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠(Sigma),37℃2小时同上洗后，加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％(V/V)双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，0.1ml/孔，室温避光20分钟，测492nm吸收值，免前鼠血清作阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的效价。
4、细胞融合建株末次加强后，无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞按10∶1混合，用分子量6,000的PEG作为融合剂，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml浓度时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体的情况；分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，10％DMSO的培养液配制细胞至106/ml液氮冻存。细胞融合一次共建2株稳定分泌抗体细胞株。分别命名为JDSHCNS5-1(CCTCC NO:C94008),JDSHCNS5-2。二、单克隆抗体的制备及HRP标记(一)抗HCV核心区单克抗隆抗体1、单克隆抗体的制备及纯化收集培养细胞计数配成5×106/ml的浓度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同时注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后采集腹水3,000转离心30分钟，取上清为单抗腹水；以1倍体积的腹水加2倍体积的PH4.0 0.06M乙酸缓冲液，按3.3％(V/V)滴加正辛酸，室温搅拌20分钟，10,000转离心20分钟，上清过滤后中性PBS 4℃透析过夜；次日按25.8％的浓度加入所需的固体硫酸铵4℃≥2小时，3,000转离心20分钟，沉淀用1倍体积的中心P8S溶解加1/2体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用1/2体积的中性PBS溶解，同液体4℃透析8小时(12小时换液一次)。Lowry法测蛋白的浓度后分装-20℃保存。2、HRP-单克隆抗体结合物制备4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M过碘酸钠氧化20分钟，中性PBS4℃透析过夜，次日加25ul 0.2M碳酸钠后加预先用PH9.60.01M碳酸缓冲液平衡的10mg单抗，室温避光搅拌2小时，加0.1ml4mg/ml的硼氢化钠，4℃2小时，中性PBS 4℃透析过夜，次日加等体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用50％硫酸铵洗两次后，1ml中性PBS溶解，-20℃备用。(二)抗HCV膜区单克隆抗体1、单克隆抗体制备及纯化收集培养细胞计数配成5×106/ml的浓度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同时注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后采集腹水3,000转离心30分钟，取上清为单抗腹水；以1倍体积的腹水加2倍体积的PH4.0 0.06M乙酸缓冲液，按3.3％(V/V)滴加正辛酸，室温搅拌20分钟，10,000转离心20分钟，上清过滤后中性PBS 4℃透析过夜；次日按25.8％的浓度加入所需的固体硫酸铵4℃≥2小时，3,000转离心20分钟，沉淀用1倍体积的中性PBS溶解加1/2体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用1/2体积的中心PBS溶解，同液体4℃透析48小时(12小时换液一次)。Lowry法测蛋白的浓度后分装-20℃保存。2、HRP-单克隆抗体结合物制备4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M过碘酸钠氧化20分钟，中性PBS4℃透析过夜，次日加25ul 0.2M碳酸钠后加预先用PH9.60.01M碳酸缓冲液平衡的10mg单抗，室温避光搅拌2小时，加0.1ml4mg/ml的硼氢化钠，4℃2小时，中性PBS 4℃透析过夜，次日加等体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用50％硫酸铵洗两次后，1ml中性PBS溶解，-20℃备用。(三)抗HCVNS3区单克隆抗体1、单克隆抗体制备及纯化收集培养细胞计数配成5×106/ml的浓度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同时注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后采集腹水3,000转离心30分钟，取上清为单抗腹水；以1倍体积的腹水加2倍体积的PH4.0 0.06M乙酸缓冲液，按3.3％(V/V)滴加正辛酸，室温搅拌20分钟，10,000转离心20分钟，上清过滤后中性PBS 4℃透析过夜；次日按25.8％的浓度加入所需的固体硫酸铵4℃≥2小时，3,000转离心20分钟，沉淀用1倍体积的中心PBS溶解加1/2体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用1/2体积的中性PBS溶解，同液体4℃透析48小时(12小时换液一次)。Lowry法测蛋白的浓度后分装-20℃保存。