，约20°C至约30°C或约20°C至约25°C)或高温（如，约30°C 至约37°C)下。 保持步骤的持续时间取决于保持步骤进行的温度。例如，保持步骤的持续时间可通过 在高温下进行保持步骤而大量减少，其中最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳 定性的限制。保持步骤可包括将溶液维持约1小时至约1天（如，约1小时、约2小时、约 3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小 时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时）、约5小时至约 1周、约12小时至约1周（如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3 天、约4天、约5天、约6天或约7天）、约12小时至约1周（如，约12小时、约16小时、约 20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天）或约1天至约1周。 在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液在约2°C至约8°C的温度下维持至少约12小 时至长达1天的时段。 保持步骤的pH值优选为约4至约9 (如，约4. 5至约8. 5或约5至约8)。在一个实施 方案中，保持步骤的pH值范围为约5至约7. 5 (如，约5. 5至约7. 5、约6至约7. 5、约6. 5 至约7. 5、约7至约7. 5、约5至约7、约5至约6. 5、约5至约5. 5、约5. 5至约7、约6至约 6. 5或约6至约7)。例如，保持步骤的pH值可为约4、约4. 5、约5、约5. 5、约6、约6. 5、约 7、 约7. 5、约8、约8. 5或约9。 保持步骤可在细胞结合剂缀合于细胞毒性剂之前或之后进行。在一个实施方案中，保 持步骤在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之后直接进行。例如，发明方法包括在用双官能 交联剂修饰细胞结合剂之后且在缀合之前的保持步骤。在修饰细胞结合剂之后，纯化步骤 可以在保持步骤之前和/或保持步骤之后但在缀合步骤之前进行。在另一实施方案中，保 持步骤在细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之后且在纯化步骤之前直 接进行。在另一实施方案中，保持步骤在缀合步骤和纯化步骤以及随后的另外的纯化步骤 之后进行。 在特定实施方案中，保持步骤可包括在约2°C至约室温下将混合物在pH为约5-7. 5或 约6. 5-7. 5下孵育约1小时至约1周。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法， 所述方法包括加入外源性NHS。如本文所用，"外源性NHS"是指在方法期间从外源加入NHS， 并且并不指在修饰反应期间由于双功能接头的水解/氨解而产生的NHS。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法， 所述方法包括加入约〇.ImM至约300mM外源性NHS。例如，发明方法包括加入约0.ImM、 约 0? 2mM、约 0? 3mM、约 0? 4mM、约 0? 5mM、约 0? 6mM、约 0? 7mM、约 0? 8mM、约 0? 9mM、约I.OmM、 约I.ImM、约I. 3mM、约I. 5mM、约 I. 7mM、约I. 9mM、约 2. OmM、约 2.ImM、约 2. 3mM、约 2. 5mM、 约 2. 7mM、约 2. 9mM、约 3.OmM、约 3. ImM、约 3. 3mM、约 3. 5mM、约 3. 7mM、约 3. 9mM、约 4.OmM、 约 4.ImM、约 4. 3mM、约 4. 5mM、约 4. 7mM、约 4. 9mM、约 5. OmM、约 5.ImM、约 5. 3mM、约 5. 5mM、 约 5. 7mM、约 5. 9mM、约 6.OmM、约 6. ImM、约 6. 3mM、约 6. 5mM、约 6. 7mM、约 6. 9mM、约 7.OmM、 约 7.ImM、约 7. 3mM、约 7. 5mM、约 7. 7mM、约 7. 9mM、约 8. OmM、约 8.ImM、约 8. 3mM、约 8. 5mM、 约 8. 7mM、约 8. 9mM、约 9.OmM、约 9.ImM、约 9. 3mM、约 9. 5mM、约 9. 7mM、约 9. 