专利名称：一种重组人白细胞介素－11的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及人白细胞介素-11本身或含有IL-11的制剂作为治疗癌症化疗引起的血小板减少症的药物。
白细胞介素-11是1990年S.R.Paul等在研究骨髓基质细胞在体外长期培养体系中对造血干细胞重建的支持作用时发现并分离出的一种新的细胞因子，该因子在体外可以刺激IL-6依赖的鼠浆细胞瘤细胞系T11 65的增殖。IL-11对骨髓造血组织有着多种效应，IL-11与其它一些在细胞增殖分化不同阶段先后发生作用的细胞因子协同作用，可以刺激原始干细胞及不同来源的多潜能和定向祖细胞在不同培养系统中的增殖；IL-11单独使用或与其它细胞因子协同，对红细胞生成的多个阶段均有刺激作用；对髓系祖细胞的分化成熟及B淋巴细胞的发育也有促进作用；但其对造血组织的最为显著的影响是促进巨核细胞和血小板的生成，这一效应在包括鼠、非人灵长目动物及人在内的影响包括体外、体内试验中均得到证实。进一步研究发现IL-11对许多非造血组织也具有显著的生物学效应，在脑、脊索神经元、肠道及睾丸组织中均检测到IL-11的表达和活性。
白介素-11体内单独使用在小鼠、大鼠、狗和灵长类动物中均表现出特定的生物效应。在正常小鼠中主要作用于巨核细胞系细胞，可以增加巨核细胞祖细胞的数量、刺激巨核细胞胞内复制及剂量依赖性地升高外周血小板计数。在非人灵长类动物中也表现出相似的活性，给药动物外周血小板计数升高达300％。在几个化疗、放疗引起的重度骨髓抑制模型和骨髓移植模型中，使用rhIL-11可刺激多系造血作用。在这些模型中均观察到血小板恢复加快，其中一些模型中还观察到中性粒细胞和红细胞恢复的增强。这些临床前研究结果再次证实了体外实验中IL-11所表现出的广泛生物学活性，提示IL-11可能是一种有效的治疗癌症化疗及骨髓移植后骨髓抑制及血小板减少的药物。
国外思路是通过融合蛋白的形式，在N末端带上一个有或无功能的蛋白或多肽，提高杂交蛋白的表达量，再利用特异的蛋白酶将N末端前附加的蛋白或多肽切除即可获得天然序列的目标蛋白IL-11(Du et alBlood,893897-3908，1997)。美国Genetic Institute生产的rhIL-11即采用上述思路设计，其表达产物为一种硫氧化还原蛋白的融合蛋白，需要经肠激肽酶切割才能获得终产品，最大问题是须用大量的价格昂贵的肠激肽酶。
我们采用的是改变5′端核苷酸序列的第一种思路，经过实施取得了良好的效果。游离表达的一个缺陷是N端经常会有多余的甲硫氨酸，而N末端Met可以被E.coli内的甲硫氨酸氨肽酶切除，Sherman等(Bio Essays,19853,27-31)曾报导在原核和真核细胞中，表达蛋白若第一位氨基酸残基的旋转半径在1.22埃或更小(如Gly或Ala)时，则N末端Met可被甲硫氨酸酶有效的切除。以Gly起始。由于N末端不含甲硫氨酸，因而IL-11大剂量使用时不会导致体内产生抗体，影响疗效。
本发明采用下述技术方案(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人IL-11基因5′端含大肠杆菌偏爱密码子的DNA片段，它可以在不改变产物人IL-11的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高IL-11基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤首先在5′和3′端引物引导下，自人骨髓基质细胞KW102细胞总RNA中扩增出特异的人IL-11 cDNA片段。将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成IL-11表达质粒pIL-11。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使IL-11占菌体总蛋白的20％左右，表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用ZYT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达20左右，生物量为每升培养物20-25g，产物表达率在20-25％之间。产物表达量可达每升培养物200mg以上。
(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和包涵体抽提、凝胶排阻层析、复性和阳离子交换层析精制等。
所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点①通过包涵体的洗涤去除了大部分杂质，这对以后的进一步纯化非常有利，抽提液中白介素-11含量及浓度高，有利于在第一步使用凝胶排阻层析纯化；②第一步层析纯化由于抽提物中白介素-11占总蛋白量的50％左右，而且杂质大多为分子量＞30kd的蛋白，经本步纯化后蛋白纯度可达90％以上；③在第一步凝胶排阻层析后复性，复性浓度为1mg/ml，复性中保持一定浓度的NaCl或甘氨酸，以防白介素-11蛋白聚合及沉淀，同时保持较高的活性水平；④最后一步离子交换层析采用常压填料，处理量大，活性回收率高，同时去除了热原及核酸、磷脂、脂多糖，该步的要点是要在整个纯化过程中应加一定浓度的甘氨酸(我们工艺中甘氨酸的浓度为0.15M)。本工艺对三批各22.5L发酵产物纯化后每批可得纯品2.9-3.3g，0.75mg规格成品可分装300支以上。
(4)纯品加入药用甘氨酸以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于癌症化疗等原因引起的血小板减少症的治疗。
本品在体外能刺激IL-11和IL-6依赖株7TD-1和B9-11细胞增殖，据此可以测定IL-11的生物活性。