2、HRP-单克隆抗体结合物制备4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M过碘酸钠氧化20分钟，中性PBS4℃透析过夜，次日加25ul 0.2M碳酸钠后加预先用PH9.60.01M碳酸缓冲液平衡的10mg单抗，室温避光搅拌2小时，加0.1ml4mg/ml的硼氢化钠，4℃2小时，中性PBS 4℃透析过夜，次日加等体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用50％硫酸铵洗两次后，1ml中性PBS溶解，-20℃备用。(四)抗HCVNS4区单克隆抗体1、单克隆抗体制备及纯化收集培养细胞计数配成5×106/ml的浓度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同时注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后采集腹水3,000转离心30分钟，取上清为单抗腹水；以1倍体积的腹水加2倍体积的PH4.0 0.06M乙酸缓冲液，按3.3％(V/V)滴加正辛酸，室温搅拌20分钟，10,000转离心20分钟，上清过滤后中性PBS 4℃透析过夜；次日按25.8％的浓度加入所需的固体硫酸铵4℃≥2小时，3,000转离心20分钟，沉淀用1倍体积的中性PBS溶解加1/2体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用1/2体积的中性PBS溶解，同液体4℃透析48小时(12小时换液一次)。Lowry法测蛋白的浓度后分装-20℃保存。2、HRP-单克隆抗体结合物制备4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M过碘酸钠氧化20分钟，中性PBS4℃透析过夜，次日加25ul 0.2M碳酸钠后加预先用PH9.60.01M碳酸缓冲液平衡的10mg单抗，室温避光搅拌2小时，加0.1ml4mg/ml的硼氢化钠，4℃2小时，中性PBS 4℃透析过夜，次日加等体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用50％硫酸铵洗两次后，1ml中性PBS溶解，-20℃备用。(五)抗HCVNS5区单克隆抗体1、单克隆抗体制备及纯化收集培养细胞计数配成5×106/ml的浓度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同时注射液体石蜡0.5ml/只，7～10天后采集腹水3,000转离心30分钟，取上清为单抗腹水；以1倍体积的腹水加2倍体积的PH4.0 0.06M乙酸缓冲液，按3.3％(V/V)滴加正辛酸，室温搅拌20分钟，10,000转离心20分钟，上清过滤后中性PBS 4℃透析过夜；次日按25.8％的浓度加入所需的固体硫酸铵4℃≥2小时，3,000转离心20分钟，沉淀用1倍体积的中心PBS溶解加1/2体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用1/2体积的中性PBS溶解，同液体4℃透析48小时(12小时换液一次)。Lowry法测蛋白的浓度后分装-20℃保存。2、HRP-单克隆抗体结合物制备4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M过碘酸钠氧化20分钟，中性PBS4℃透析过夜，次日加25ul 0.2M碳酸钠后加预先用PH9.60.01M碳酸缓冲液平衡的10mg单抗，室温避光搅拌2小时，加0.1ml4mg/ml的硼氢化钠，4℃2小时，中性PBS 4℃透析过夜，次日加等体积的饱和硫酸铵，4℃2小时，3,000转离心30分钟，沉淀用50％硫酸铵洗两次后，1ml中性PBS溶解，-20℃备用。三、单克隆抗体的免疫学性状分析(一)抗HCV核心区单克隆抗体1、特异性测定用不同区域的抗原同上免疫效价测定法测定。结果发现，与核心区抗原反应外，与HCV其它区域抗原及对照抗原无特异性反应。2、单克隆抗体识别位点测定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小时后，加单抗腹水50μl及HRP标记的单抗50μl,37℃1小时后，加底物液，测492nm吸收值，以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率，及抑制率为(1-测定值OD/阴性对照OD)×100；抑制率≥75％为相关，≥50％为不完全相关，≤50％为不相关，≤25％为完全不相关。表2结果提示，6株单抗识别三个不完全相关抗原相关区域。3、单抗类及亚类测定30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃2小时，3,000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1％的琼脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果单抗均为IgG1。4、单抗识别自然抗原位点的分析同上固相抗原，50ulHCV核心区抗体阳性病人血清，50ulHRP标记的单抗，37℃2小时。同上加显色液测492nm吸收值，阳性血清抑制率计算同上位点分析；≥50％的抑制为阳性。结果16份HCV核心区抗体阳性血清对三组抗体均显示了不同程度的阳性抑制率，由此显示自然感染后的抗体可抑制单抗与人工抗原的反应，因此提示此三株单抗所识别的位点也存在于自然抗原上(见表3)。(二)抗HCV膜区单抗1、特异性测定用不同区域的抗原同上免疫效价测定法测定。结果显示抗体与膜区抗原反应外，与HCV其它区域抗原及对照抗原无特异性反应(见表1)。