9mM、约 10mM、 约llmM、约 12mM、约 13mM、约 14mM、约 15mM、约 16mM、约 17mM、约 18mM、约 19mM、约 20mM、 约 25mM、约 30mM、约 35mM、约 40mM、约 45mM、约 50mM、约 55mM、约 60mM、约 65mM、约 70mM、约 75mM、约 80mM、约 85mM、约 90mM、约 95mM、约lOOmM、约 110mM、约 120mM、约 130mM、约 140mM、 约 150mM、约 160mM、约 170mM、约 180mM、约 190mM、约 200mM、约 210mM、约 220mM、约 230mM、约 240mM、约 250mM、约 260mM、约 270mM、约 280mM、约 290mM或约 300mM外源性NHS。在一个实 施方案中，发明方法包括加入约〇.ImM至约5mM、约0.ImM至约10mM、约I.OmM至约5mM、约 I.OmM至约10mM、约5.OmM至约10mM、约IOmM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约 40mM、约 40mM至约 50mM、约 50mM至约 60mM、约 60mM至约 70mM、约 70mM至约 80mM、约 80mM 至约90mM、约90mM至约lOOmM、约IOOmM至约110mM、约IlOmM至约120mM、约120mM至约 130mM、约 130mM至约 140mM、约 140mM至约 150mM、约 150mM至约 160mM、约 160mM至约 170mM、 约 170mM至约 180mM、约 180mM至约 190mM、约 190mM至约 200mM、约 200mM至约 220mM、约 220mM至约240mM、约240mM至约260mM、约260mM至约280mM或约280mM至约300mM外源性 NHS。在另一实施方案中，发明方法包括加入约IOmM至约200mM、约20至约150mM、约50至 约150mM或约20至约IOOmM外源性NHS。 在一些实施方案中，发明方法包括相对于修饰反应期间由于双官能接头的水解/氨解 产生的NHS的量加入外源性NHS的摩尔比率。本领域普通技术人员可确定特定修饰期间产 生的NHS的量，因为产生的NHS的量基本上与使用的双官能交联剂的量相同。然后，技术人 员可将相对于修饰反应期间产生的NHS的量的摩尔比率的外源性NHS加入至反应混合物。 在一个实施方案中，加入相对于修饰反应期间产生的NHS的量的约2至约200倍的外源性 NHS。例如，发明方法包括加入相对于修饰反应期间产生的NHS的量的约2、约5、约10、约 15、约20、约25、约50、约100或约200倍的外源性NHS。 在一些实施方案中，发明方法包括加入相对于双官能接头的量的摩尔比率的外源性NHS。在一个实施方案中，外源性NHS与双官能交联剂的摩尔比率为约0. 5至约1000(如， 约1至约900、约5至约750、约50至约500、约100至约500、约0. 5至约500或约100至 约1000。例如，发明方法包括相对于双官能接头的量的约0. 5、约1、约2、约5、约10、约15、 约 20、约 25、约 50、约 100、约 200、约 300、约 400、约 500,约 600,约 700,约 800,约 900 或约 1000 倍NHS。 发明方法包括在制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法期间在任何点处加入外 源性NHS。例如，发明方法包括将外源性NHS加入至修饰步骤（S卩，其中细胞结合剂与双官 能接头反应的步骤）、至缀合步骤（即，其中修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反应的步骤）、 至纯化步骤或任何上述步骤之间的保持步骤。在一个实施方案中，发明方法包括将外源性 NHS加入至修饰步骤（即，将NHS加入至修饰反应）、至修饰步骤与纯化步骤之间的保持步 骤、至修饰步骤与缀合步骤之间的保持步骤、至纯化步骤、至缀合步骤、至缀合步骤与纯化 步骤之间的保持步骤和/或至两个纯化步骤之间的保持步骤。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备具有结合至其的接头的细胞结合剂的方 法，所述方法包括将细胞结合剂与双官能交联剂在存在外源性NHS的情况下接触以将接头 共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的混合物。 本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组 合物的方法，其中所述组合物大体上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供了用于制 备大体上高纯度和稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法。由于缀合物的高纯度 和稳定性，此类组合物可用于治疗疾病。包含化学偶联至细胞毒性剂，诸如类美坦素的细 胞结合剂，诸如抗体的组合物描述于例如，美国专利7, 374, 762。