效力实验研究内容包括rhIL-11体外对人正常骨髓造血祖细胞集落形成的影响；皮下注射对正常Balb/C雄性小鼠外周血小板及造血祖细胞集落形成的影响；对60Co全身照射及卡铂腹腔注射所致血小板减少症的治疗作用；对卡铂静脉滴注所致猕猴血小板减少症的治疗作用；血小板功能指标及其动态变化。
结果表明皮下注射rhIL-11可明显地减轻照射及卡铂注射所导致的外周血小板计数的下降程度，促进血小板计数的恢复。100-400μg/kg/天注射小鼠，50-100μg/kg/天注射猴都有良好的疗效，疗后13-15天血小板计数恢复到照射前水平，恢复时间较模型对照组明显提前，延长治疗可使血小板计数超过正常水平，剂量加大恢复时间提前，rhIL-11效力的强弱与血小板减少程度有关，血小板减少明显时疗效更显著；rhIL-11对正常小鼠也能明显提高血小板计数，体外对人和小鼠骨髓粒系、红系、巨核系祖细胞形成均有明显作用，但体内注射对外周血白细胞、红细胞无明显影响。新产生的血小板功能正常。
本发明运用重组DNA技术，在不改变编码氨基酸的前提下，改变基因5′端部分核苷酸，从而提高了产物的表达，且产物以疏松的包涵体形式存在，分子易于变性复性。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于实验性血小板减少症的治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实例进行说明实施例1、PCR引物设计及人IL-11基因扩增人IL-11蛋白质分子由178个氨基酸残基构成，其中N末端Pro缺失后以Gly起始，N末端个氨基酸列是Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg，由于原基因5′端序列GC含量太高，不利于在原核系统中表达，因此本设计首要思想是降低5′端GC含量，设计后的5′端引物序列是EcoRⅠ5′-CG GAATTC ATG GGT CCA CCA CCT GGT GGT CCA CCT3′端引物序列为SmaⅠ5′-CCC GGG TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG-3′
采用固相亚磷酸三酯法合成上述两条寡聚脱氧核糖核苷酸，制备胶电泳分离纯化。
采用微量异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自人骨髓来源的基质传代细胞系KW102细胞中纯化总RNA，使A260/A280比值＞1.8，取10μl(约5μg)总RNA，加50pmol 3′端引物，70℃热变性5min，室温冷却使其自然降温，待降至室温后，42℃水浴中依次加入下列样品反转录反应体系5×反转录缓冲液5μlRNA酶抑制剂20U40nM焦磷酸钠 3μlAMV逆转录酶15U(1μl)dNTP(各2.5mM) 2μl加无RNA酶水至 25μl上述混合物42℃水浴反应60min，加H2O 75μl 70℃作用5min灭活反转录酶，该反应物可作为PCR扩增的起始模板，取反转录产物20μl，加入下列成分10×PCR缓冲液 10μldNTP(各2.5mM) 16μl5′和3′两侧引物各40pmol加H2O至 99.5μl上述混合物95℃，2min后加入0.5μl Tap DNA聚合酶2.5U，混匀，95℃变性61℃退火、72℃延伸反应各60秒，进行35个循环的扩增反应后延伸8min，取反应物进行电泳鉴定观察到0.55kb的单一条带，符合完整的人IL-1l基因的长度，并且能与标记的5′端引物杂交。
实施例2、人IL-11基因在大肠杆菌中的表达及序列分析用限制性内切酶EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切0.55kb的PCR扩增产物和表达载体质粒pBV220，经琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收0.55kb和3.66kd的DNA片段。两片段等摩尔混合，T4DNA连接酶12～16℃连接反应过夜，连接物转化入CaCl2处理的E.coli大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素筛选培养。挑选单个菌落，制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，含有人IL-11基因片段并且插入方向正确者，命名为pIL-11，相应的工程菌命名为pIL-11/DH5α。
含有以上表达质粒的工程菌经过扩增培养、温度诱导，在19kd左右多出一条蛋白条带。该蛋白能与人IL-11单克隆抗体呈显特异反应。
在测序引物引导下，分别自两测对插入的人IL-11基因片段进行DNA序列分析，肯定了所扩增的PCR产物符合设计构想，其编码的氨基酸序列与人IL-11序列相同(测得的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见表1)。
实施例3、人IL-11的发酵生产工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到OD600为2.0时，将温度升至42℃，此时IL-11即诱导产生，4h后收集菌体。在表达的不同时机加氮源、碳源等营养素。最终发酵产物密度可达20，生物量为每升培养物20-25g。电泳鉴定IL-11表达水平，薄层扫描显示IL-11占菌体总蛋白的20％之间。
实施例4、工程菌的保存及稳定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用软琼脂LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定，结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例5、IL-11的分离纯化人IL-11在菌体内以疏松的包涵体形式存在，菌体破碎后回收、纯化包涵体，5M尿素抽提后上清首先经过凝胶排阻层析初步纯化，复性后IL-11再经阳离子交换层析精制，可以较快速地得到IL-11纯品。