2、单抗识别位点测定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小时后，加单抗腹水50μl及HRP标记的单抗50μl,37℃1小时后，加底物液，测492nm吸收值，以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率，及抑制率为(1-测定值OD/阴性对照OD)×100；抑制率≥75％为相关，≥50％为不完全相关，≤50％为不相关，≤25％为完全不相关，结果4株单抗识别二个不完全相关抗原相关位区。3、单抗类及亚类测定30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃2小时，3,000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1％的琼脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果所有抗体均为鼠IgG1。(三)抗HCVNS3区单抗1、特异性测定用不同区域的抗原同上免疫效价测定法测定。结果与NS3区抗原反应外，与HCV其它区域抗原及对照抗原无特异性反应(见表1)。2、单抗识别位点测定5ug/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小时后，加单抗腹水50ul及HRP标记的单抗50ul,37℃1小时后，加底物液，测492nm吸收值，以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率，即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照OD)×100；抑制率≥75％为相关；≥50％为不完全相关，≤50％为不相关，≤25％为完全不相关。结果5株单抗识别两个不完全相关抗原位区。3、单抗类及亚类测定30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃2小时，3,000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1％的琼脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果所有单抗均为鼠IgG1。4、单抗识别自然抗原位点的分析同上固相抗原，50ulHCVNS3区抗体阳性病人血清，50ulHRP标记的单抗，37℃2小时。同上加显色液测492nm吸收值，阳性血清抑制率计算同上位点分析；≥50％的抑制为阳性。结果19份HCVNS3区抗体阳性血清对两组抗体均显示了不同程度的阳性抑制率，由此显示自然感染后的抗体可抑制单抗与人工抗原的反应，因此提示此两组单抗所识别的位点也存在于自然抗原上。(四)抗HCVNS4单抗1、特异性测定用不同区域的抗原同上免疫效价测定法测定。结果显示与NS4区抗原反应外，与HCV其它区域抗原及对照抗原无特异性反应(见表1)。2、单抗识别位点测定5ug/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小时后，加单抗腹水50ul及HRP标记的单抗50ul,37℃1小时后，加底物液，测492nm吸收值，以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率，即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照OD)×100；抑制率≥75％为相关；≥50％为不完全相关，≤50％为不相关，≤25％为完全不相关。结果4株单抗识别两个不完全相关抗原位区。3、单抗类及亚类测定30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃2小时，3,000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1％的琼脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果所有单抗均为鼠IgG1。4、单抗识别自然抗原位点的分析同上固相抗原，50ulHCVNS4区抗体阳性病人血清，50ulHRP标记的单抗，37℃2小时。同上加显色液测492nm吸收值，阳性血清抑制率计算同上位点分析；≥50％的抑制为阳性。结果显示份HCVNS4区抗体阳性血清对两组抗体均显示了不同程度的阳性抑制率，由此显示自然感染后的抗体可抑制单抗与人工抗原的反应，因此提示此两组单抗所识别的位点也存在于自然抗原上。(五)抗HCVNS5区单抗1、特异性测定用不同区域的抗原同上免疫效价测定法测定。结果与NS5区抗原反应外，与HCV其它区域抗原及对照抗原无特异性反应(见表1)。2、单抗识别位点测定5ug/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小时后，加单抗腹水50ul及HRP标记的单抗50ul,37℃1小时后，加底物液，测492nm吸收值，以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率，即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照OD)×100；抑制率≥75％为相关；≥50％为不完全相关，≤50％为不相关，≤25％为完全不相关。结果3株单抗识别两个不完全相关抗原位区。3、单抗类及亚类测定30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃2小时，3,000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1％的琼脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果显示3株单抗均为鼠IgG1。4、单抗识别自然抗原位点的分析同上固相抗原，50ulHCVNS5区抗体阳性病人血清，50ulHRP标记的单抗，37℃2小时。