在本发明的一个方面，大 体上高纯度的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有一种或多种以下特征：(a)大于约90% (如，大于或等于约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)，优选地 大于约95%的缀合物物质为单体，（b)缀合物制剂或纯化的缀合物中的未缀合接头水平小 于约10% (如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)(相对于总 接头），（c)小于10%的缀合物物质交联（如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、 3%、2%、1%或0% )，（d)缀合物制剂或纯化的缀合物中的游离细胞毒性剂水平小于约 5%、小于约 3%、小于约 2% (如，小于或等于约 1. 9%、1. 8%、1. 7%、1. 6%、1. 5%、1. 4%、 I. 3%、1. 2%、1. 1%、1. 0%、0? 9%、0. 8%、0. 7%、0. 6%、0. 5%、0. 4%、0. 3%、0. 2%、0. 1% 或〇% )(相对于总细胞毒性剂），（f)缀合物制剂或纯化的缀合物中的细胞毒性二聚体物 质水平小于约5%、小于约3%、小于约2% (如，小于或等于约1. 9%、1. 8%、1. 7%、1. 6%、 1. 5 %、1. 4 %、1. 3 %、1. 2 %、1.I%、1. 0 %、0? 9 %、0? 8 %、0? 7 %、0? 6 %、0? 5 %、0? 4 %、 0.3%、0.2%、0. 1%或0%)(相对于总细胞毒性剂），和/或（e)储存时游离细胞毒性剂水 平未显著增加（如，在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、 约5个月、约6个月、约1年、约2年或约5年之后）。游离细胞毒性剂水平的"显著增加" 意指在某些储存时间之后，游离细胞毒性剂水平的增加小于约0. 1%、约0. 2%、约0. 3%、 约 0. 4 %、约 0. 5 %、约 0. 6 %、约 0. 7 %、约 0. 8 %、约 0. 9 %、约I. 0 %、约I. 1 %、约 1. 2 %、 约1. 3%、约1. 4%、约1. 5%、约1. 6%、约1. 7%、约1. 8%、约1. 9%、约2. 0%、约2. 2%、约 2. 5%、约 2. 7%、约 3. 0%、约 3. 2%、约 3. 5%、约 3. 7%或约 4. 0%。 如本文所用，术语"未缀合接头"是指与双官能交联剂共价连接的细胞结合剂，其中 细胞结合剂未通过双官能交联剂的接头共价偶联至细胞毒性剂（即，"未缀合接头"可由 CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂细 胞毒性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂）。 如本文所用，术语"细胞毒性剂二聚体"是指包含游离细胞毒性剂的二聚体，其中细胞 毒性剂未通过接头化学偶联至细胞结合剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂二聚体通过接 头彼此化学偶联（即，"细胞毒性剂二聚体"可由D-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂并且L 表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂）。在另一实施方案中，细胞毒性剂二聚体未通过接头彼此化学偶联（即， "细胞毒性剂二聚体"可由D-D表示，其中D表示细胞毒性剂。相比之下，细胞结合剂细胞毒 性剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂）。在一 个实施方案中，一些细胞毒性剂二聚体通过接头彼此化学偶联而一些细胞毒性剂二聚体未 通过接头彼此化学偶联（即，"细胞毒性剂二聚体"可由D-L-D和D-D表示，其中D表示细胞 毒性剂并且L表示双官能交联剂）。 在一个实施方案中，当接头为SMCC并且细胞毒性剂为DMl时，细胞毒性剂二聚体为DMl-DMl二聚体和DM1-MCC-DM1 二聚体。
在另一实施方案中，当接头为SPP并且细胞毒性剂为DMl时，细胞毒性剂二聚体为DMl-DMl二聚体和DM1-SPP-DM1 二聚体。
在另一实施方案中，当接头为CXl-I并且细胞毒性剂为DMl时，细胞毒性剂二聚体为DMl-DMl二聚体和DM1-CX1-1-DM1 二聚体。
如本文所用，术语"游离的细胞毒性剂"是指未通过接头化学偶联至细胞结合剂的任何 形式的细胞毒性剂（即，"游离的细胞毒性剂"可包括但不限于单独由D表示的细胞毒性剂， 由D-L表示的与接头或接头衍生物（如，水解的衍生物）偶联的细胞毒性剂以及由如上所 述的D-D和D-L-D表示的细胞毒性剂二聚体）。 在一个实施方案中，游离细胞毒性剂包括DMl、MCC-DMl、氢-SMCC-DMl、SMCC-DMl、DM1-SPP、DM1-TPA、DMl-DMl、DM1-MCC-DM1 和DM1-SPP-DM1。