凝胶排阻层析柱Sephacryl S-200经50mM PB,pH7.0,1mM EDTA-Na2,5M尿素平衡后上样，上样后分步收集19kd的IL-11，初步纯化后的IL-11用分步透析法去除尿素，完成复性过程，复性后样品再经过CM-Sepharase Fast Flow进一步精制，收集分子量为19kd的IL-11纯品。
实施例6、IL-11产物的鉴定SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，7TD1和B9-11细胞株MTT法测定其生物活性，比活性在8×106U/mg以上。N末端蛋白质序列分析结果除N端缺失Pro外，其余与体内天然蛋白相同，顺序是G.P.P.P.G.P.P.R.V.S.P.D.P.R.A。
实施例7、无菌过滤、分装、冻干根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂rhIL-11每支含0.75、1.5和3.0mg，缓冲体系为10mM PB,pH7.0,0.3M甘氨酸以上辅料必须符合注射用药的要求。
无菌过滤在洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。
GGT CCA CCA CCT GGT CCA CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GACGly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Ary Ala Glu Leu Asp101 AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG2 Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu20 301 AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG2 Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met40 501 AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC2 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 701 CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG2 Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys80 901 ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG2 Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu100 1101 CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG2 Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro120 1301 CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG2 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly140 150CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGALeu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu160 170表1．IL-11 cDNA及氨基酸序列(1．核苷酸序列2．氨基酸序列)
权利要求
1.一种重组人白细胞介系-11(IL-11)的制备方法，包括PCR引物设计、扩增的基因、表达质粒的构建、表达产物的纯化工艺，其特性在于(1)5′端PCR引物及扩增cDNA5′端序列为EcoRⅠ5′-CG GAATTC ATG GGT CCA CCA CCT GGT CCA CCT(2)上述IL-11 cDNA与含有PL、PR启动子的原核表达载体pBV220组装成高效表达质粒pIL-11；(3)pIL-11转化大肠杆菌，用温度诱导IL-11基因的表达，产物以包涵体形式存在工程菌内；(4)通过发酵技术扩增工程菌，用2YT作基础培养基，在表达不同时机加氮源、碳源等营养素；(5)发酵后破碎菌体，纯化包涵体并用尿素溶解变性，随后采用凝胶排阻层析和阳离子交换层析二步法纯化产品，两步之间进行分子复性。
2.根据权利要求1制备的人IL-11纯品加入甘氮酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装、冻干后制成成品，保存于2∽8℃的冷藏环境中。
3.根据权利要求1、2所述的药物制剂，可以用于治疗癌症化疗等原因引起的血小板减少症，减少出血等并发症。
全文摘要
本发明涉及一种重组人白细胞介素－11(IL一11)的制备方法。本发明利用遗传密码具有兼并性的原理,设计了大肠杆菌偏爱密码子,PCR扩增的人IL－11cDNA片段与原核表达载体如pBV220 组装成高效表达质粒pIL－11, 转化大肠杆菌后用温度诱导IL－11基因表达,表达量达菌体总量蛋白的20%。工程菌经发酵扩增,破碎后提取包涵体,包涵体经纯化后用尿素溶解变性并采用凝胶排阻层析和阳离于交换层析二步法纯化产品,两步之间进行分子复性,加保护剂后制成药用冻干制剂。该制剂可治疗癌症化疗等原因引起的血小板减少症,减少出血等并发症。
文档编号C12N15/70GK1298883SQ99125600
公开日2001年6月13日 申请日期1999年12月7日 优先权日1999年12月7日
发明者徐明波, 王勇波, 黄向东, 赵冰, 卢安京 申请人:北京双鹭药业有限责任公司