同上加显色液测492nm吸收值，阳性血清抑制率计算同上位点分析；≥50％的抑制为阳性。结果显示份HCVNS5区抗体阳性血清对两组抗体均显示了不同程度的阳性抑制率，由此显示自然感染后的抗体可抑制单抗与人工抗原的反应，因此提示此两组单抗所识别的位点也存在于自然抗原上。四、单抗的应用研究(一)抗HCV核心区单抗1、抗原测定40ug/ml单抗0.01M PH9.6 CB 0.1ml/孔，加入血清，0.1ml/孔，37℃2小时后再加HRP标记的单抗，加显色液测492nm吸收值，以工作液作阴性对照，测定值/对照值≥2.1判为阳性。结果显示用第一组单抗测定96份高危人血清，5份显示了阳性结果，由此提示病人血清中存在有可测得出的抗原，同时也提示此单抗有很大的应用价值(见表6)。2、抗体测定5ug/ml抗原0.01M PH9.6 CB 0.1ml/孔加50ul待检人血清，50ulHRP标记单抗同上测492nm吸收值，计算抑制率，≥50％为阳性。结果酶标记单抗显示仅96份HCV抗体阳性血清有50％的血清抑制单抗与抗原的反应≥50％，这些血清经间接ELISA证实均含有抗HCV核心区单抗，由此提示单抗在抗HCV抗体检测中特异性高，操作简便，有一定的应用价值(见表3)。
应用研究结果提示我们用HCV不同区段的人工抗原制备出了识别HCV天然抗原的特异性单抗，我们所获得的单抗不仅在HCV基础研究，而且在HCV抗原抗体检测试剂中均有很高的应用价值。1，应用某一区段的单抗可准确地分析病人血清中的此类抗体的消长情况，以了解病情的发展愈后及治疗效果的考察。2，各不同区域单抗混合，构建抗原抗体筛选检测试剂盒，其操作简便，快速；且特异性也有很大的提高。3，用单抗直接或间接测定或定位HCV感染后的病毒抗原。4，单抗交联Sepharose-4B后亲和层析纯化分离体液或组织中的HCV抗原成份，分析研究天然抗原，取代人工抗原，促进HCV的基础研究，提高现有检测试剂盒的特异性。5，用单抗分析不同国家、不同地区以致不同感染者HCV感染后的抗原，确定HCV的型别以提高HCV治疗的效果。6，用同一区域识别不同位点的单抗分析感染者，识别某一位点的抗体消长情况，以了解HCV与感染者之间关系及感染者的免疫应答情况。7，用特异性HCV单抗制备抗独特型抗体，用作疫苗的制备及取代现有的人工抗原。8，用单抗检测群体感染者中HCV不同抗原成份的变化，以了解HCV变异情况。9，具有中和作用的单抗可用作HCV感染者的治疗，及高危人群的预防治疗。10，单抗固相在合适的载体上浓缩分离HCV病毒颗粒，以提高HCV病毒分离培养的可能性。11，用已知单抗探讨相应的HCV基因区编码的蛋白质的功能。
表1抗HCV单克隆抗体组份特异性测定单抗抗原核心区 膜区 NS3 NS4 NS5JDSHCC39+ ----JDSHCC58+ ----JDSHCC81+ ----JDSHCC105 + ----JDSHCC123 + ----JDSHCC221 + ----JDSHCE-44 - +---JDSHCE-56 - +---JDSHCE-125 - +---JDSHCE-246 - +---JDSHCNS3-1 - -+--JDSHCNS3-3 - -+--JDSHCNS3-6 - -+--JDSHCNS3-8 - -+--JDSHCNS3-9 - -+--JDSHCNS4-93 - --+-JDSHCNS4-40 - --+-JDSHCNS4-13 - --+-JDSHHCNS5-1 - ---+JDSHCNS5-2 - ---+
表2单抗对不同来源的核心区抗原反应性测定单抗抗原N.J C11 J.Core CP10 CP9JDSHCC39 +++ --JDSHCC58 +++ --JDSHCC81 +++ --JDSHCC105 ++- --JDSHCC123 +++ ++JDSHCC221 +++ ++N.J、C11、J.Core为基因工程抗原CP10、CP9日本合成多肽抗原表3竟争抑制法测定抗体结果抑制率(％)阳性血清(份)阴性血清(份)0-9 4 3410-19 7 1320-29 9 2430-39 6 1540-49 20 1050-59 28 0≥60 22 0计60/960.96
表4膜区单抗对不同肽段抗原反应的测定单抗 抗原肽A 肽BJDSHCE-44 +-JDSHCE-246+-JDSHCE-56 -+JDSHCE-125-+表5抗NS3区单抗识别位点测定酶标单抗(抑制率％)单抗腹水NS3-1 NS3-3 NS3-6 NS3-8 NS3-9NS3-1 90.5 87.3 94.2 068.8NS3-3 85.0 96.5 92.7 059.6NS3-6 91.7 95.1 89.7 066.2NS3-8 86.0 95.8 83.6 95.6 91.9NS3-9 91.2 94.0 97.6 086.3
表6HCV抗原测定结果P/N比值样品(份)≤1.0351.1-2.0 56≥2.15计 5/9权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，CCTCC保藏号为C94007，其特征在于能分泌抗HCV NS4区的单克隆抗体。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该抗体特异性地抗HCV NS4区。
全文摘要
本发明建立了能分泌分别与非甲非乙型肝炎病毒的核心区、膜区、NS3、NS4及NS5区抗原具特异性的单克隆抗体的5个杂交瘤细胞株,并且得到了由这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。用这些抗HCV的特异性单克隆抗体可以构建高敏感特异的抗原抗体测定方法,并且可以分离、鉴定HCV病毒抗原。
文档编号C12N5/20GK1230591SQ9811711
公开日1999年10月6日 申请日期1998年7月31日 优先权日1998年7月31日
发明者李德富, 尹红章, 李秀华, 孟淑芳, 刘荧, 张宁 申请人:中国药品生物制品检定所