在另一实施方案中，游离细胞毒性剂包括DM4、DM4-磺基-STOB、水解的DM4-磺 基-SPDB、DM4-SPY和DM4-磺基-TBA。
如本文所用，术语"细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物"是指彼此共价或非共价偶 联的两种或更多种细胞结合剂细胞毒性剂缀合物（如，通过接头共价偶联的两种或更多种 细胞结合剂细胞毒性剂缀合物）。 在一个实施方案中，细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中的细胞毒性剂与细胞结合剂的平 均摩尔比率为约1至约10、约2至约7、约3至约5、约2. 5至约4. 5(如，约2. 5、约2. 6、约 2. 7、约 2. 8、约 2. 9、约 3. 0、约 3. 1、约 3. 3、约 3. 4、约 3. 5、约 3. 6、约 3. 7、约 3. 8、约 3. 9、 约4. 0、约4. 1、约4. 2、约4. 3、约4. 4、约4. 5)、约3. 0至约4. 0、约3. 2至约4. 2、约4. 5至 5. 5 (如，约 4. 5、约 4. 6、约 4. 7、约 4. 8、约 4. 9、约 5. 0、约 5. 1、约 5. 2、约 5. 3、约 5. 4、约 5. 5)。 细胞结合剂可为结合于细胞的任何合适的试剂，所述细胞通常且优选地为动物细胞 (如，人细胞）。细胞结合剂优选地为肽或多肽或糖表位（glycotope)。合适的细胞结合剂包 括，例如，抗体（如，单克隆抗体及其片段）、干扰素（如，a、0、Y)、淋巴因子（如，白细胞 介素2 (IL-2)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素4 (IL-4)、白细胞介素6 (IL-6)、激素（如， 胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素）、MSH(促黑素细胞激素）、类固醇激素、诸如雄激素和雌 激素）、生长因子和集落刺激因子（诸如表皮生长因子（EGF)、转化生长因子a(TGF-a)、成 纤维细胞生长因子（FGF)、血管内皮生长因子（VEGF))、群落刺激因子（CSF)(诸如G-CSF、 M-CSF和GM-CSF) (Burgess,ImmunologyToday5:155-158(1984))、营养运输分子（如，转 铁蛋白）、维生素（如，叶酸）以及特异性地结合细胞表面上的靶分子的任何其它试剂或分 子。 当细胞结合剂为抗体时，它结合于抗原，所述抗原为多肽并且可以为跨膜分子（如， 受体）或配体，诸如生长因子。示例性抗原包括以下分子，诸如肾素；生长激素，包括 人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白； a-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促滤泡激素；降血钙素；促黄 体激素；胰高血糖素；凝血因子诸如因子vmc、因子IX、组织因子（TF)和血管性血友病 (vonWillebrands)因子；抗凝血因子诸如蛋白C;心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶 酶原激活物，诸如尿激酶或人尿液或组织型纤溶酶原激活物（t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造 血生长因子；肿瘤坏死因子-a和-0 ;脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和 分泌）；人体巨细胞炎性蛋白（MIP-1-a);血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；抑制穆氏 管（Muellerian)物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微 生物蛋白，诸如(6-内酰胺酶；DNA酶；IgE;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA)，诸如 CTLA-4 ;抑制素；激活素；血管内皮生长因子（VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或 D;类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子（BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5 或-6(犯'-3、犯'4、犯'-5或犯'-6)或神经生长因子诸如如?-0;血小板衍生生长因子（?〇6卩）； 成纤维细胞生长因子（FGF)诸如aFGF和bFGF;成纤维细胞生长因子受体诸如FGFR2/4和 FGFR3,表皮生长因子（EGF);转化生长因子（TGF)诸如TGF-a和TGF-P，包括TGF-0 1、 TGF-P2、TGF-P3、TGF-P4 或TGF-P5 ;胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II); des(l-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA、PSCA、 MUCl、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLRl、间皮素、cripto、 avP6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5;CD 蛋白诸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、 CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、 CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152 或公开于美国专利申请公布No. 2008/0171040 或美国专利申请公布No. 2008/0305044中结合于一种或多种肿瘤相关的抗原或细胞表面 受体的抗体，且该公开通过引用整体并入；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形 态发生蛋白（BMP);干扰素，诸如干扰素-a、和-丫 ；群落刺激因子（CSF)，如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白细胞介素（IL)，如，IL-I至IL-IO;超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面 膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸如，例如，HIV包膜部分；转运蛋白；归巢受体；地址素 (addressin);调节蛋白；整联蛋白，诸如CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和VCAM; 肿瘤相关抗原，诸如ffiR2、HER3或HER4受体；内皮因子、c-Met、IGF1R、前列腺抗原诸如 PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2 和STEAPl;LGR5、B7H4 和上面列出的多肽的任一 片段。 另外，结合于骨髓细胞的GM-CSF可用作急性髓性白血病患病细胞的细胞结合剂。结合 于活化T细胞的IL-2可用于预防移植排斥、用于治疗和预防移植物抗宿主病和用于治疗急 性T细胞白血病。结合于黑素细胞的MSH可用于治疗黑素瘤，可以是针对黑素瘤的抗体。叶 酸可用于靶向在卵巢和其它肿瘤中表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞癌，诸如 肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向神经母细胞瘤和其它肿瘤类型。 可分别成功地用雌激素（或雌激素类似物）或雄激素（或雄激素类似物）作为细胞结 合剂来靶向乳腺癌和睾丸癌。 如本文所用，术语"抗体"是指任何免疫球蛋白，任何免疫球蛋白片段，诸 如Fab、Fab'、F(ab'）2、dsFv、sFv、微型抗体、二聚体、三聚体、四聚体（?31^111，]\ Immunol. 131:2895-2902(1983)!Spring等人J.Immunol. 113:470-478(1974);Nisonoff 等?Arch.Biochem.Biophys. 89:230-244 (1960)，Kim等，Mol.CancerTher.，7:2486-2497 ( 2008) ,Carter,NatureRevs. ,6:343-357(2006))或免疫球蛋白嵌合体，其可结合于细胞表 面的抗原（如，其含有互补决定区（CDR))。任何合适的抗体可用作细胞结合剂。本领域普 通技术人员将理解选择适当的抗体将取决于待靶向的细胞群体。在这方面，在特定细胞群 体（通常且优选为患病细胞群体）中选择性表达的细胞表面分子（即，抗原）的类型和数目 将决定用于本发明组合物的适当抗体的选择。细胞表面表达概况对多种细胞类型（包括肿 瘤细胞类型）为已知的，或，如果未知，则可使用常规的分子生物学和组织化学技术确定。 抗体可为多克隆或单克隆的，但是最优选为单克隆抗体。如本文所用，"多克隆"抗体 是指抗体分